CC BY
87
биохимия
© МИХАЙЛЕНКО Д.С., КУШЛИНСКИЙ Н.Е., 2016 УДК 616.62-006.04-07
Михайленко Д.С.1, 2, Кушлинский Н.Е.3
соматические мутации и аберрантное метилирование - потенциальные генетические маркеры рака мочевого пузыря
1НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина - филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, 105425, Москва, Российская Федерация; 2ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», 115478, Москва, Российская Федерация; 3ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Российская Федерация
Ежегодно в мире регистрируют более 330 тыс. случаев рака мочевого пузыря (РМП), представляющего собой актуальную проблему в современной онкологии. Остаются востребованными поиск и характеристика новых молекулярных маркеров РМП, выявляемых в опухолевых клетках из осадка мочи и обладающих высокой диагностической точностью. Исследования последних 10 лет, особенно с применением методов полногеномного секвенирования, позволили получить большое количество экспериментальных данных о возникновении и прогрессии РМП. В обзоре проведен систематический анализ литературы, доступной в базе данных PubMed преимущественно за последние 5 лет. Были рассмотрены как оригинальные исследования молекулярно-генетических нарушений при РМП, так и метаанализы. Это позволило выявить наиболее характерные локальные изменения ДНК при РМП, которые могут быть определены рутинными генетическими методами в различном клиническом материале и представляют потенциальный интерес для разработки тест-систем. Молекулярно-генетическими маркерами заболевания могут быть активирующие миссенс-мутации в 7-м и 10-м экзонах гена рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3), 9-м и 20-м экзонах гена фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат-3-киназы (PIK3CA) и мутации в -124 и -146 нуклеотидах в промоторе гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT). Создание тест-систем на основе аберрантного метилирования CpG-островков генов-супрессоров пока представляется более трудной задачей из-за различий в паттерне метилирования разных первичных опухолей на различных стадиях клональной эволюции РМП, хотя они могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров.
Ключевые слова: соматическая мутация; метилирование ДНК; рак мочевого пузыря.
Для цитирования: Михайленко Д.С., Кушлинский Н.Е. Соматические мутации и абберантное метилирование - потенциальные генетические маркеры рака мочевого пузыря. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (2): 78-83. DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-2-78-83. Mikhailenko D.S.12, Kushlinskii N.E.3
THE SOMATIC MUTATIONS AND ABERRANT METHYLATION AS POTENTIAL GENETIC MARKERS OF URINARY BLADDER CANCER
1The N.A. Lopatkin research institute of urology and interventional radiology - branch of "The National medical research center" of Minzdrav of Russia, 105425 Moscow, Russia; 2The medical genetic scientific center, 115478 Moscow, Russia; 3The N.N. Blokhin Russian oncologic scientific center of Minzdrav of Russia, 115478 Moscow, Russia
All around the world, more than 330 thousands cases of bladder cancer are registered annually hence representing actual problem of modern oncology. Still in demand are search and characteristic of new molecular markers of bladder cancer detecting in tumor cells from urinary sediment and having high diagnostic accuracy. The studies of last decade, especially using methods of genome-wide sequencing, permitted to receive a large amount of experimental data concerning development and progression of bladder cancer. The review presents systematic analysis of publications available in PubMed data base mainly of last five years. The original studies of molecular genetic disorders under bladder cancer andmeta-analyzes were considered. This approach permitted to detected the most common local alterations of DNA under bladder cancer which can be detected using routine genetic methods indifferent clinical material and present prospective interest for development of test-systems. The molecular genetic markers of disease can be activating missense mutations in 7 and 10 exons of gene of receptor of growth factor of fibroblasts 3 (FGFR3), 9 and 20 exons of gene of Phosphatidylinositol-4,5-bi-phosphate-3-kinase (PIK3CA) and mutation in -124 and -146 nucleotides in promoter of gene of catalytic subunit telomerase (TERT). The development of test0systems on the basis of aberrant methylation of CpG-islets of genes-suppressors still is seemed as a difficult task because of differences in pattern of methylation of different primary tumors at various stages of clonal evolution of bladder cancer though they can be considered as potential markers.
Keywords: somatic mutation; DNA methylation; bladder cancer.
For citation: Mikhailenko D.S., Kushlinskii N.E. The somatic mutations and aberrant methylation as potential genetic markers of urinary bladder cancer. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2016; 61 (2): 78-83. (in Russ.)
DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-2-78-83.
For correspondence: Mikhailenko D.S., candidate of medical sciences, leading research worker of department of pathologic anatomy with group of molecular genetics of the National medical research center" of Minzdrav of Russia, e-mail: dimserg@mail.ru
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
financing. The study had no sponsor support.
Received 01.10.15 Accepted 15.12.15
Для корреспонденции: Михайленко Дмитрий Сергеевич, канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник отдела патологической анатомии с группой молекулярной генетики НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина - филиала ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, тел. +7 (903)711-81-13, e-mail: dimserg@mail.ru
biochemistry
Молекулярно-генетические механизмы развития РМП. Ежегодно в мире регистрируют более 330 тыс. случаев рака мочевого пузыря (РМП), представляющего собой актуальную проблему в современной онкологии [1]. Исследования последних 10 лет, особенно с применением методов полногеномного секвенирования, позволили получить большое количество экспериментальных данных о возникновении и прогрессии РМП. При обобщении этих результатов стало ясно, что первичный РМП может развиваться по двум взаимоисключающим механизмам с морфологически разными предраковыми изменениями. Поверхностный РМП проходит через стадию гиперплазии, основными событиями которой становятся активирующие точковые мутации в генах FGFR3, PIK3CA, ERBB2, HRAS и других, при этом, как правило, ген ТР53 не несет мутаций. Ин-вазивный РМП проходит через стадии дисплазии/карциномы in situ (CIS), при которых наблюдают мутации в генах, ответственных за два важных механизма поддержания целостности генома. Во-первых, мутации в генах TP53, RB1 снижают эффективность негативной регуляции клеточного цикла и ухода клетки в апоптоз при структурных хромосомных нарушениях. Во-вторых, точковые мутации в генах ремоделинга хроматина UTX, KDM6A, ARID1A и других нарушают адекватную упаковку хроматина, способствуют появлению гипермутабельных сайтов и повышают вероятность хромосомных аберраций. Далее на стадии CIS и первичной опухоли происходят множественные одновременные хромосомные аберрации (так называемый хромотрипсис), результатом которых являются делеции районов локализации опухолевых супрессоров, амплификация онкогенов, что с последующей клональной селекцией приводит к появлению опухоли с мышечно-инвазивным фенотипом [2, 3]. При этом некоторые мутации, например в гене TERT, встречаются при разных формах РМП одинаково часто [4]. Прогрессия и/или рецидивирование поверхностного РМП сопровождается приобретением аберраций, наиболее характерных для инвазив-ного РМП (мутации ТР53, делеции ряда локусов) и переходом в мышечно-инвазивную форму. Дальнейшая прогрессия инва-зивной опухоли и ее метастазирование идут по путям, общим с другими малигнизированными опухолями: приобретение дополнительных мутаций, в том числе обеспечивающих резистентность к проводимой химиотерапии, клональная эволюция опухоли с преобладанием более злокачественных субклонов [5-7]. С приобретением структурных нарушений в геномной ДНК неразрывно связаны эпигеномные изменения, особенно аберрантное гиперметилирование 5'-регуляторных районов генов-супрессоров. В норме 80-90% CpG-динуклеотидов в геноме метилированы. Оставшиеся неметилированные CpG-динуклеотиды образуют скопления в промоторе или первом ин-троне некоторых структурных генов - CpG-островки (участок более 500 п.н. с содержанием G/C более 55% и отношением наблюдаемого количества CpG к ожидаемому не менее 0,65). На начальных этапах канцерогенеза происходит тотальное гипоме-тилирование генома, что может привести к активации онкогенов и мобильных элементов, и локальное гиперметилирование генов - супрессоров опухолевого роста, сопровождающиеся их инактивацией [8]. Для практической медицины результаты геномных и эпигеномных исследований имеют большое значение. Определены гены, точковые мутации в которых (FGFR3, PIK3CA и TERT) и аберрантное метилирование (RASSF1, APC, SFRP2, RUNX3, RARB2 и другие) происходят при РМП наиболее часто. С учетом широких возможностей анализа точковых изменений ДНК в гетерогенном материале, которые предоставляет современная молекулярная генетика, это открывает перспективу разработки относительно простых и дешевых тест-систем для диагностики РМП по осадку мочи.
Частые соматические мутации в осадке мочи при РМП. В настоящее время идентифицированы сотни мутаций, задействованных в канцерогенезе РМП. Среди этого много-
образия можно выделить точковые мутации, в основном однонуклеотидные замены, которые встречаются с частотой более 10% в первичных опухолях, локализованы в «горячих точках» мутагенеза нескольких ключевых онкогенов, могут быть выявлены рутинными молекулярно-генетическими методами в клетках из осадка мочи и поэтому рассматриваются как потенциальные диагностические маркеры РМП.
Мутации в гене FGFR3. Ген РОРЯЗ локализован в области 4р16.3, содержит 19 экзонов, из которых в образовании полноразмерного транскрипта участвуют экзоны 2-18 [9]. По различным данным, от 50 до 80% первичного поверхностного РМП несут мутации РОРЯЗ, тогда как в инвазивных опухолях и их метастазах эта частота составляет около 10% [2, 10]. Ген РОРЯЗ принадлежит к семейству генов трансмембранных рецепторов РОРЮ-4, которые кодируют гликопротеины - рецепторы фактора роста фибробластов (РОР). Рецептор состоит из трех иммуноглобулиноподобных (Щ доменов, обращенных в цитоплазму и связывающихся с сильным митогеном РОР1/2, трансмембранного домена и внутриклеточного тирозинкиназ-ного домена, взаимодействующего со вторичными мессендже-рами. После связывания с лигандом рецептор димеризуется и активирует тирозинкиназный домен. РОРЯЗ задействован в Р1К3СА/АКТ1 сигнальном пути. Тканеспецифичные формы рецептора (эпителиальная или мезенхимальная) формируются за счет альтернативного сплайсинга третьего ^-подобного домена. Почти все описанные миссенс-мутации находятся между ^-подобными доменами или в трансмембранном до-
Структура FGFR3 и локализация в нем миссенс-мутаций при РМП
Домен lg-1
Домен lg-ll Экзон 7 -j Домен lg-lll
Трансмембранный домен _ „„, Экзон 101
}| Мутации R248C (8%), R249C (63%) |
Внеклеточная среда
| Мутации G372C (6%), S373C(1%), Р Y375C (15%), G382P/R (3%), А393Е (2%) | ' Плазматическая мембрана
Цитоплазма
Тирозинкиназный домен
Мутации K652E/M/Q/T (2%)
Структура FGFR3 и локализация в нем миссенс-мутаций при РМП (объяснение в тексте).
биохимия
мене, способствуя димеризации и конститутивной активации FGFR3 по механизму образования дисульфидных мостиков или иных прочных взаимодействий (см. рисунок). Локализация «горячих точек» - экзон 7 (кодоны 248 и 249) и экзон 10 (кодоны 373 и 375) [2, 11-13]. Опухолевые клетки при поверхностном РМП слущиваются в полость мочевого пузыря и присутствуют в осадке мочи в концентрациях, различающихся на порядки. Показано, что для выявления соматических мутаций FGFR3 как маркеров РМП в первичной диагностике заболевания в осадке мочи целесообразно применять тест-системы, предусматривающие использование метода ПЦР в реальном времени или ПЦР с последующим минисеквенированием [12, 14]. Определение специфичных для поверхностного РМП мутаций актуально не только при диагностике первичного РМП, но и даже в большей степени при мониторинге рецидива опухоли. После удаления первичного поверхностного рака необходимо регулярно проводить цистоскопию, так как в 70% случаев в последующие годы развивается рецидив РМП. Проведение цистоскопии сопряжено со значительным дискомфортом для пациента, и анализ соматических мутаций в осадке мочи мог бы использоваться как критерий отбора пациентов для проведения этой диагностической процедуры. Клиническая чувствительность вывления первичного поверхностного РМП по мутациям FGFR3 в осадке мочи превышает 80%, что позволяет рассматривать их как компоненты эффективного диагностического теста, однако она снижается до 58% при обнаружении небольших локальных рецидивов [15, 16]. Проблему выявления соматических мутаций при низком содержании мутантных аллелей FGFR3 на фоне избытка нормальной ДНК в образце пытались решить с помощью глубокого таргетного ресеквенирования на одной из платформ секвенирования следующего поколения (NGS - next generation sequencing). Этот метод позволил выявить мутации FGFR3 при доле мутантных аллелей, равной 0,02%. Однако в этом случае возникает вопрос о клинической значимости мутаций в сотых долях процента от общего пула исследованных клеток, так как соматические мутации FGFR3 могут возникнуть еще на стадии предраковых изменений до морфологически сформированной опухоли [17]. Анализ мутаций FGFR3 при мониторинге рецидива РМП может быть дополнен определением генов, которые часто и с высокой специфичностью подвергаются аберрантному гиперметилированию в этих опухолях. Например, комбинированное определение статуса метилирования генов OTX1, ONECUT2, OSR1 и мутаций FGFR3 в осадке мочи позволило достичь клинической чувствительности 79% при специфичности 90% (PPV 92%, NPV 76%, AUC при проведении ROC-анализа 0,886), тогда как только для гена FGFR3 или при цистоскопии чувствительность составила 50-60% [18]. Схожие результаты были получены ранее другими авторами при комбинировании мутаций FGFR3 с метилированием генов-супрессоров APc, RASSF1 и SFRP2 [19]. Если рассматривать мутации FGFR3 не только с диагностической, но и с прогностической точки зрения, то по данным метаанализа и обзоров активирующие точковые мутации FGFR3 ассоциированы с поверхностным РМП, ранней стадией заболевания, высоко- и умереннодиф-ференцированной уротелиальной карциномой, относительно благоприятным прогнозом при оценке выживаемости пациентов с РМП [12, 20]. Следует отметить, что при низкой частоте встречаемости мутаций FGFR3 при мышечно-инвазивном РМП, гиперэкспрессия этого гена наблюдается в 40% этих опухолей, а в 5% уротелиального рака и некоторых клеточных линиях РМП при отсутствии точковых мутаций FGFR3 выявлены химерные онкогены FGFR3 :TACC3 и FGFR3 :BAIAP2L 1 с точками разрыва в 18-м интроне FGFR3 [21]. Это указывает на более значительную роль конститутивной активации FG-FR3 при РМП в целом, чем значение онкогенного потенциала частых точковых мутаций при поверхностном РМП.
Мутации в гене PIK3CA. Ген PIK3CA кодирует фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат-3-киназу - важное звено в сигнальном пути PIK3CA/AKT1/mTOR, в котором задействован также описанный выше продукт гена FGFR3. Миссенс-мутации PIK3CA встречаются в 15-25% случаев поверхностного РМП и значительно реже при инвазивном РМП. Они локализуются в основном в спиральном домене (Е542К и Е545К) и киназном домене (H1047R). Зачастую мутации сопряжены с потерей гетерозиготности (LOH - loss of heterozygosity, или аллельными делециями) гена PTEN, продукт которого инги-бирует сигнальный путь PIK3CA/AKT/mTOR. Хотя мутации в указанных доменах обладают сходным трансформирующим эффектом в клеточных линиях, отношение частоты мутаций в киназном и спиральном доменах варьирует в зависимости от типа опухоли: от 0,29 в РМП до 2 в раке эндометрия, что указывает на возможные различия в механизмах активации сигнального пути PIK3CA/AKT/mTOR [22]. В опухолях других типов преобладают мутации Е542К и Е545К, тогда как в уротелиаль-ной карциноме чаще встречаются мутации в киназном домене [23]. Мутации FGFR3 и PIK3CA происходят независимо друг от друга, и около 20% поверхностного РМП с мутациями хотя бы в одном из этих генов несут их сочетание. Предполагают, что мутации FGFR3 и PIK3CA в одной опухолевой клетке могут потенциировать действие друг друга [12]. Поскольку миссенс-мутации PIK3CA являются вторыми по частоте точ-ковыми мутациями, специфичными для поверхностного РМП, их можно рассматривать как компонент системы маркеров для неинвазивной ДНК-диагностики этого заболевания.
Мутации в гене TERT. В норме при митозе происходит укорочение длины концов хромосом из-за недорепликации теломерных последовательностей ДНК, за исключением клеток зародышевой линии, в которых репликация теломерных повторов ДНК обеспечивается РНК-содержащим ферментом теломеразой. Большая субъединица теломеразы кодируется геном TERT, который подвергается сайленсингу в дифференцированных клетках, в том числе в эпителиальных клетках мочевого пузыря, активен он только в предшественниках половых клеток. Аберрантная реактивация TERT наблюдается в 90% злокачественных новообразований, помогая опухолевым клеткам преодолеть лимит делений, обусловленный критическим укорочением длины теломер. Механизмы гиперэкспрессии TERT в опухолях могут быть различными, в том числе связанными с мутациями этого гена [24]. При РМП описаны мутации в позициях -124G/A и -146G/A от инициирующего кодона ATG, которые приводят к возникновению новых сайтов связывания транскрипционных факторов семейства ETS и многократному усилению экспрессии гена TERT [25]. Кроме РМП, точковые активирующие мутации в промоторе TERT встречаются в 71% меланом, 47% гепатоцеллюлярных карцином, 8% рака почки, встречаются также в липосаркоме, олиго-денроглиоме, глиобластоме и отсутствует при раке простаты, колоректальном раке [26-29]. Это в очередной раз указывает на генетическую гетерогенность опухолей, в том числе в пределах онкоурологических локализаций. В качестве метода определения мутаций -124G/A и -146G/A большинство авторов применяют мультиплексную ПЦР с последующим мини-секвенированием (реакцией удлинения внутреннего прайме-ра, SNaPshot), ряд авторов используют аллельспецифичную ПЦР с TaqMan-зондами. Мутация -124G/A является наиболее частой (40-60% случаев), затем следует мутация -146G/A (1013% случаев), в единичных образцах РМП встречаются мутации в близлежащих нуклеотидах или минорные мутации в тех же позициях: -124G/T, -138G/A, -141С/А и другие [29-31]. Мутации в промоторе TERT рассматривают как инициирующие мутации-драйверы, они встречаются на ранних этапах развития РМП, не различаются по частоте между поверхностными и мышечно-инвазивными опухолями, не ассоциированы
с прогностическими характеристиками заболевания. Частота мутаций TERT составляет около 70% в первичных опухолях, что делает их перспективной мишенью для диагностики наравне с мутациями FGFR3. Аналитическая чувствительность определения мутаций в промоторе TERT находится в пределах 60-90% в зависимости от методов, применяемых разными исследователями [31-33]. Клиническая чувствительность выявления мутаций TERT в осадке мочи варьирует в пределах 5060% при определении первичного РМП, что несколько выше, чем у мутаций FGFR3, при выявлении локального рецидива чувствительность снижается до 46%. Однако специфичность мутаций в промоторе TERT существенно меньше, чем у мутаций FGFR3, - 89% при сравнении со здоровым контролем и 74% при определении рецидива РМП [4]. К тому же эти мутации происходят примерно с той же частотой уже на стадии предраковых изменений - гиперплазии и дисплазии, что позволяет рассматривать их как ранние скрининговые маркеры, но делает невозможным диагностику РМП по осадку мочи только на основании наличия мутации TERT [32]. В связи с описанными выше данными о частых мутациях при РМП нарушения в генах FGFR3, PIK3CA и TERT целесообразно объединить в одну систему точковых соматических мутаций, характерных для РМП.
Метилирование генов-супрессоров при РМП в осадке мочи. Одним из наиболее частых механизмов инактивации генов-супрессоров в процессе канцерогенеза является локальное гиперметилирование их 5'-регуляторных областей. Для практической онкогенетики имеет значение то, что аберрантное гиперметилирование тех или иных сайтов ДНК выявлено при всех типах онкоурологических заболеваний и может быть определено в клинических образцах c помощью молекулярно-генетических методов [8]. По данным оригинальных работ и метаанализов, наиболее часто при РМП гиперметилированию относительно нормальной ткани подвергаются гены CDH1 (40-60%), RASSF1 (40-82%), APC (50-90%), MGMT (80-95%), RARB2 (до 87%), BCL2 (45-65%), SFRP2 (около 50% случаев) и некоторые другие [34-36]. Спектр аберрантно метилированных генов при РМП и других опухолях частично перекрывается, однако имеет свои особенности. Сочетание нескольких наиболее часто и специфично метилированных генов при РМП многими исследователями рассматривается как основа для разработки тест-систем для неинвазивной диагностики заболевания по ДНК, выделенной из осадка мочи, с помощью метилспецифической ПЦР в реальном времени или MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification). Так, тестирование одной из панелей аберрантно метилированных генов показало чувствительность 87% и специфичность, близкую к 99% при исследовании осадков мочи [8, 37]. Вместе с тем, каждая из прикладных исследовательских работ в этой области в результате приводит к выбору собственной оптимальной панели дифференциально метилированных локусов. В ряде случаев гены-кандидаты для последующей валидации выбирали исходя из ранее опубликованных статей. В частности, в одной из работ панель включала гены RARB2 и АРС [38], в другой - BCL2, CDKN2A и NID2 (относительно высокие чувствительность и специфичность в интервале 80-87%) [37], в третьей - АРС, TERT, EDNRB (чувствительность не превышала 72%) [39], в четвертой из 18 генов-кандидатов была сформирована панель, включающая гены RUNX3, CCND2, ID4, BNIP3 и SCGB3A1 [40]. Однако воспроизводимость этих результатов оказалась невысокой как в количественной оценке чувствительности и специфичности, так и в доказательствах целесообразности конкретных комбинаций генов-супрессоров. Это наглядно продемонстрировано, в частности, в ходе мультицентровых исследований комбинации генов NID2 и TWIST как маркеров метилирования при диагностике РМП по осадку мочи. В оригинальной работе были заявлены
biochemistry
чувствительность и специфичность 85% для комбинации ло-кусов при диагностике высокодифференцированного РМП и более 90% для РМП в целом [41]. Но в дальнейшем эти значения не подтвердились и было рекомендовано отказаться от разработки тест-системы только на основе указанных генов [42, 43]. В некоторых работах исследователи сначала провели собственный экспериментальный поиск дифференциально метилированных локусов в опухоли и нормальном уротелии с помощью современных полногеномных методов анализа, после чего валидировали частоты метилирования нескольких генов-кандидатов на расширенной выборке осадков мочи от пациентов с РМП. Например, 56 образцов РМП и контролей были проанализированы с помощью микрочипа Infinium Bead Chip (Illumina), что позволило установить статус метилирования 27578 локусов. Затем выбраны наиболее часто и специфично метилированные гены СА3, НОХА9, ZNF154, POU4F2, EOMES, ACOT11, PCDHGA12, PTGDR. После этого проанализированы 115 образцов мочи больных РМП и 59 контролей, чувствительность и специфичность комбинации перечисленных выше генов составили 84 и 96% соответственно [44]. В схожем исследовании на первом этапе был изучен метилом 6 клеточных линий РМП, выбраны гены-кандидаты (CA10, SOX11, MY03A, PENK, NKX6-2, DBC1), которые впоследствии проанализированы в 128 осадках мочи больных РМП; чувствительность и специфичность при этом составили 81 и 97% соответственно [45]. В 2014 г. метаанализ 24 оригинальных исследований типа случай-контроль по метилированию генов-кандидатов в осадке мочи показал, что системы из нескольких метилированных локусов характеризуются довольно высокой диагностической точностью: показатель AUC при ROC-анализе в среднем составил 0,89. Вместе с тем каждое исследование применяло разную комбинацию генов и различные методические особенности определения статуса метилирования конкретных CpG-островков [46]. Паттерн метилирования также ассоциирован с прогностическими характеристиками опухоли. Например, риск рецидива поверхностного РМП возрастает в ряду pTa - pT 1/высокодифференцированная опухоль - рТ1/низкодифференцированная опухоль. Показано, что каждой из этих патоморфологических характеристик соответствует определенный паттерн метилированных локусов из исследованных генов RARB, CD44, PAX5A, GSTP1, IGSF4, PYCARD, CDH13, TP53, GATA5, CHFR и STK11 [47]. Реализуя иной способ выбора генов-кандидатов, другими авторами были показаны ассоциации метилирования со стадией заболевания (RUNX3, TWIST1, SFRP4, CCND2), рецидивом (DLC1, SFRP5, H2AFX, CACNA1G), общей и специфичной выживаемостью (PRDM2, DLC1, SFRP5, CACNA1G, TIMP3) [48]. Частота метилирования RUNX3 выше у пожилых пациентов и у курильщиков, чем в среднем при РМП. Опубликованы и другие работы, посвященные анализу диагностической и прогностической ценности метилирования ДНК при РМП, каждая из которых приводит к собственному списку маркеров [8, 49]. В последние годы в результате проведения полногеномного бисульфитного секвенирования на платформах NGS показано, что клональная эволюция РМП сопровождается переходом от одного паттерна аберрантного метилирования к другому по мере прогрессии опухоли аналогично тому, как это происходит с точковыми мутациями. Внутри РМП одной стадии в составе одной опухоли можно выделить клоны с различным паттерном метилирования [49, 50]. Возможно, именно это приводит к значительным различиям в наборе дифференциально мети-лированых локусов в разных поисковых работах и выраженным межиндивидуальным различиям частоты метилирования генов-супрессоров у больных РМП. Анализ метилирования генов-супрессоров пока не имеет широкого использования в лабораторной диагностике вследствие различий в методических подходах при анализе метилирования ДНК, разных ком-
биохимия
бинаций метилированных локусов и как следствие невысокой воспроизводимости. Тем не менее, при решении указанных проблем в ходе дальнейших прикладных исследований анализ аберрантно метилированных локусов можно рассматривать в перспективе как дополнительный инструмент в неинвазивной диагностике онкоурологических заболеваний.
Заключение. В настоящее время для неинвазивной лабораторной диагностики РМП применяют рутинный цитологический анализ мочи (его чувствительность ниже 50% при диагностике небольших высокодифференцированных опухолей). FISH-анализ осадка мочи (зонды на хромосомы 3, 7, 17 и 9р21), иммуноферментный анализ на UBC-антиген (цитокератины 8 и 18) или NMP22 с чувствительностью и специфичностью, близкими к 80-90%, пока не имеют широкого применения в клинике. Остается актуальной проблема поиска и характеристики новых молекулярных маркеров РМП, выявляемых в опухолевых клетках из осадка мочи и обладающих высокой диагностической точностью. Такими молекулярно-генетическими маркерами могут быть активирующие миссенс-мутации в 7-м и 10-м экзонах гена рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3), 9-м и 20-м экзонах гена фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат-3-киназы (PIK3CA) и мутации в -124-м и -146-м нуклеотидах в промоторе гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT). Создание тест-систем на основе аберрантного метилирования CpG-островков генов-супрессоров пока представляется более трудной задачей из-за различий в паттерне метилирования разных первичных опухолей на различных стадиях клональной эволюции РМП, хотя они могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров. Таким образом, на основе определения точковых мутаций и в перспективе нескольких наиболее оптимальных панелей метилированных генов могут быть разработаны тест-системы для неинвазивной ДНК-диагностики РМП и его рецидива по осадку мочи.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
^HTEPATyPA/REFERENCES
1. Ferlay J., Soeijomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M. et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J Cancer. 2015; 136 (5): E359-86.
2. Knowles M.A., Hurst C.D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nat. Rev. Cancer. 2015; 15 (1): 25-41.
3. Morrison C.D., Liu P., Woloszynska-Read A., Zhang J., Luo W., Qin M. et al. Whole-genome sequencing identifies genomic heterogeneity at a nucleotide and chromosomal level in bladder cancer. proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111 (6): E672-81.
4. Allory Y., Beukers W., Sagrera A., Flandez M., Marques M., van der Keur K.A. et al. Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in bladder cancer: high frequency across stages, detection in urine, and lack of association with outcome. Eur. Urol. 2014; 65 (2): 360-6.
5. Warrick J.I., Hovelson D.H., Amin A., Liu C.J., Cani A.K., McDaniel A.S. et al. Tumor evolution and progression in multifocal and paired non-invasive/invasive urothelial carcinoma. Virchows Arch. 2014; 466 (3): 297-311.
6. Kim P.H., Cha E.K., Sfakianos J.P., Iyer G., Zabor E.C., Scott S.N. et al. Genomic predictors of survival in patients with high-grade urothelial carcinoma of the bladder. Eur. Urol. 2015; 67 (2): 198-201.
7. Iyer G., Al-Ahmadie H., Schultz N., Hanrahan A.J., Ostrovnaya I., Balar A.V. et al. Prevalence and co-occurrence of actionable genomic alterations in high-grade bladder cancer. J. Clin. Oncol. 2013; 31 (25): 3133-40.
8. Besaratinia A., Cockburn M., Tommasi S. Alterations of DNA methy-lome in human bladder cancer. Epigenetics. 2013; 8 (10): 1013-22.
9. Pandith A.A., Zhah Z.A., Siddiqi M.A. Oncogenic role of fibroblast growth factor receptor 3 in tumorigenesis of urinary bladder cancer. Urol. Oncol. 2013; 31 (4): 398-406.
10. Guancial E.A., Werner L., Bellmunt J., Bamias A., Choueiri T.K.,
Ross R. et al. FGFR3 expression in primary and metastatic urothelial carcinoma of the bladder. Cancer Med. 2014; 3 (4): 835-44.
11. Dodurga Y., Tataroglu C., Kesen Z., Satiroglu-Tufan N.L. Incidence of fibroblast growth factor receptor 3 gene (FGFR3) A248C, S249C, G372C, and T375C mutations in bladder cancer. Genet. Mol. Res. 2011; 10 (1): 86-95.
12. Iyer G., Milowsky M.I. Fibroblast growth factor receptor-3 in urothelial tumorigenesis. Urol. Oncol. 2013; 31 (3): 303-11.
13. Juanpere N., Agell L., Lorenzo M., de Muga S., Lopez-Vilaro L., Murillo R. et al. Mutations in FGFR3 and PIK3CA, singly or combined with RAS and AKT1, are associated with AKT but not with MAPK pathway activation in urothelial bladder cancer. Hum. Pathol. 2012; 43 (10): 1573-82.
14. Silverberg D.M. Urothelial carcinoma of the upper urinary tract diagnosed via FGFR3 mutation detection in urine: a case report. BMC Urol. 2012; 12: 20.
15. Zuiverloon T.C., van der Aa M.N., van der Kwast T.H., Steyerberg E.W., Lingsma H.F., Bangma C.H. et al. Fibroblast growth factor receptor 3 mutation analysis on voided urine for surveillance of patients with low-grade non-muscle-invasive bladder cancer. Clin. Cancer Res. 2010; 16 (11): 3011-8.
16. Zuiverloon T.C., Tjin S.S., Busstra M., Bangma C.H., Boeve E.R., Zwarthoff E.C. Optimization of nonmuscle invasive bladder cancer recurrence detection using a urine based FGFR3 mutation assay. J. Urol. 2011; 186 (2): 707-12.
17. Millholland J.M., Li S., Fernandez C.A., Shuber A.P. Detection of low frequency FGFR3 mutations in the urine of bladder cancer patients using next-generation deep sequencing. Res. Rep. Urol. 2012; 4: 33-40.
18. Kandimalla R., Masius R., Beukers W., Bangma C.H., Omtoft T.F., Dyrskjot L. et al. A 3-plex methylation assay combined with the FG-FR3 mutation assay sensitively detects recurrent bladder cancer in voided urine. Clin. Cancer Res. 2013; 19 (17): 4760-9.
19. Serizawa R.R., Ralfkiaer U., Steven K., Lam G.W., Schmiedel S., Schuz J. et al. Integrated genetic and epigenetic analysis of bladder cancer reveals an additive diagnostic value of FGFR3 mutations and hypermethylation events. Int. J. Cancer. 2011; 129 (1): 78-87.
20. Liu X., Zhang W., Geng D., He J., Zhao Y., Yu L. Clinical significance of fibroblast growth factor receptor-3 mutations in bladder cancer: a systematic review and meta-analysis. Genet. Mol. Res. 2014; 13 (1): 1109-20.
21. Williams S.V., Hurst C.D., Knowles M.A. Oncogenic FGFR3 gene fusions in bladder cancer. Hum. Mol. Genet. 2013; 22 (4): 795-803.
22. Ross R.L., Askham J.M., Knowles M.A. PIK3CA mutation spectrum in urothelial carcinoma reflects cell context-dependent signaling and phenotypic outputs. Oncogene. 2013; 32: 768-76.
23. Millis S.Z., Bryant D., Basu G., Bender R., Vranic S., Gatalica Z. et al. Molecular profiling of infiltrating urothelial carcinoma of bladder and nonbladder origin. Clin. Genitourin. Cancer. 2015; 13 (1): e37-49.
24. Baird D.M. Variation at the TERT locus and predisposition for cancer. Expert Rev. Mol. Med. 2010; 12: e16.
25. Borah S., Xi L., Zaug A.J., Powell N.M., Dancik G.M., Cohen S.B. et al. TERT promoter mutations and telomerase reactivation in urothelial cancer. Science. 2015; 347 (6225): 1006-10.
26. Huang F.W., Hodis E., Xu M.J., Kryukov G.V., Chin L., Garraway L.A. Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma. Science. 2013; 339 (6122): 957-9.
27. Quaas A., Oldopp T., Tharun L., Klingenfeld C., Krech T., Sauter G. et al. Frequency of TERT promoter mutations in primary tumors of the liver. Virchows Arch. 2014; 465 (6): 673-7.
28. Stoehr R., Taubert H., Zinnall U., Giedl J., Gaisa N.T., Burger M. et al. Frequency of TERT promoter mutations in prostate cancer. Patho-biology. 2015; 82 (2): 53-7.
29. Wu S., Huang P., Li C., Huang Y., Li X., Wang Y. et al. Telomerase reverse transcriptase gene promoter mutations help discern the origin of urogenital tumors: a genomic and molecular study. Eur. Urol. 2014; 65 (2): 274-7.
30. Hurst C.D., Platt F.M., Knowles M.A. Comprehensive mutation analysis of the TERT promoter in bladder cancer and detection of mutations in voided urine. Eur. Urol. 2014; 65 (2): 367-9.
31. Wang K., Liu T., Ge N., Liu L., Yuan X., Liu J. et al. TERT promoter mutations are associated with distant metastases in upper tract urothelial carcinomas and serve as urinary biomarkers detected by a sensitive castPCR. Oncotarget. 2014; 5 (23): 12428-39.
32. Kinde I., Munari E., Faraj S.F., Hruban R.H., Schoenberg M., Biva-lacqua T. et al. TERT promoter mutations occur early in urothelial neoplasia and are biomarkers of early disease and disease recurrence in urine. Cancer Res. 2013; 73 (24): 7162-7.
33. Wang K., Liu T., Liu C., Meng Y., Yuan X., Liu L. et al. TERT promoter mutations and TERT mRNA but not FGFR3 mutations are
urinary biomarkers in Han Chinese patients with urothelial bladder cancer. Oncologist. 2015; 20: 263-9.
34. Li G., Liu Y., Yin H., Zhang X., Mo X., Tang J. et al. E-cadherin gene promoter hypermethylation may contribute to the risk of bladder cancer among Asian populations. Gene. 2014; 534 (1): 48-53.
35. Bilgrami S.M., Qureshi S.A., Pervez S., Abbas F. Promoter hypermethylation of tumor suppressor genes correlates with tumor grade and invasiveness in patients with urothelial bladder cancer. Springerplus. 2014; 3: 178.
36. Dudziec E., Goepel J.R., Catto J.W. Global epigenetic profiling in bladder cancer. Epigenomics. 2011; 3 (1): 35-45.
37. Scher M.B., Elbaum M.B., Mogilevkin Y., Hilbert D.W., Mydlo J.H., Sidi A.A. et al. Detecting DNA methylation of the BCL2, CDKN2A and NID2 genes in urine using a nested methylation specific polymerase chain reaction assay to predict bladder cancer. J. Urol. 2012; 188 (6): 2101-7.
38. Eissa S., Swellam M., El-Khouly I.M., Kassim S.K., Shehata H., Mansour A. et al. Aberrant methylation of RARb2 and APC genes in voided urine as molecular markers for early detection of bilhar-zial and nonbilharzial bladder cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2011; 20 (8): 1657-64.
39. Zuiverloon T.C., Beukers W., van der Keur K.A., Munoz J.R., Bang-ma C.H., Lingsma H.F. et al. A methylation assay for the detection of non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC) recurrences in voided urine. BJU Int. 2012; 109 (6): 941-8.
40. Garcia-Baquero R., Puerta P., Beltran M., Alvarez M., Sacristan R., Alvarez-Ossorio J.L. et al. Methylation of a novel panel of tumor suppressor genes in urine moves forward noninvasive diagnosis and prognosis of bladder cancer: a 2-center prospective study. J. urol. 2013; 190 (2): 723-30.
41. Yegin Z., Gunes S., Buyukalpelli R. Hypermethylation of TWIST1 and NID2 in tumor tissues and voided urine in urinary bladder cancer patients. DNA Cell Biol. 2013; 32 (7): 386-92.
42. Abern M.R., Owusu R., Inman B.A. Clinical performance and util-
biochemistry
ity of a DNA methylation urine test for bladder cancer. Urol. Oncol. 2014; 32 (1): 51.e21-6.
43. Fantony J.J., Abern M.R., Gopalakrishna A., Owusu R., Jack Т.К., Lance R.S. et al. Multi-institutional external validation of urinary TWIST1 and NID2 methylation as a diagnostic test for bladder cancer. Urol. Oncol. 2015; 33 (9): 387.e1-6.
44. Reinert Т., Modin C., Castano F.M., Lamy P., Wojdacz Т.К., Hansen L.L. et al. Comprehensive genome methylation analysis in bladder cancer: identification and validation of novel methylated genes and application of these as urinary tumor markers. Clin. Cancer Res. 2011; 17 (17): 5582-92.
45. Chung W., Bondaruk J., Jelinek J., Lotan Y., Liang S., Czerniak B. et al. Detection of bladder cancer using novel DNA methylation biomarkers in urine sediments. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2011; 20 (7): 1483-91.
46. Chen H., Yu Y., Rong s., Wang H. Evaluation of diagnostic accuracy of DNA methylation biomarkers for bladder cancer: a systematic review and meta-analysis. Biomarkers. 2014; 19 (3): 189-97.
47. Sacristan R., Gonzalez C., Fernandez-Gomez J.M., Fresno F., Escaf S., Sanchez-Carbayo M. Molecular classification of non-muscle-invasive bladder cancer (pTa low-grade, pT1 low-grade, and pT1 highgrade subgroups) using methylation of tumor-suppressor genes. J. Mol. Diagn. 2014; 16 (5): 564-72.
48. Garcia-Baquero R., Puerta P., Beltran M., Alvarez-Mujica M., Al-varez-Ossorio J.L., Sanchez-Carbayo M. Methylation of tumor suppressor genes in a novel panel predicts clinical outcome in paraffin-embedded bladder tumors. Tumor Biol. 2014; 35 (6): 5777-86.
49. Kandimalla R., van Tilborg A.A., Zwarthoff E.C. DNA methylation-based biomarkers in bladder cancer. Nat. Rev. Urol. 2013; 10 (6): 327-35.
50. Aine M., Sjodahl G., Eriksson P., Veerla S., Lindgren D., Ringner M. et al. Integrative epigenomic analysis of differential DNA methylation in urothelial carcinoma. Genome Med. 2015; 7 (1): 23.
Поступила 01.10.15 Received 01.10.15
© СТАРОДУБЦЕВА И.А., ВАСИЛЬЕВА Л.В., 2016 УДК 616.71-018.3-07:616.153.96
Стародубцева И.А, Васильева Л.В.
сравнительный анализ уровня олигомерного матриксного протеина хряща в сыворотке крови пациентов с заболеваниями костно-
мышечной системы
ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Минздрава РФ, 394036, Воронеж, Российская Федерация
В структуре болезней костно-мышечной системы к наиболее распространенным заболеваниям относят остеоартроз (ОА) и ревматоидный артрит (РА). Высокая социальная значимость нозологий диктует необходимость поиска надежных хрящевых биомаркеров, имеющих диагностическую значимость не только в распознавании дегенеративных изменений на ранней стадии заболеваний суставов, но и в мониторировании эффективности лечения. В сыворотке крови больных вторичным ОА при РА (n = 248) оценивали содержание белка COMP c использованием ELISA. Сравнение полученных результатов проводили с группами контроля. В рамках исследования оценивали взаимосвязь уровня COMP сыворотки крови больных вторичным ОА при РА значением функционального индекса KOOS. Анализ полученных результатов выявил тенденцию к повышению уровня олигомерного матриксного протеина хряща в сыворотке крови больных вторичным ОА при РА по сравнению с группами контроля. Отмечена умеренная корреляционная взаимосвязь хрящевого биомаркера с индексом KOOS.
Ключевые слова: олигомерный матриксный протеин хряща; вторичный остеоартроз; ревматоидный артрит; KOOS.
Для цитирования: СтародубцеваИ.А., Васильева Л.В. Сравнительный анализ уровня олигомерного матриксного протеина хряща в сыворотке крови пациентов с заболеваниями костно-мышечной системы. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (2): 83-86.
DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-2-83-86.
Для корреспонденции: Стародубцева Ирина Александровна, канд. мед. наук, докторант каф. пропедевтики внутренних болезней ВГМУ им. Н.Н. Бурденко, starodubtsevairina1@gmail.com
