CC BY
14
УДК: 632.7.08
DOI 10.52653/PPI.2021.10.10.019
Определение мочевой кислоты в зерне с помощью ВЭЖХ
А.В. Яицких*, канд. техн. наук; Г.А. Закладной, д-р биол. наук, профессор; Д.С. Степаненко, аспирант ВНИИ зерна и продуктов его переработки - филиал ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН, Москва
Дата поступления в редакцию 03.09.2021 Дата принятия в печать 13.09.2021
* microbiolab@mail.ru © Яицких А.В., Закладной Г.А., Степаненко Д.С., 2021
Реферат
В данной статье показана возможность улучшения определения мочевой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с помощью увеличения растворимости ее в 1 %-ном растворе ацетата натрия, повышения удержания мочевой кислоты и тем самым изменения времени выхода, что позволяет повысить точность анализа. Проведено сравнение градуировочных растворов и опытных образцов зерна зараженных вредителями хлебных запасов. В процессе исследования был опробован метод для определения и идентификации мочевой кислоты как одного из загрязняющих зерно веществ с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. Экспериментально опробована и усовершенствована методика анализа мочевой кислоты в зерне с использованием жидкостного хроматографа «Стайер». Описаны оборудование и материалы для ВЭЖХ, условия хроматографического разделения и детектирования, построения калибровочного графика, экстракции, включая методику экстракции, сходимости результатов при экстракции и введении экстракта в хроматограф, а также порядок и расчет измерений. Экспериментально показано, что усовершенствованная методика с применением ВЭЖХ позволяет использовать ее для проведения дальнейших исследований зависимости содержания мочевой кислоты от величины загрязнения зерна насекомыми.
Ключевые слова
вредители хлебных запасов, ВЭЖХ, загрязненность, зерно, мочевая кислота, элюент Для цитирования
Яицких А.В., Закладной Г.А., Степаненко Д.С. (2021) Определение мочевой кислоты в зерне с помощью ВЭЖХ // Пищевая промышленность. 2021. № 10. С. 74-77.
A.V. Yaitskikh*, Candidate of Technical Sciences; G.A. Zakladnoy, Doctor of Biological Sciences; D.S. Stepanenko, graduate student All-Russian Scientific and Research Institute for Grain and Products of its Processing - Branch of Gorbatov Research Center for Food Systems of RAS, Moscow
This article shows the possibility of improving the determination of uric acid by high-performance liquid chromatography (HPLC), by increasing its solubility in a 1 % solution of sodium acetate, increasing the retention of uric acid, and thereby changing the yield time, which allow to improve the accuracy of the analysis, a comparison of calibration solutions and experimental grain samples of pest-infected bread stocks have been carried out. During the research course a method for the determination and identification of uric acid has been tested as one of the grain polluting substance using HPLC in the reversed phase. The method of uric acid in grain analysis using a liquid chromatograph «Stayer» has been experimentally tested and improved. The equipment and materials for HPLC, the conditions of chromatographic separation and detection, the construction of a calibration graph, extraction, including the extraction method, the convergence of the results during extraction and the introduction of the extract into the chromatograph, as well as the course and calculation of measurements have been described. It has been experimentally shown that the improved method with HPLC allows to use it for further research of the uric acid content dependence on the amount of grain contamination by insects.
Key words
uric acid, HPLC, eluent, grain pests, grain, contamination For citation
Yaitskikh A.V., Zakladnoy G.A., Stepanenko D.S. (2021) Determination of uric acid in grain using HPLC // Food processing industry = Pischevaya promyshlennost'. 2021. No. 10. P. 74-77.
Determination of uric acid in grain using HPLC
Received: September 3, 2021 Accepted: September 13, 2021
* microbiolab@mail.ru © Yaitskikh A.V., Zakladnoy G.A., Stepanenko D.S., 2021
Abstract
Введение. Поражение зерна вредными насекомыми и клещами снижает его массу и ухудшает качество [1], делает зерно ядовитым [2]. Поэтому зараженность и загрязненность зерна насекомыми и клещами строго нормируются в санитарно-эпидемиологических правилах и нормах (СанПин), в Техническом регламенте Таможенного союза (ТР ТС).
Традиционное выявление зараженности и загрязненности зерна вредителями хлебных запасов по их количеству в межзерновом пространстве в ряде случаев (например, после сепарирования зерна) дает ложную картину фактической опасности зерна для питания людей, является лазейкой для вывода на рынок фальсифицированной зерновой продукции и приводит к периодическому подтравливанию населения при питании продуктами, выработанными из такого зерна.
Мочевая кислота (МК) является непременным соединением, продуцируемым в результате жизнедеятельности животных организмов, в том числе насекомых и клещей, поражающих зерно [3, 4, 5]. При этом МК очень стабильна в продуктах, даже при кулинарной их обработке [6]. Поэтому анализ МК в зерне даст возможность исключить недостатки традиционных методов определения зараженности и загрязненности его вредными членистоногими.
С 1986 г. в России существует официальная методика анализа МК в зерне и зернопродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [7]. Однако она имеет ряд моментов, затрудняющих идентификацию МК и снижающих чувствительность анализа.
Цель исследования. В задачу данного исследования входило уточнение методики ВЭЖХ путем оптимизации размера анализируемой пробы зерна и экстра-гента, повышения удержания и изменения времени выхода МК.
Объекты и методы исследования.
Объектами исследования являлись мочевая кислота и зерно пшеницы. Использовали хроматограф жидкостный «Стайер» с термостатом колонок TS10, спектрофотометрическим детектором и программно-аппаратным комплексом «МультиХром для Windows». Предел допускаемого значения относительного среднеквадратического отклонения вре-
мени удерживания определяемого компонента - 0,5 % и выходного сигнала по высоте и площади пика - 4 %.
Колонка хроматографическая разделительная «SynergiHydm-RP», 4 мкм, 250x4,6 мм, «Р1пепотепех», США. Колонка защитная «С18» или «С18 Aq», 4,0x3,0 мм, «РЬюпотепех», США.
Режим разделения изократический, подвижная фаза 0,04 М, ацетатный буфер (рН = 5,8), скорость потока 1 см3/мин, объем петлевого дозатора 20 мкл, температура термостата колонки 30 °С, детектирование при длине волны 282±2 нм.
Градуировку выполняли последовательно для всех растворов. Для каждого градуировочного раствора регистрировали не менее двух хроматограмм. Выход МК идентифицировали по абсолютному времени удерживания.
Рассчитанный для градуировочного графика коэффициент корреляции равен 0,998, случайно составляющая погрешность (СКО) была 3,139 %.
Навеску зерна 100 г с известным количеством ранее введенной в него МК помещали в плоскодонную коническую колбу, добавляли 200 мл дистиллированной воды и доводили до кипения, далее выдерживали 10 мин. После охлаждения до 25 °С экстракт фильтровали с помощью фильтровальной установки через целлюлозный фильтр.
Проводили анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняли по два измерения с получением хрома-тограмм.
Рассчитывали среднее арифметическое значение двух результатов анализа массовой концентрации МК для каждой из параллельных проб.
Результаты и их обсуждение. В процессе работы была выявлена зависимость изменения времени удерживания МК от изменения температуры. Поэтому метод был дополнен использованием термостата колонок, который поддерживал постоянную температуру 30 °С, что снизило погрешность измерения.
В отличие от [7], пробу зерна перед экстракцией МК увеличили до 100 г вместо 20 г, а количество экстрагента для извлечения МК сократили до 200 мл для увеличения концентрации МК в экстракте.
В ходе опыта была замечена корреляция между зерном с разной степенью зараженности. Однако для увеличения степени извлечения МК и повышения точности определения, особенно при малых содержаниях МК, проведены изменения на этапе пробоподготовки.
В качестве экстрагентов испытаны вода, предлагаемая в [7], и 1 %-ный раствор ацетата натрия. Данные, приведенные на рис. 1, убеждают, что ацетат натрия по сравнению с водой увеличивает степень извлечения МК из зерна.
При анализе МК в зерне ее выход происходил на 5-6-й минуте. При этом на хроматограммах в экстракте присутствуют вещества, обладающие близким к МК временем удерживания (рис. 2). Они вызывают эффект наложения на МК, что увеличивает погрешность анализа, особенно при малом содержании МК в зерне. Необходимо было увеличить время удерживания, чего можно достичь с применением ионно-связывающих агентов, соответствующих подвижной фазе.
Поэтому мы изменили подвижную фазу на раствор однозамещенного фос-
800
■и
ад 100 200 300 400
Количество мочевой кислоты, мкг ■ Градуировочные растворы в воде ■: Градуировочные растворы в 1 %-ла растворе ацетата натрия
Рис. 1. Зависимость площади пика от количества введенной в зерно МК при экстракции водой и ацетатом натрия
mAl"
ií-
10-
Olloipon^
íwUiiaai iJfiei i»1,1 ii?¡ i ini i
10 11 II u u
1} ?4
■ 1 Ai
Рис. 2. Хроматограмма экстракта, полученного из зерна пшеницы, при использовании в качестве подвижной фазы 0,04 М ацетатного буфера
u :т к- ;о ;■;■ мин загрязненной насекомыми,
Рис. 3. Хроматограмма градуировочного раствора мочевой кислоты с концентрацией
10 мкг/мл при использовании фосфатной подвижной фазы с добавлением тетрабутиламмония
дигидрофосфата
mAV JS- № Vb lf-10- ( Рис. фазы i i
i t SL |
¡ 1 1
: М
: —
¡
i ?
i Á! 7 i
i Á л А LL^ L /\ • i
ri—II IIII i i i- т i i i—г-т—iiii—r—i—i—i i : ■. мин ?. Хроматограмма экстракта из зерна пшеницы при использовании фосфатной подвижной с добавлением тетрабутиламмония дигидрофосфата
форнокислого калия и двузамещен-ного фосфорнокислого натрия в дистиллированной воде с добавлением в качестве ионно-связывающего агента тетрабутиламмония дигидрофосфата. Было отмечено, что изменение времени выхода МК зависит от количества ионно-связывающего агента. Это позволило переместить время выхода МК на хроматограмме в чистую зону (рис. 3).
На рис. 4 приводим хроматограмму экстракта МК из зерна с использованием фосфатной подвижной фазы с добавлением тетрабутиламмония дигидрофосфата. Видно, что выход МК происходит на 18-23-й мин и отстоит от загрязняющих веществ в экстракте, облегчая идентификацию МК.
Выводы. На основании результатов проведенной работы можно сделать вывод о целесообразности применения 1 %-ного водного раствора ацетата натрия при анализе МК для метода, представленного в данном исследовании. Он подходит как для приготовления градуировочных растворов, так и для пробоподготовки, в связи с лучшей растворимостью МК в данном растворе и, как следствие, большей величиной определяемого компонента.
Использование тетрабутиламмония дигидрофосфата в качестве ионно-связывающего агента привело к увеличению времени удерживания МК, при этом время выхода ее напрямую зависело от количества внесенного тетрабутиламмония дигидрофосфата.
Результаты позволили увеличить извлечение МК из зерна, изменить удерживающую способность ВЭЖХ для МК, что улучшило качественную и количественную объективную и достоверную оценку загрязненности зерна.
ЛИТЕРАТУРА
1. Закладной, Г.А. Заметки по поводу ГОСТ 34165-2017. Научное обеспечение инновационных технологий производства и хранения сельскохозяйственной и пищевой продукции // Сборник материалов I Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Краснодар, 2018. -С. 124-130.
2. Антонович, Е.А. Гигиеническая регламентация зараженности зерна вредителями / Е.А. Антонович, Н.С. Сыроед, Г.А. Заклад-
ной // Сборник докладов Всесоюзной научной конференции «Пути повышения качества зерна и зернопродуктов, улучшения ассортимента крупы, муки и хлеба». - Москва: ВНИИЗ, 1991. - Т. 1. -С. 81-86.
3. Subrahmanyan, V. Uric acid as an index of insect filth in cereals and milled cereal products / V. Subrahmanyan, M. Swamina-than, S.V. Pingale, S.B. Kadkol // Bulletin of the Central Food Technological Research Institute Mysore. - 1955. - No. 5. -P. 86.
4. Закладной, Г.А. Зависимость содержания мочевой кислоты в хранящемся зерне от плотности заселения его рисовым долгоносиком Sitophilus oryzae L. (Coleoptera, Dryophthoridae) / Г.А. Закладной, А.В. Яиц-ких // Энтомологическое обозрение. -2020. - Выпуск 99. - № 1. - С. 45-48.
5. Venkat Rao, S. The relation between the uric acid content and the extent of kernel damaged in insect infested grain / S. Venkat Rao, R.N. Nuggehalli, S.V. Pingale, M. Swaminathan, V. Subrahmanyan // Food Science. - 1957. - No. 6. - P. 273.
6. Ratni Devi. Effect of Cooking on the Proximate Composition, Uric Acid content and Anti-Nutritional factor on insect Bruchid infested Gram at Graded Levels of Infestation / Devi Ratni, Modgil Rajni, Sood Archana // International Journal of Microbiology and Current Research. - 2019. - Vol. 1. -Issue 1. - P. 33-36.
7. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания мочевой кислоты в зерне и
зернопродуктах. Утверждено Главным государственным санитарным врачом СССР П.Н. Бургасовым 11.02.1986. № 4072-86.
REFERENCES
1. Zakladnoj GA. Zametki po povodu GOST 34165-2017 [Notes on GOST 34165-2017]. Nauchnoe obespechenie innovacionnykh tekhnologij proizvodstva i khraneniya sel'skohozyajstvennoj i pischevoj produkcii [Scientific support of innovative technologies for the production and storage of agricultural and food products]. Sbornik materiaiov i Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii mo[odykh uchenyh i specialistov [Collection of materials of the I International Scientific and Practical Conference of Young Scientists and Specialists]. Krasnodar, 2018. 124-130.
2. Antonovich EA, Syroed NS, Zaklad-noj GA. Gigienicheskaya reglamentaciya zarazhennosti zerna vreditelyami [Hygienic regulation of grain pest infestation]. Sbornik dokladov Vsesoyuznoj nauchnoj konferencii «Puti povysheniya kachestva zerna i zernoproduktov, uluchsheniya assortimenta krupy, muki i hleba» [Collection of reports of the All-Union scientific conference «Ways of improving the quality of grain and grain products, improving the range of cereals, flour and bread»]. Moscow: VNIIZ, 1991. Vol. 1. P. 81-86.
3. Subrahmanyan V, Swaminathan M, Pingale SV, Kadkol SB. Uric acid as an index of insect filth in cereals and milled cereal products. Bulletin of the Central Food
Technological Research Institute Mysore. 1955. No. 5. P. 86.
4. Zakladnoj GA, Yaickih AV. Zavisimost' soderzhaniya mochevoj kisloty v khra-nyaschemsya zerne ot plotnosti zaseleniya ego risovym dolgonosikom Sitophilus oryzae L. (Coleoptera, Dryophthoridae) [Dependence of the content of uric acid in stored grain on the density of its colonization by the rice weevil Sitophilus oryzae L. (Coleoptera, Dryophthoridae)]. Entomologicheskoe obozrenie [Entomological Review]. 2020. Issue 99. No. 1. P. 45-48.
5. Venkat Rao S, Nuggehalli RN, Pingale SV, Swaminathan M, Subrahmanyan V. The relation between the uric acid content and the extent of kernel damaged in insect infested grain. Food Science. 1957. No. 6. P. 273.
6. Ratni Devi, Rajni Modgil, Archana Sood. Effect of Cooking on the Proximate Composition, Uric Acid content and Anti-Nutritional factor on insect Bruchid infested Gram at Graded Levels of Infestation. International Journal 0f Microbiology and Current Research. 2019. Vol. 1. Issue 1. P. 33-36.
7. Metodicheskie ukazaniya po obnaruzheniyu, identifikacii i opredeleniyu soderzhaniya mochevoj kisloty v zerne i zernoproduktakh. Utverzhdeno Glavnym gosudarstvennym sanitarnym vrachyom SSSR Burgasovym PN [Guidelines for the detection, identification and determination of the content of uric acid in grain and grain products. Approved. Chief State Sanitary Doctor of the USSR PN Burgasov]. 11.02.1986. No. 4072-86.
Авторы Authors
Яицких Артём Валерьевич, канд. техн. наук, Artyom V. Yaitskikh, Candidate of Technical Sciences,
Закладной Геннадий Алексеевич, д-р биол. наук, профессор, Gennadiy A. Zakladnoy, Doctor of Biological Sciences,
Степаненко Дмитрий Сергеевич, аспирант Dmitriy S. Stepanenko, graduate student
ВНИИ зерна и продуктов его переработки - филиал ФНЦ пищевых All-Russian Scientific and Research Institute for Grain and Products of
систем им. В.М. Горбатова РАН, 117624, Москва, Дмитровское шоссе, its Processing - Branch of Gorbatov Research Center for Food Systems of
д. 11, microbiolab@mail.ru, vlaza@list.ru, ark310@yandex.ru RAS, 11, Dmitrovskoe highway, Moscow, 117624, microbiolab@mail.ru,
vlaza@list.ru, ark310@yandex.ru
