CC BY
78
Лебедев, А.Б. Фан, Я.С. Кацнельсон и др. // Сб.: Транскраниальная электростимуляция: экспериментально-клинические исследования. - СПб., 2005. - Т.1. - С. 408-416.
6 Сеин О.Б., Сеин Б.С., Аксенов А.А. Перспективы использования ТЭС // Аграрная наука. - 2008. - №9. - С. 37-38.
Информация об авторе Михайлов Константин Александрович, аспирант кафедры терапии и акушерства ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. (4712) 53-15-55.
A NONINVASIVE METHOD OF CORRECTION OF AGE-RELATED CHANGES IN BLOOD PRESSURE IN DOGS
K. A. Mikhailov
Abstract. On the basis of a series of studies have found that transcranial electrical stimulation (TES) has an effect on blood pressure (BP) in dogs. Analysis of data obtained during the study showed that over the past 2 years, significantly increased the number of dogs at the age of 6-8 years and older admitted to outpatient appointment with the cardiovascular system and various underlying medical conditions. It is noted that this is not only the increase of livestock animals, but above all, the extension of the life of dogs, by improving detention conditions and timely treatment and preventive measures.
Key words: arterial pressure, P-endorphin, hemodynamics, blood, opioid peptides, dogs, transcranial electrical stimulation, enkephalin.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ПОЛИГЕКСОМЕТИЛЕНГУАНИДИНА ГИДРОХЛОРИДА
В МИКРОКАПСУЛАХ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ
Н.М. Наумов
Аннотация. В статье дана биохимическая характеристика действующего вещества и оболочки предлагаемых микрокапсул для ветеринарии. Проведена оценка фотоэлектроколориметрических исследований по определению количества действующего вещества в водных растворах микрокапсулированного полигексо-метиленгуанидина гидрохлорида, а также изучено влияние на оптическую плотность в данных растворах оболочки микрокапсул.
Ключевые слова: полигексометиленгуанидин гидрохлорид, гуанидины, Биопаг-Д, пектин, микрокапсу-лирование, фотоэлектроколориметрия.
Наиболее интенсивные исследования в области создания новых форм и изучения свойств полигексоме-тиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГГХ) и других ПАГов, а также совершенствование их качества, технологии получения и введения в состав различных материалов проводятся в Институте эколого-технологических проблем (г. Москва). Группой специалистов Института под руководством фактического родоначальника ПАГов Петра Александровича Гембицкого получен целый ряд новых биоцидных субстанций и препаратов на их основе (Биопаг, Фосфопаг, Экопаг, Цеопаг, Септопаг, Биокрапаг, Гембицид и др.). Среди них имеются водорастворимые или органорастворимые препараты, обладающие специфическим действием: против грибков, вирусов и бактерий, специально создан препарат с гидрофобным эффектом.
По своей химической природе гуанидиновые основания представляют собой высокомолекулярные кати-онные поверхностно-активные вещества (рисунок 1):
[~(СН2)б-КН-СН2-КН~]п
Аи+Л"
где п=20-70, А-кислотный остаток минеральной или органической кислоты.
Рисунок 1 - Химическая формула полигексаметиленгуанидина
В ветеринарной практике применяют два представителя гуанидиновых оснований: полигексаметилен-гуанидин хлорид (ПГМГ-хлорид) или Биопаг и поли-гексаметиленгуанидин фосфат (ПГМГ-фосфат) или Фосфопаг. Отличаются эти два вещества тем, что ки-
слотный остаток [А] в иминогруппе у Биопага представлен соляной кислотой, а у Фосфопага - фосфорной.
По своим химическим свойствам ПГМГ во многом повторяют свойства полиаминов и четвертичных аммониевых соединений, являются высокомолекулярными катионными полиэлектролитами.
Биоцидные свойства ПГМГ при многих химических реакциях сохраняются, поскольку гуанидиновые группировки объединены в общую полимерную цепь и в химической реакции всегда участвует лишь часть из них; при этом неизменённые группировки сохраняют новому соединению биоцидные свойства.
ПГМГ легко вступают в различные химические реакции с низкомолекулярными и высокомолекулярными соединениями с образованием как растворимых, так и сетчатых интерполимерных комплексов и ковалентно связанных интерполимеров.
Спектр биоцидного действия ПГМГ весьма широк: они эффективны против грамположительных и грамот-рицательных бактерий (включая микобактерии туберкулёза), различного рода грибов (плесневых, дрожже-подобных, дерматофитов и др.). ПГМГ одновременно воздействуют не только на аэробную и анаэробную микрофлору, но и подавляют вирусы. Препараты не только губительно действуют на широкой круг возбудителей многих болезней, но и уничтожают, например, насекомых кератофагов (личинки моли, кожееда, жука-древоточца). Установлена антимикробная активность ПГМГ по отношению к возбудителям некоторых особо опасных инфекций (сап, чума, легионеллез, грипп птиц (А Н5М).
Гуанидиновые основания адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности бактериальной клетки, блокируя тем самым дыхание, питание, транспорт метаболитов через клеточную стенку бактерий;
-макромолекулы ПГМГ диффундируют через стенку клетки, вызывая необратимые структурные повреждения на уровне цитоплазматической мембраны, нук-леотида, цитоплазмы;
-ПГМГ связываются с кислотными фосфолипида-ми, белками цитоплазматической мембраны, что приводит, к её разрыву;
-результатом этого является блокада гликолитиче-ских ферментов дыхательной системы, потеря патогенных свойств и гибель микробной клетки.
Рисунок 2 - Схема строения бактериальной клетки
Клеточная оболочка бактерии состоит из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны (рис.2.). Она обеспечивает осмотический барьер и избирательное проникновение веществ в клетку. Через клеточную стенку оболочки осуществляется вход и выход малых молекул, ферментов и экзотоксинов; на ее поверхности сгруппированы фосфатные группы липидов, а также сиаловые и тейхоевые кислоты, в результате чего бактериальная клетка несет общий отрицательный заряд.
Цитоплазматическая мембрана клеточной стенки обеспечивает постоянство внутриклеточного состава; ее поверхность является необходимым условием существования клетки.
Широкий спектр биоцидного действия ПАГов обусловлен наличием в повторяющихся звеньях макромолекул полимеров гуанидиновых группировок, являющихся активным началом некоторых природных и синтетических лекарственных средств и антибиотиков.
Установлено, что антимикробная активность ПГМГ определяется не только дозой и временем воздействия препарата, но в значительной степени зависит от структуры полимера, в первую очередь, от химической природы аниона[1].
Положительные результаты использования ПГМГГХ в ветеринарии отражены в исследованиях Наумова М.М., Жуковой Л.А., Ихласовой З.Д., Баскакова Е.В. и др.
По методике доктора химических наук А.А. Кро-левца создан микрокапсулированный препарат у которого ядром служит ПГМГГХ, а в качестве оболочки используется пектин [2].
Пектин- это полисахарид, он входит в состав зрелых фруктов и овощей [3]. Пектины способствуют нормализации обменных процессов и повышению иммунитета, связывают токсины и выводят их из организма, выявлена так же их противоопухолевая и антимикробная активность [4]. Препараты на основе пектина успешно применяют в медицине, для лечения многих заболеваний [5], а также в животноводческих хозяйствах для лечения и профилактики диспепсии у телят. Абсолютная безопасность и отсутствие побочных действий делают его совершенным средством для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней. В опытах in vitro установлено, что пектины обладают антимикробной активностью в отношении возбудителей кишечной инфекции птиц: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis , Salmonella spp, которая усиливается при повышении их концентрации с 0.5-5% и увеличения до 24 ч. времени взаимодействия с микроорганизмами, независимо от их сырьевого происхождения [6].
Самая важная особенность микрокапсул - их небольшой размер, позволяющий построить огромную рабочую поверхность. Главное их применение - это контролируемое освобождение веществ в определённом месте и времени [7].
В нашей работе представлены исследования по определению ДВ (ПГМГГХ) в микрокапсулах.
Для определения массовой доли действующего вещества (полигексаметилешуанидина гидрохлорида) были использованы следующие оборудование и реактивы: весы аналитические, обеспечивающие измерение массы с погрешностью не более 0,0002 г, фотоэлектро-колориметр ФЭК-056; колбы мерные 2-25-2. 2-100-2 по ГОСТ 1770-74; пипетки 4-1-1,6-1-5,6-1-10 по ГОСТ 20292-74; эозин-Н (индикатор) по ТУ 6-09-183-73, 0,05% водный раствор; кислота соляная, 0,1 н. водный раствор, фиксанал по ТУ 6-09-2540-72; глицин по ТУ 609-3525-73; «БИОПАГ» - образец с известным содержанием основного вещества - рабочий стандартный образец ИЭТП; натрий хлористый по ГОСТ 4233-77; вода, дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Далее готовили буферный раствор. Два исходных раствора: раствор 1 - 0,1 н. водный раствор соляной кислоты, который готовили из фиксанала; раствор 2 -0.75 г. глицина и 0.59 г. хлористого натрия растворяли в мерной колбе вместимостью 100см3 с доведением объёма дистиллированной воды до метки.
Для приготовления буферного раствора в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносили 92.5 см3 раствора 2 и объем жидкости доводили до метки раствором 1, рН буферного раствора должно быть 3,5±0,1, что необходимо контролировать с помощью pH-метра.
Приготовление стандартного раствора было следующее: навеску стандартного образца «Биопаг», содержащую 100 мг ПГМГ гидрохлорида, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в объеме дистиллированной воды, доведенном до метки. Затем 1 см3 полученного раствора помещают в мерную колбу на 100 см3 и дистиллированной водой доводят раствор до метки. 1 см3 такого раствора содержит 10 мкг полигексаметиленгуанидина гидрохлорида.
Далее производили построение калибровочного графика и проводили анализ.
Для повышения точности определения обе процедуры проводили одновременно.
Сначала из стандартного раствора готовили эталонные растворы ПГМГ гидрохлорида для построения калибровочного графика, затем - растворы анализируемых препаратов. С использованием всех этих растворов приготовляли образцы для фотометрирования и последовательно (в порядке приготовления образцов) определяли их оптическую плотность.
Эталонные растворы с концентрациями 1,2, 3 и 4 мкг/см3 готовили внесением в мерные колбы вместимостью 25 см3 1, 2, 3 и 4 см3 стандартного раствора и доводили до объёма 10 см3 прибавлением 9, 8, 7 и 6 см3 дистиллированной воды соответственно.
При анализе препарата его раствор для фотометри-рования готовили растворением точной навески препарата (от 0,05 г. до 0,20 г.) в мерной колбе вместимостью 100см3 с последующим разведением 1 см3 полученного раствора в мерной колбе до 100 см3.
В мерных колбах вместимостью 25 см3 к 10 см3 приготовленных растворов (эталонных и анализируемых продуктов) прибавляли 1 см3 раствора эозина, 10 см3 буферного раствора, и объем содержимого доводили до метки дистиллированной водой. Концентрация полигексаметиленгуанидина гидрохлорида в фотомет-рируемых образцах составляла соответственно 0,4, 0,8, 1,2 и 1,6 мкг/см3. После перемешивания все эти растворы подвергали фотометрии относительно образца срав-
нения, содержащего 1 см3 раствора эозина, 10 см3 буферного раствора и дистиллированной воды до 25 см3.
Определение оптической плотности выполняли не позднее 10 минут после внесения в пробу индикатора при длине волны 540 нм с использованием кюветы с толщиной слоя 50 мм.
С использованием полученных результатов строили калибровочный график, на оси абсцисс которого откладывали значения концентраций в фотометрируемых образцах, на оси ординат - величины оптической плотности. График прямолинеен в интервале концентраций от 0,4 мкг/см3 до 1,6 мкг/см3.
По калибровочному графику находили содержание основного вещества в фотометрируемом образце.
Далее проводили обработку полученных результатов.
Массовую долю основного вещества (Х) в процентах вычисляли по формуле:
'С хр х 100 X =---—
тх 10 ,
где С - концентрация полигексаметиленгуанидин гидрохлорида, определённая по калибровочному графику в фотометрируемом образце мкг/см3;
р - разведение, равное в данном случае 25 000;
т - масса анализируемой пробы, мкг.
За результат анализа принимали среднее арифметическое трёх параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допускаемое расхождение, равное 1,0%. Допускаемая относительная погрешность результатов анализа ±6.5% при доверительной вероятности 0.95.
Исследования проводились на кафедре физиологии и химии им. проф. А.А. Сысоева и в межфакультетской научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО Курская государственная сельскохозяйственная академия им. И.И. Иванова.
На первом этапе проведены исследования концентрации ПГМГГХ в водных растворах и построение градуировочного графика.
Приготовленный нами раствор представлял собой прозрачную жидкость по внешнему виду не отличающуюся от дистиллированной воды.
о
0.1 0.2 0.3 0.4
концентрация %
Рисунок 3 - Базовый градуировочный график оптической плотности ПГМГГХ
На втором этапе исследований проведен анализ влияния оболочки капсулы на искажение данных фотометрического определения количества ПГМГГХ.
Для этого было проведено построение градуировочного графика с нативным пектином.
Процедура пробоподготовки для пектина была следующей: навеску пектина 0.5г разводили в 0.5л дистиллированной воды, перемешивая полученный раствор в магнитной мешалке, подогревали до 39С0 в течении
получаса, до полного растворения пектина. Внешне раствор имел желтоватую окраску, опалисцировал, не имел конгломератов и включений.
Далее полученный 0.1% раствор пектина исследовался по вышеуказанной методике.
о
0.1 0.2 0.3 0.4
концентрация %
Рисунок 4 - Градуировочный график сравнительных измерений нативных пектина и ПГМГГХ
На третьем этапе проводилось исследование мик-рокапсулированного ПГМГГХ в пектине - ядро/оболочка 1:1. Процедура пробоподготовки следующая: навеску 1г микрокапсулированного ПГМГГХ разбавляют в 0.5л дистиллированной воды перемешивая раствор в магнитной мешалке, подогревая до 39 С0 в течение 30 мин. Внешне раствор имел желтоватую окраску, опалисцировал, имел взвесь из мелких полупрозрачных частиц налипающих на поверхность колбы.
Следующим этапом нашей работы являлось сравнение показателей калибровочных кривых микрокап-сулированного ПГМГГХ с раствором из нативных ПГМГГХ и пектина 1:1.
Пробоподготовка осуществлялась по вышеуказанной методике. Внешне раствор нативных ПГМГГХ и пектина имел желтоватую окраску, опалисцировал, не имел конгломератов и включений.
800 700
о
600
-О н
о 500
н ^И
S 400 I
о
¡ 300 ш
| 200
■ I I
о 100 I
о * *
0.1 0.2 0.3
концентрация %
Рисунок 5 - Сводная диаграмма оптической плотности изучаемых препаратов
Анализируя полученную сводную диаграмму (рисунок 5), можно сделать следующие выводы:
1. Нативный пектин не мешает фотометрическому определению концентрации полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГГХ) в водном растворе. Его оптическая плотность в данных концентрациях находится в пределах от 3.6 до 9.6 единиц.
2. Значения калибровочных графиков нативного ПГМГГХ и раствора нативных ПГМГГХ и пектина
близки, что говорит об отсутствии значительного взаимодействия компонентов, оказывающего влияние на измерение. Их оптическая плотность в данных концентрациях находится в пределах от 151.3/148.6 до 673/657 единиц.
3. В водном растворе микрокапсулированного ПГМГГХ в пектине (ядро/оболочка - 1:1) выход свободного ПГМГГХ составил около 60% от показателей базового градуировачного графика (рис.1), это дает основание считать, что 40% ПГМГГХ находится в микрокапсулированном связанном состоянии. Его оптическая плотность в данных концентрациях находится в пределах от 78 до 366.6 единиц
Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что при даче внутрь с водой, молоком или молозивом микрокапсулированного препарата новорожденному теленку 60% свободного ПГМГГХ будут являться активной дозой, а остальные 40% постепенно выходя из капсул, обеспечат пролонгирующий эффект.
Таким образом, полученные результаты исследований следует учитывать при подборе дозировки и разработке схемы применения микрокапсулированного Биопага-Д в пектине для профилактики острых расстройств пищеварения у новорожденных телят.
Список использованных источников 1 Полимерные биоциды-полигуанидины в ветери-нарии / М.М. Наумов, Л.А. Жукова, З.Д. Ихласова и др. - Курск: Изд-во Курск. гос. с.- х. ак., 2010. - 84 с.
2 Пат. 2561586 РФ на изобретение. Способ получения микрокапсул Биопага-Д в пектине / А.А. Кролевец, М.М. Наумов, И.А. Богачев, И.А. Брусенцев, Н.М. Наумов. -Приоритет от 12.02.2014, опубл. 27.08.2015.
3 Препарат Доксилок OR при бактериальных болезнях птиц / С.Б. Лыско, М.В. Задорожная, С.В. Новикова, О.С. Драгункина // Птицеводство. - 2014. - № 1. - С. 20-24.
4 Потиевский Э.Г., Новиков А.И. Медицинские аспекты применения пектина. — М.: Медицинская книга, 2002. — 96 с.
5 Беляев А.Г. Особенности получения пектинового препарата и функциональная характеристика его влияния на организм цыплят-бройлеров: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Курск, 2005. — 20 с.
6 Бактрицидное действие пектинов на возбудителей кишечных инфекций птиц / А.В. Портянко, С.Б. Лыско, А.П. Красников, Л.П. Волохова // Птица и птицепродукты. - 2015. -№ 3. - С.50-52.
7 Ларионова Н.И., Дюшен Д., Курве П. Разработка микро- и наносистем доставки лекарственных средств // Греф Российский химический журнал. - 2008. - №1. - С. 48-57.
Информация об авторе
Наумов Николай Михайлович, аспирант кафедры физиологии и химии им. проф. А.А. Сысоева ФГБОУ ВО Курская ГСХА.
DEFINITION OF NUMBER OF POLIGEKSOMETILENGUANIDIN HYDROCHLORIDE IN MICROCAPSULES
FOR VETERINARY SCIENCE N. M. Naumov
Annotation: The biochemical characteristic of active ingredient and a cover of the offered microcapsules for veterinary science is given in article. The assessment of photoelectrocalorimetric researches on definition of amount of active ingredient in water solutions of the microencapsulated poligeksometilenguanidin hydrochloride is carried out, and also studied the influence on optical density in these solutions of a cover of microcapsules.
Keywords: poligeksometilenguanidin hydrochloride, guanidina, Biopag-D, pectin, microencapsulation, photoelectrocalorimetry.
ОЦЕНКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ, ИЗГОТАВЛИВАЕМЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ M. BOVIS
Ю.М. Мясоедов
Аннотация. В историческом аспекте обобщены и проанализированы методы контроля туберкулинов (от альттуберклуина, до туберкулина очищенного) изготавливаемых с использованием микобактерий бычьего вида.
Ключевые слова: туберкулин, метод контроля, показатель качества.
Первым этапом при проведении диагностических исследований на туберкулёз у млекопитающих, вызванного M. bovis, является аллергическая проба, предполагающая применение аллергенов, изготовленных с использованием микобактерий бычьего вида [11,23]. Диагностическая ценность аллергической пробы в условиях животноводческих комплексов и фермерских хозяйств определяются параметрами качества туберку-линов [23], которые зависят от технологии производства [4]. В России производство микобактериальных аллергенов с использованием M. bovis в небольших объёмах начато в 1891 году в институте экспериментальной ветеринарии, с 1931 продолжается в промышленных масштабах года на Курской биофабрике [23]. При этом за период промышленного производства технология изготовления изменилась от производства препарата, содержащего балластные соединения к высокоочищен-ному варианту [13]. В свою очередь, изменения состава
и качества препаратов привели к изменениям методик при их контроле [5-9,21-23]. Принимая во внимание вышеизложенное, целью обзора являлось оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов, изготавливаемых с использованием M. bovis в России от альттуберкулина до высокоочищенного препарата.
При проведении оценки методов контроля были использованы Российская и международная нормативная документация периода 1972 - 2011гг.
Методы, используемые при описании качественных и количественных показателей туберкулинов, изготовленных из M. bovis, исторически принятые в России, представлены в таблице 1.
Методы контроля показателей качества туберку-линов делятся на 3 группы: 1. Методы контроля физических показателей (внешний вид; растворимость; однородность раствора); 2. Методы контроля химических показателей (концентрация водородных ионов (pH); массовая доля белка в сухом туберкулине; количество белка в стандартном растворе; массовая доля хлористого натрия; массовая доля фенола; массовая доля глицерина); 3. Методы контроля биологических показателей (специфическая безвредность, активность, степень активности, специфичность, стерильность, безвредность, сенсибилизирующие свойства, реактогенность, токсичность).
