CC BY
37
УДК 615.07:615.356
https://doi.org/10.30895/1991-2919-2021-11-185-192
И
Анализ фолиевой кислоты в поливитаминных препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
А. С. Алексеева1*, М. В. Гаврилин3, Т. Б. Шемерянкина1, М. С. Смирнова1, Е. П. Федорова1, Т. М. Каргина1, О. О. Новиков2, С. А. Ковалева2, Н. Н. Бойко2
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация 2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
«Российский университет дружбы народов», Миклухо-Маклая ул., д. 6, Москва, 117198, Российская Федерация 3 Общество с ограниченной ответственностью «Фармакор Продакшн», Репищева ул., д. 14, Санкт-Петербург, 197378, Российская Федерация
Резюме. Поливитаминные препараты, содержащие фолиевую кислоту, значительно различаются по своему составу. Предлагаемые производителями методы и условия анализа фолиевой кислоты также различаются, в связи с чем необходима унификация методик анализа фолиевой кислоты для близких по составу препаратов. Цель работы: сравнение результатов апробации методик анализа фолиевой кислоты в поливитаминных препаратах методом обращенно-фазо-вой высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме подачи подвижной фазы. Материалы и методы: хроматограф жидкостный Agilent 1260 Infinity II LC с диодно-матричным детектором, аналитическая длина волны 280 нм. Колонки хроматографические с неподвижной фазой на основе силикагеля с привитыми группами С8 и С18. Режим подачи подвижной фазы — изократический. Модельные смеси, содержащие фолиевую кислоту, циа-нокобаламин, железа сульфат и калия йодид. Результаты: наименьшие значения относительного стандартного отклонения площади пика фолиевой кислоты (RSD = 0,09%) и фактора асимметрии пика (As = 1,04) отмечены при анализе модельной смеси «железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин» на колонке 250x4,0 мм с силикагелем октилсилильным (С8) эндкепированным с использованием в качестве подвижной фазы смеси метанол — фосфатный буферный раствор pH 6,6 (12:88) при температуре 25 °С. Показана возможность одновременного определения примеси птероевой кислоты в данных условиях анализа и осаждения мешающих ионов железа при использовании в качестве растворителя пробы раствора, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту, с рН 9,5. Выводы: при выборе оптимальной унифицированной методики анализа фолиевой кислоты в комплексных препаратах можно рекомендовать метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для проверки пригодности хроматогра-фической системы рекомендуется использовать раствор, содержащий фолиевую и птероевую кислоты. Ключевые слова: фолиевая кислота; ВЭЖХ; поливитаминные препараты; фактор асимметрии; относительное стандартное отклонение; эффективность хроматографической колонки
Для цитирования: Алексеева АС, Гаврилин МВ, Шемерянкина ТБ, Смирнова МС, Федорова ЕП, Каргина ТМ, Новиков ОО, Ковалева СА, Бойко НН. Анализ фолиевой кислоты в поливитаминных препаратах методом обращен-но-фазовой ВЭЖХ. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2021;11(3):185—192. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2021-11-2-185-192 * Контактное лицо: Алексеева Анастасия Сергеевна; AlekseevaAS@expmed.ru
Determination of Folic Acid in Multivitamin Preparations by Reversed Phase HPLC
A. S. Alekseeva1*, M. V. Gavrilin3, T. B. Shemeryankina1, M. S. Smirnova1, E. P. Fedorova1, T. M. Kargina1, O. O. Novikov2, S. A. Kovaleva2, N. N. Boyko2
1 Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, 8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation 2 Peoples' Friendship University of Russia 6 Miklukho-Maklaya St., Moscow 117198, Russian Federation
3 "Pharmacor Production", Ltd., 14 Repishcheva St., St.-Petersburg 197378, Russian Federation
Abstract. A great variety of components in multivitamin preparations containing folic acid, and a variety of test methods and conditions of folic acid determination proposed by manufacturers, require alignment of test procedures for products with similar composition. The aim of the study was to compare the results of experimental verification of folic acid determination procedures which use reversed phase high-performance liquid chromatography (RP HPLC) with isocratic elution mode. Materials and methods: The Agilent 1260 Infinity II LC system with a diode array detector (280 nm), isocratic elution mode, C8- and C18-bonded silica gel chromatographic columns, model mixtures containing folic acid, cyanocobalamin, ferrous sulfate, and potassium iodide, were used in the study. Results: The lowest relative standard deviation of the folic acid peak area (RSD=0.09%), and the lowest
asymmetry factor (4=1.04) for folic acid were observed for the model mixture "ferrous sulfate+folic acid+cyanocobalamin" and the following test conditions. Column: 250x4.0 mm, silica gel for chromatography, octylsilyl (C8), endcapped; mobile phase: methanol—phosphate buffer (12:88), pH 6.6; column temperature: 25 °C. The study demonstrated the feasibility of using these conditions for determination of pteroic acid impurity with simultaneous precipitation of interfering ferrous ions, using ethylene-diaminetetraacetic acid solution, pH 9.5, as a solvent. Conclusions: RP HPLC can be recommended as an optimal aligned test procedure for determination of folic acid in combination products. It is recommended to use a solution containing folic and pteroic acids for system suitability testing.
Key words: folic acid; HPLC; multivitamin preparations; asymmetry factor; relative standard deviation; column efficiency
For citation: Alekseeva AS, Gavrilin MV, Shemeryankina TB, Smirnova MS, Fedorova EP, Kargina TM, Novikov OO, Kova-leva SA, Boyko NN. Determination of folic acid in multivitamin preparations by reversed phase HPLC. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya = The Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. 2021;11(3):185—192. https://doi. org/10.30895/1991-2919-2021-11-2-185-192
* Corresponding author: Anastasia S. Alekseeva; AlekseevaAS@expmed.ru
Разработка и совершенствование методов определения витаминов является актуальной задачей, от решения которой зависит качество и безопасность фармацевтической продукции [1].
Фолиевая кислота является водорастворимым витамином, который участвует в ряде ключевых клеточных процессов, в частности синтезе пиримидина, нуклеопротеинов, в регуляции активности генов, является кофактором метаболизма гомоцисте-ина, повышение уровня которого связано с рисками возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, прогрессированием хронических болезней почек, тяжелой формы прогрессирующего атеросклероза [2, 3]. Исследования показали, что высокое потребление фолатов с пищей ведет к повышению риска развития колоректальных аденом [4, 5]. Фолаты играют важную роль в предупреждении формирования дефектов нервной трубки у эмбриона [6], также фолиевая кислота используется в терапии и диагностике некоторых онкологических заболеваний, включая опухоли легких и яичников [7, 8].
Фолиевая кислота входит в состав 44 поливитаминных препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации. Среди лекарственных форм, представленных на отечественном рынке, содержащих фолиевую кислоту, наиболее распространенными являются таблетки, покрытые пленочной оболочкой (14 наименований), таблетки, покрытые оболочкой (10). Также фолиевая кислота в поливитаминах присутствует в виде таблеток жевательных (9), капсул (5), таблеток (2), драже, сиропа, лиофилиза-та для приготовления раствора для инфузий и лио-филизата для приготовления раствора для внутривенного введения (по 1 наименованию).
При выборе методики для анализа фолиевой кислоты в поливитаминных препаратах следует учитывать физико-химические свойства этого вещества и его нестабильность [9]. В воде фолиевая кислота практически нерастворима, в кислых и щелочных растворах растворима, в органических растворителях нерастворима. В щелочной среде ее стабильность выше, чем в кислой, поэтому стандартные образцы производных фолиевой кислоты принято использовать в виде щелочных растворов [9].
Фолиевая кислота в водном растворе ведет себя как слабая кислота. В диапазоне pH от 4 до 12 структура молекулы находится в равновесии между амидом (кислотная форма) и фенолятом (основная форма). A. Thomas и соавт. в 2002 г. было отмечено, что кислотно-щелочной баланс соединений птерина, таких как фолиевая кислота, смещается (>99%) при pH 4,9—5,5 в сторону образования кислотной формы, а при pH 10,0—10,5 в сторону образования основной формы. В кислой среде под действием света и высокой температуры фолиевая кислота подвергается деструкции. Термоустойчивость фолатов значительно варьирует. Так, стабильность тетрагидрофолиевой и 5-метилтетрагидрофолиевой кислот при нагревании значительно повышается при добавлении аскорбиновой кислоты [3, 9]. Авторами работы [3] проанализированы результаты исследований стабильности фолиевой кислоты. Указано, что в 1951 г. A. Biamonte и G. Schneller описали стабильность фолиевой кислоты в растворах, содержащих одно или несколько соединений из витаминов группы B, при pH от 3 до 7. Два десятилетия спустя, в 1975 г., J. O'Broin и соавт. описали стабильность фолиевой кислоты в различных буферных системах, установили период полураспада при разложении фолиевой кислоты при pH 5 или выше при температуре окружающей среды и обнаружили, что период полураспада составляет более 700 ч, однако резко снижается до 24—64 ч при значениях pH ниже 4. Тогда же было отмечено, что разложение фолиевой кислоты при pH 6 и 8 значительно снижалось при использовании фосфатного буферного раствора, но не других буферных композиций (цит. по [3]).
Выбор метода анализа для определения водорастворимых витаминов обусловлен рядом требований: пределом обнаружения метода в зависимости от содержания определяемых компонентов, допускаемой погрешностью, временными затратами, стоимостью анализа. Безусловно, предпочтение отдается методам, требующим минимальной пробоподготовки при максимальной информативности получаемых результатов. Таким требованиям удовлетворяет метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который является
перспективным для анализа многокомпонентных смесей, содержащих водорастворимые витамины [3, 9, 10].
Методики определения водорастворимых витаминов на основе обращенно-фазовой ВЭЖХ разработаны как для градиентного, так и для изократиче-ского режимов хроматографирования. Выполнение анализа при градиентном элюировании требует дополнительного времени для установления равновесия в хроматографической системе при повторном анализе. При разделении смесей большого количества водорастворимых витаминов оптимальным вариантом, как было показано, является градиентное элюирование [11]. Однако для небольшого количества определяемых компонентов в смеси достаточно использовать изократическое элюирование, что может быть применимо и при разработке методик разделения водорастворимых витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [12]. При анализе научных публикаций было выявлено, что для определения фолиевой кислоты могут применяться колонки Spherisorb ODS (250x4,6 мм, 5 мкм), Hypersil ODS (150x4,6 мм, 3 мкм) [13], Microsorb-MV C18 (150x4,6 мм, 3 мкм) [14] при температуре 25 °C [14] или 30 °C [13]. Диапазон длин волн, при которых проводилось обнаружение фолиевой кислоты, — 280—290 нм [13, 14]. В качестве подвижной фазы использовалась смесь 24% водного раствора метанола (об./об.) и буферного раствора (3,5 мМ калия дигидрофосфата и 3,2 мМ дикалия гидрофосфата), pH 6,8, содержащего 5 мМ дигидрофосфата тетрабу-тиламмония в качестве ион-парного агента [14].
Цель работы — сравнение результатов апробации методик анализа фолиевой кислоты в поливитаминных препаратах методом обращен-но-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме подачи подвижной фазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были методики анализа, применяемые для контроля качества лекарственных средств, содержащих фолиевую кислоту. Для сравнения этих методик были проанализированы модельные смеси, соответствующие по составу поливитаминным лекарственным препаратам, зарегистрированным в Российской Федерации. Смеси содержали фармацевтические субстанции фолиевой кислоты (Sigma-Aldrich кат. № 1286005) (от 0,4 до 5 мг), цианокобаламина (Sigma-Aldrich кат. № C3000000) (от 2 до 10 мкг), железа сульфата (Sigma-Aldrich кат. № F7002) в количестве 112,6 мкг и калия йодида (Sigma-Aldrich кат. № 207969 ReagentPlus®) в количестве 262 мг.
Для проведения анализа модельных смесей использовали:
- хроматограф жидкостный Agilent 1260 Infinity II LC (Agilent Technologies) с диодно-матричным детектором, аналитическая длина волны 280 нм, режим подачи подвижной фазы — изократический. Используемое оборудование было надлежащим образом квалифицировано [15];
- хроматографические колонки:
1) 250x4,6 мм, силикагель октадецилсилильный (С18) деактивированный по отношению к основаниям, для хроматографии, размер частиц 5 мкм, размер пор 130 Â;
2) 250x4,0 мм, силикагель октилсилильный (С8) эндкепированный, для хроматографии, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Â;
3) 150x4,6 мм, силикагель октадецилсилильный (С18) эндкепированный, для хроматографии, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Â;
- стандартный образец фолиевой кислоты USP, чистота 98,9% (Sigma-Aldrich кат. № 1286005). Стандартный образец птероевой кислоты (примесь D фолиевой кислоты) (Sigma-Aldrich кат. № Y0001243);
- метанол и ацетонитрил квалификации для ВЭЖХ. Калия дигидрофосфат, натрия гидрок-сид и ортофосфорная кислота концентрированная квалификации х.ч.;
- фосфатный буферный раствор рН 6,0 ± 0,6, содержащий калия дигидрофосфат 13,6 г/л.
Условия определения фолиевой кислоты в анализируемых композициях поливитаминных препаратов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ при изо-кратической подаче подвижной фазы представлены в таблице 1.
В качестве критериев пригодности хроматогра-фической системы использовали следующие параметры: фактор асимметрии пика фолиевой кислоты (А) не менее 0,80, но не более 1,50; относительное стандартное отклонение площади пика (RSD) не более 2,0%; число теоретических тарелок (N) не менее 1000; время удерживания вещества.
Статистическую обработку результатов анализа проводили согласно 0ФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического экс-перимента»1. Анализировали по две навески смесей в 6 повторностях каждую.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты апробации условий анализа фоли-евой кислоты на модельных смесях представлены на рисунках 1—7.
Параллельно с модельными смесями были проанализированы растворы стандартного образца фолиевой кислоты и стандартного образца птеро-евой кислоты, которые являлись одновременно растворами для проверки пригодности хроматогра-фической системы (рис. 2, 5, 7). Предусмотренное
Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018.
Таблица 1. Условия определения фолиевой кислоты в анализируемых композициях поливитаминных препаратов Table 1. Test conditions for determination of folic acid in multivitamin preparations
Условия анализа модельных смесей следующего состава: Test conditions for the model mixtures with the following composition:
Параметры методики Parameter Калия йодид+фолиевая кислота+цианокобаламин Potassium iodide+Folic acid+Cyanocobalamin Железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин Ferrous sulfate+Folic acid+Cyanocobalamin Фолиевая кислота+ цианокобаламин Folic acid+Cyanocobalamin
Подвижная фаза Mobile phase Ацетонитрил — 0,05 М калия дигидрофосфата буферный раствор (рН 6,0) 5:95 Acetonitrile-0.05 M potassium dihydrogen phosphate buffer (pH 6.0), 5:95 Метанол — 0,1 М калия дигидрофосфата буферный раствор (рН 6,6) 12:88 Methanol-0.1 M potassium dihydrogen phosphate buffer (pH 6.6), 12:88 Ацетонитрил — 0,05 М калия дигидрофосфата буферный раствор (рН 6,0) 5:95 Acetonitrile-0.05 M potassium dihydrogen phosphate buffer (pH 6.0), 5:95
Концентрация фолиевой кислоты в анализируемом растворе Folic acid concentration in the test solution 0,016 мг/мл, ступенчатое разбавление сначала в 0,1 М растворе натрия гидроксида, затем в подвижной фазе 0.016 mg/mL, stepwise dilution in 0.1 M sodium hydroxide and in the mobile phase 0,052 мг/мл, ступенчатое разбавление сначала в растворе этилендиаминтетраук-сусной кислоты 0,372% (рН 9,5), затем в подвижной фазе 0.052 mg/mL, stepwise dilution in 0.372% ethyl-enediaminetetraacetic acid (pH 9.5) and in the mobile phase 0,0176 мг/мл, ступенчатое разбавление сначала в 0,1 М растворе натрия ги-дроксида, затем в подвижной фазе 0.0176 mg/mL, stepwise dilution in 0.1 M sodium hydroxide and in the mobile phase
Параметры колонки Column parameters С18 250x4,6 мм, 5 мкм 250x4.6 mm, 5 ^m С8 250x4,0 мм, 5 мкм 250x4.0 mm, 5 ^m С18 150x4,6 мм, 5 мкм 150x4.6 mm, 5 ^m
Модификация сорбента Stationary phase Деактивация по отношению к основаниям Base deactivated Эндкепинг Endcapped Эндкепинг Endcapped
Объем вводимой пробы, мкл Injection volume, ^L 20 10 20
Температура, °С Temperature, °С 25 25 25
Скорость подвижной фазы, мл/мин Flow rate, mL/min 1,0 0,6 1,0
Время анализа, мин Run time, min 5 15 20
в методике анализа для модельной смеси «железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин» использование стандартного образца птероевой кислоты, который прибавляют к раствору стандартного образца фолиевой кислоты (рис. 5), отличает эту методику от двух других. Птероевая кислота является примесью D фармацевтической субстанции фолие-вой кислоты и может использоваться как для оценки пригодности хроматографической системы, так и для одновременной оценки примесей в препарате, что позволяет повысить информативность анализа. На эту возможность, безусловно, следует обратить внимание при выборе унифицированной методики для анализа фолиевой кислоты.
На хроматограммах наблюдается, что время удерживания фолиевой кислоты в условиях анализа для модельной смеси «калия йодид+фолиевая кислота+цианокобаламин» (C18 250x4,6 мм, 5 мкм, сорбент деактивированный по отношению к основаниям) составляет 3,4 мин, для модельной смеси «железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин» (C8, 250x4,0 мм, 5 мкм, сорбент эндкепированный
— 9 мин), для модельной смеси «фолиевая кислота+цианокобаламин» (C18, 150x4,6 мм, 5 мкм, сорбент эндкепированный) — 8,07 мин. Вероятно, на время удерживания фолиевой кислоты критическое влияние оказывает тип сорбента хроматографической колонки. Удерживание на колонке с октадецилсилиль-ным силикагелем (С18) в определенной мере больше, чем на колонке с октилсилильным силикагелем (С8). Использование силикагеля, деактивированного по отношению к основаниям, приводит к уменьшению времени удерживания фолиевой кислоты.
Средние значения критериев пригодности хро-матографической системы и время удерживания вещества в исследуемых условиях, представлены в таблице 2.
Для всех трех вариантов условий анализа выполняются критерии пригодности хроматографи-ческой системы для определения фолиевой кислоты в комплексных поливитаминных препаратах. Наименьшее значение относительного стандартного отклонения площади пика (RSD = 0,09%) и фактора асимметрии пика (A = 1,04) для фолиевой
400
I-, Щ ^
41=
U С
О ^
300
200
100
0,5
1,5 2 2,5 3
Время, мин / Time, min
3,5
4,5
Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси «калия йодид+фолиевая кислота+цианокобаламин». Условия анализа: колонка размером 250*4,6мм, силикагель октадецилсилильный (С18) деактивированный по отношению к основаниям, 5мкм; подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05МKHpO4 (5:95); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 3,4мин. Fig. 1. Chromatogram of the model mixture "Potassium iodide+Folic acid+Cyanocobalamin". Column: 250*4.6 mm, silica gel for chromatography, octadecylsilyl (C18), base-deactivated, 5^m. Mobilephase: acetonitrile—0.05 МKHpO4 (5:95). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 3.4 min.
0
I-, Щ ^
4 <
U
500 400-
s 300-
I !200-
a M
H <P
О С* 100
0,5
1,5 2 2,5
Время, мин / Time, min
3,5
4,5
Рис. 2. Хроматограмма раствора стандартного образца фолиевой кислоты. Условия анализа: колонка 250*4,6 мм, силика-гель октадецилсилильный (С18) деактивированный по отношению к основаниям, 5 мкм; подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05 МKHpO4 (5:95); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 3,4 мин. Fig. 2. Chromatogram of the folic acid reference standard. Column: 250*4.6 mm, silica gel for chromatography, octadecylsilyl (C18), base-deactivated, 5 ^m. Mobile phase: acetonitrile—0.05 М KHpO4 (5:95). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 3.4 min.
I-, Щ ^
ч p £ s
~ a
а «
н <u
О ^
200 150 100 50
J I
23456789 Время, мин / Time, min
10 11 12 13 14 15
Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси: «железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин». Условия анализа: колонка 250*4,0мм силикагель октилсилильный (С8) эндкепированный, 5мкм; подвижная фаза: метанол — 0,1 МKHpO4 (12:88); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 9,0 мин.
Fig. 3. Chromatogram of the model mixture "Ferrous sulfate+Folic acid+Cyanocobalamin". Column: 250*4.0 mm, silica gelfor chromatography, octylsilyl (C8), endcapped, 5 ^m. Mobile phase: methanol—0.1 М KHpO4 (12:88). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 9.0min.
0
1
3
4
0
1
200 150
Ч I-,
î £ 100
H w
Ч а
a «
н 0J
О ^
50 0
1
2 3
4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Время, мин / Time, min
Рис. 4. Хроматограммараствора стандартного образца фолиевой кислоты. Условия анализа: колонка 250*4,0мм силика-гель октилсилильный (С8) эндкепированный, 5мкм; подвижная фаза: метанол — 0,1 М KH2PO4 (12:88); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 9,0 мин.
Fig. 4. Chromatogram of the folic acid reference standard. Column: 250*4.0 mm, silica gel for chromatography, octylsilyl (C8), end-capped, 5 ^m. Mobile phase: methanol—0.1 М KH,pO4 (12:88). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 9.0 min.
4 I-,
Щ ^
4 p £s
, <U
a £
M c
5 ^
H <U
О ^
25 20 15 10 5-
23456789 Время, мин / Time, min
10 11 12 13 14 15
Рис. 5. Хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографической системы. Условия анализа: колонка 250*4,0мм силикагель октилсилильный (С8) эндкепированный, 5мкм; подвижная фаза: метанол — 0,1 МKHpO4 (12:88); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 9,0 мин, время удерживания птероевой кислоты — около 12,0 мин.
Fig. 5. Chromatogram of the system suitability solution. Column: 250*4.0 mm, silica gel for chromatography, octylsilyl (C8), endcapped, 5 ^m. Mobile phase: methanol—0.1 М KH,pO4 (12:88). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 9.0 min, the retention time of pteroic acid—12.0 min.
£ 40
<u P
* p 30
u P ^ 20 S g
S 110
H <P
о ^
0
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Время, мин / Time, min
Рис. 6. Хроматограмма модельной смеси: «фолиевая кислота+цианокобаламин». Условия анализа: колонка 150*4,6мм силикагель октадецилсилильный (С18) эндкепированный, 5мкм; подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05МKH2PO4 (5:95); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 8,1 мин.
Fig. 6. Chromatogram ofthe model mixture "Folic acid+Cyanocobalamin". Column: 150*4.6 mm, silica gelfor chromatography, octa-decylsilyl (C18), endcapped, 5 ßm. Mobile phase: acetonitrile—0.05 М KH2PO4 (5:95). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 8.1 min.
кислоты наблюдается в условиях, используемых для разделения смеси «железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин». В данных условиях возможно одновременное определение птероевой кислоты (родственной примеси D фармацевтической субстанции фолиевой кислоты), что не требует отдельных условий и колонки для контроля данной
примеси в препарате, а также значительно сокращает время и реактивы.
Еще одним преимуществом этой методики является состав растворителя для испытуемого образца (раствор, содержащий этилендиаминтетраук-сусную кислоту с рН 9,5), использование которого позволяет избавиться от мешающих ионов железа,
0
1
к <
5 s
, <D
X Й
s О
Ч ft
Ü м
H <4 О
40 30 20 10 0-
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Время, мин / Time, min
Рис. 7. Хроматограмма раствора стандартного образца фолиевой кислоты. Условия анализа: колонка 150*4,6 мм силикагель октадецилсилильный (С18) эндкепированный, 5мкм; подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05МKHpO4 (5:95); детектирование 280 нм; время удерживания фолиевой кислоты — около 8,1 мин.
Fig. 7. Chromatogram of the folic acid reference standard. Column: 150*4.6 mm, silica gel for chromatography, octadecylsilyl (C18), endcapped, 5^m. Mobile phase: acetonitrile—0.05 МKHpO4 (5:95). Detection at 280 nm. The retention time of folic acid is about 8.1 min.
Таблица 2. Средние значения критериев пригодности хроматографической системы для стандартного образца фолиевой кислоты в рассмотренных условиях анализа (n = 6, P = 95%)
Table 2. Mean values of the system suitability criteria for the folic acid reference standard under the given test conditions (n = 6, P = 95%)
Наименование модельной смеси Model mixture Относительное стандартное отклонение площади пика (RSD), % Relative standard deviation of the peak area Фактор асимметрии пика (A) Asymmetry factor Число теоретических тарелок (N) Plate number Время удерживания фолиевой кислоты, мин Folic acid retention time
«Калия йодид+фолиевая кислота+цианокобаламин» Potassium iodide+folic acid+cyanocobalamin 0,72 1,08 ± 0,05 31410 ± 1302 3,42 ± 0,02
«Железа сульфат+фолиевая кислота+цианокобаламин» Ferrous sulfate+folic acid+cyanocobalamin 0,09 1,04 ± 0,01 8166 ± 16 9,00 ± 0,01
«Фолиевая кислота+цианокобаламин» Folic acid+cyanocobalamin 0,10 1,13 ± 0,01 2220 ± 50 8,07 ± 0,01
Примечание. n — количество хроматограмм; P — доверительная вероятность. Note. n— number of chromatograms; P—confidence probability.
в той или иной форме присутствующих в качестве действующего вещества в некоторых поливитаминных препаратах в сочетании с фолиевой кислотой.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сравнение условий анализа фолиевой кислоты методом обращенно-фазовой ВЭЖХ показало, что все рассмотренные варианты позволяют определять фолиевую кислоту в изократическом режиме подачи подвижной фазы для представленных модельных смесей. Выявлено, что методика, предполагающая использование в качестве подвижной фазы смеси «метанол — фосфатный буферный раствор» рН 6,6 (12:88) при температуре 25 °С, колонки размером 250x4,0 мм с силикагелем октилсилильным (С8) эндкепированным (размер частиц 5 мкм) обладает рядом преимуществ: наименьшие значения относительного стандартного отклонения площади пика (RSD = 0,09%) и фактора асимметрии пика (А =
1.04) фолиевой кислоты, возможность определения в этой же системе примеси D фармацевтической субстанции фолиевой кислоты, наличие этилендиамин-тетрауксусной кислоты в составе растворителя (рН
9.5). При выборе оптимальной унифицированной методики для анализа фолиевой кислоты в препаратах можно рекомендовать вышеуказанные условия.
Вклад авторов. А. С. Алексеева — подбор и анализ материалов, написание текста статьи; М. В. Гаврилин — анализ и систематизация полученных данных; Т. Б. Шемерянкина — редактирование текста, утверждение окончательного варианта статьи для публикации; М. С. Смирнова — сбор данных литературы; Е. П. Федорова — редактирование текста публикации; Т. М. Каргина — редактирование текста публикации, О. О. Новиков — консультации, редактирование текста по экспериментальной части работы; С. А. Ковалева — выполнение экспериментальной части работы, редактирование текста; Н. Н. Бойко — выполнение экспериментальной части работы, редактирование текста. Authors' contributions. Anastasia S. Alekseeva—search and analysis of materials, preparation of the draft of the paper; Mikhail
V. Gavrilin—analysis and systematisation of the obtained data; Tatiana B. Shemeryankina—editing of the text, approval of the final version of the paper for publication, Maria S. Smirnova— compilation of literature data; Elena P. Fedorova—editing of the text; Tatiana M. Kargina—editing of the text; Oleg O. Novikov— providing consultations, editing of the practical part of the paper; Svetlana A. Kovaleva—carrying out experimental part of the study, editing of the paper; Nikolay N. Boyko—carrying out experimental part of the study, editing of the paper.
Благодарности. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00005-21-00 на проведение прикладных науч-
ных исследований (номер государственного учета НИР 121021800098-4).
Acknowledgements. The study reported in this publication was carried out as part of a publicly funded research project No. 056-00005-21-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting No. 121021800098-4).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest requiring disclosure in this article.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Слепченко ГБ, Мартынюк ОА, Шелеметьева ОВ. Разработка методик определения в грудном молоке витаминов группы В. Известия Томского политехнического университета. 2008;312(3):58-61. [Slepchenko GB, Martynyuk OA, Shelemetieva OV. Development of techniques for determining vitamins of group B in breast milk. Izvesti-ya Tomskogo politekhnicheskogo universiteta = Bulletin of the Tomsk Polytechnic University. 2008;312(3):58-61 (In Russ.)] Capelli I, Cianciolo G, Gasperoni L, Zappulo F, Tondolo F, Cap-puccilli M, La Manna G. Folic acid and vitamin B12 administration in CKD, why not? Nutrients. 2019;11(2):383. https://dx.doi. org/10.3390%2Fnu11020383
Gazzali AM, Lobry M, Colombeau L, Acherar S, Azais H, Mordon S, et al. Stability of folic acid under several parameters. Eur J Pharm Sci. 2016;93:419-30. https://doi.org/10.1016/jejps.2016.08.045 Jaszewski R, Misra S, Tobi M, Ullah N, Naumoff JA, Kucuk O, Levi E, Axelrod BN, Patel BB, Majumdar AP. Folic acid supplementation inhibits recurrence of colorectal adenomas: a randomized chemopre-vention trial. World J Gastroenterol. 2008;14(28):4492-8. https://doi. org/10.3748/wjg.14.4492
Qin T, Du M, Du H, Shu Y, Wang M, Zhu L. Folic acid supplements and colorectal cancer risk: meta-analysis of randomized controlled trials. Sci Rep. 2015;5:12044. https://doi.org/10.1038/srep12044 Berry RJ, Li Z, Erickson JD, Li S, Moore CA, Wang H, et al. Prevention of neural-tube defects with folic acid in China. China-U.S. Collaborative Project for Neural Tube Defect Prevention. New Engl J Med. 1999;341(20):1485-90. https://doi.org/10.1056/ NEJM19991 11 13412001
Ledermann JA, Canevari S, Thigpen T. Targeting the folate receptor: diagnostic and therapeutic approaches to personalize cancer treatments. Ann Oncol. 2015;26(10):2034-43. https://doi.org/10.1093/ annonc/mdv250
Narmani A, Rezvani M, Farhood B, Darkhor P, Mohammadnejad J, Amini B, et al. Folic acid functionalized nanoparticles as pharmaceutical carriers in drug delivery systems. Drug DevRes. 2019;80(4):404-24. https://doi.org/10.1002/ddr.21545
Arcot J, Shrestha A. Folate: methods of analysis. Trends Food Sci Technol. 2005;16(6-7):253-66. https://doi.org/10.1016/j. tifs.2005.03.013
10. Konings EJ. A validated liquid chromatographic method for determining folates in vegetables, milk powder, liver and flour. J AOAC Int. 1999;82(1):119-27. PMID: 10028680
11. Бендрышев АА, Пашкова ЕБ, Пирогов АВ, Шпигун ОА. Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных премиксах, биологически-активных добавках и фармацевтических препаратах методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии с градиентным элюированием. Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2010;51(4):315-24. [Bendryshev AA, Pash-kova EB, Pirogov AV, Shpigun OA. Determination of water soluble vitamins in multivitamin premixes, biologically active dietary supplements and pharmaceutical preparation by HPLC with gradient elu-tion. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 2. Khimiya = Moscow University Bulletin. Series 2. Chemistry. 2010;51(4):315-24 (In Russ.)]
12. Филимонов ВН, Сирицо СИ, Макрушин НА. Особенности хро-матографического разделения водорастворимых витаминов в изократической ОФ ВЭЖХ. Сорбционные и хроматографиче-ские процессы. 2006;6(2):191-197 [Filimonov VN, Siritso SI, Mak-rushin NA. Features of chromatographic separation of water-soluble vitamins in isocratic RP HPLC. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy = Sorption and Chromatography Processes. 2006;6(2):191-7 (In Russ.)]
13. Vahteristo L, Lehikoinen K, Ollilainen V, Varo P. Application of an HPLC assay for the determination of folate derivatives in some vegetables, fruits and berries consumed in Finland. Food Chem. 1997;59(4):589-97. https://doi.org/10.1016/s0308-8146(96)00318-4
14. Osseyi ES, Wehling RL, Albrecht JA. HPLC determination of stability and distribution of added folic acid and some endogenous folates during breadmaking. Cereal Chem. 2001;78(4):375-8. https://doi. org/10.1094/CCHEM.2001.78.4.375
15. Шинева НВ, Гаврилин МВ, Старчак ЮА, Макаров СВ. Метрологические требования к измерительному оборудованию (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2020;9(3):173-81. [Shineva NV, Gavrilin MV, Starchak YuA, Ma-karov SV. Metrological requirements to measuring equipment. Razrabotka i registratsiya lekarstvennykh sredstv = Drug Development and Registration. 2020;9(3):173-81 (In Russ.)] https://doi. org/10.33380/2305-2066-2020-9-3-173-181
ОБ АВТОРАХ / AUTHORS
Алексеева Анастасия Сергеевна, канд. фарм. наук. Anastasia S. Alekseeva, Cand. Sci. (Pharm.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6094-8990 Гаврилин Михаил Витальевич, д-р фарм. наук, профессор. Mikhail V. Gavrilin, Dr. Sci (Pharm.). Professor. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2988-8627
Шемерянкина Татьяна Борисовна, канд. фарм. наук. Tatiana B. Shemeryankina, Cand. Sci. (Pharm.). ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3720-9687 Смирнова Мария Сергеевна. Maria S. Smirnova. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0305-5934
Федорова Елена Павловна, канд. фарм. наук. Elena P. Fedorova, Cand. Sci. (Pharm.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4499-2190 Каргина Татьяна Михайловна, канд. биол. наук Tatiana M. Kargina, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3788-6338 Новиков Олег Олегович, д-р фарм. наук, профессор. Oleg O. Novikov, Dr. Sci (Pharm.). Professor. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3145-6783 Ковалева Светлана Анатольевна, канд. хим. наук. Svetlana A. Kovaleva, Cand. Sci. (Chem.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3183-4388 Бойко Николай Николаевич, канд. фарм. наук, доцент. Nikolay N. Boyko, Cand. Sci. (Pharm.), Associate Professor. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9222-2935
Статья поступила 05.04.2021 После доработки 07.06.2021 Принята к печати 20.09.2021
Article was received 5 April 2021 Revised 7 June 2021
Accepted for publication 20 September 2021
