Научная статья на тему 'Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами'

Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
290
67
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БЕЛКИ / ГИДРОЛИЗ / ФЕРМЕНТЫ

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Калинченко М. А., Телишевская Л. Я.

Применение гидролизатов в животноводстве имеет большое экономическое значение и помогает предотвращать распространенеи ряда инфекционных агентов (в т.ч., вероятно, и приона). Приведены результаты изучения кинетики гидролиза немясных субстратов различными ферментативными препаратами (бромелайном, гепатопанкреасом, активированной и неактивированной суспензиями поджелудочной железы.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Калинченко М. А., Телишевская Л. Я.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Determination kinetic constants of hydrolysis protein substances by different proteolytic preparations

Using in animal husbandary of hydrolisates have a high economical importance and help to prevents dissemination of some infectious agents (probably including prion). A kinetics of enzymatic hydrolis process notmeat substrates by different fermentative preparates (bromelain, hepatopancreas, activated and nonactivated suspensions of pancreas was investigated.

Текст научной работы на тему «Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами»

УДК 637.146.4

Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами

М.А. Калинченко, Л.Я. Телишевская, ФГУ «ВГНКИ» (г. Москва)

Ключевые слова: белки, гидролиз, ферменты

Сокращения: БСМ — белки сыворотки молока; ИСБ — изолят соевого белка; ПЖ — поджелудочная железа

Белковые гидролизаты являются доступным источником азотсодержащих соединений для человека и животных. По своему аминокислотно-пептидному составу гидролизаты, получаемые из источников белков естественного происхождения, аналогичны биологическим жидкостям. В настоящее время их широко используют в пищевой промышленности и животноводстве в качестве соответственно пищевых и кормовых добавок; в последнем случае — для улучшения развития молодняка и повышения продуктивности. Их применяют в медицине и ветеринарии с целью компенсации белкового дефицита, повышения неспецифической резистентности и иммунного ответа организма, в биотехнологии — для изготовления питательных сред [1].

Материалом для гидролиза служат белки животных, растений и микроорганизмов. Его осуществляют разными ферментными системами. Ранее были изучены кинетические константы гидролиза ферментами ПЖ мясного сырья: вторичных субстратов мясоперерабатывающих предприятий [2], боенской крови [3], кератинсодержащих отходов [4], мясокостного фарша [5]. В данной работе рассматривается кинетика гидролиза белков немясного сырья в соответствии

при рН 7,5. За ходом гидролиза следили по изменению рН и аминного азота (определяли методом формольного титрования). С этой целью пробы отбирали в первый час через каждые 15 мин, а затем с интервалом в 1 ч.

При изучении кинетических закономерностей ферментативного гидролиза использовали модель А.И. Костнера, С.В. Богаткова и А.Д. Неклюдова.

Основные макрокинетические константы гидролиза определяли по уравнениям [2]: 1. Vt = P/t =Vmax e—Kt; 2. LnV = ln(P/ t) = lnVmax — K.t; 3. KM = Vmax/ K. , где Р — концентрация в 1 л реакционной смеси расщепленных пептидных связей к моменту времени t, выраженная в граммах условного азота свободных аминогрупп (г-л—1), Vmax — максимальная скорость гидролиза в г-л-1-с-1 или в моль-л—1-с—1 (при определении Ea), К. — константа интенсивности процесса гидролиза пептидных связей (с—1), КМ — константа Михаэлиса (г-л—1).

Энергию активации процесса (Ea, кДж/моль) рассчитывали по уравнению Аррениуса: LnVmax = - Ea/ RT + const, где R — универсальная газовая постоянная, равная 1,987 кал/ моль.град; Т — абсолютная температура (°К).

Результаты и обсуждение

Накопление азота аминогрупп в процессе гидролиза белков БСМ и ИСБ характеризуют данные, представленные в таблице 1.

с методами, отраженными в предшествующих публикациях, посвященных этому процессу. Использование гидро-лизатов немясных белков представляет интерес в экономическом отношении, а также позволяет предотвратить распространение инфекционных агентов, в т.ч. прионов.

Цель настоящей работы состояла в сравнении активности ферментных препаратов разного происхождения для гидролиза белков немясных субстратов на основании кинетических констант процесса.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования выбрали дисперсные немясные источники белка, очищенные от жира, углеводов и растительной клетчатки, с содержанием протеинов не менее 80 % от сухого вещества: ИСБ и БСМ. 10%-й раствор ИСБ, концентрат БСМ (БСМ-1) и 40%-й раствор изолята БСМ (БСМ-2) гидролизо-вали неактивированными и термически активированными [2] суспензиями ПЖ КРС и свиней (ОАО «Самсон», г. Санкт-Петербург), гепатопанкреасом (ферментным комплексом, изготовляемым из крабов ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково) и растительным ферментом бромелайном.

Растворы белков гидролизовали 20 ч в термостате (45 °С) с перемешиванием — ПЖ при соотношении ферментных препаратов и субстрата 1:4 (по белку); гепатопанкреасом в концентрации 3 %; бромелайном — 5 % (по сухому субстрату)

1. Накопление азота аминогрупп в процессе гидролиза, (г/л)

Время БСМ ИСБ

гидролиза, ч ПЖА, БСМ-1 ПЖА , БСМ-2 ПЖ А , БСМ-2 ГП, БСМ-2 ПЖА ПЖНА ГП Б

0 3,3 3,1 3,1 3,0 2,2 2,2 2,2 1,5

0,25 4,2 3,8 4,2 4,4 2,9 2,9 2,7 1,8

0,5 4,6 4,2 4,7 4,9 3,3 3,15 2,9 2,0

0,75 5,0 4,6 4,8 5,2 3,4 3,25 3,1 2,1

1 5,3 4,9 5,1 5,5 3,6 3,45 3,3 2,2

2 6,4 5,9 5,7 6,3 4 4 3,9 2,4

3 7,5 6,8 6,2 7 4,4 4,5 4,6 2,5

4 8,5 7,3 6,7 7,4 4,6 4,9 5 2,6

5 9,3 7,9 7,1 7,9 4,8 5,1 5,4 2,7

6 9,8 8,4 7,6 8,3 5,1 5,4 5,8 2,75

20 13,4 12,1 11,3 14,7 8,05 7,7 10,2 3,2

Обозначения. Б — бромелайн; ГП — гепатопанкреас; ПЖА ПЖ; ПЖНА — неактивированная суспензия ПЖ.

активированная суспензия

Их анализ показал, что в течение 6 ч наиболее высокая степень конверсии происходила при гидролизе БСМ-1 суспензиями ПЖ. Однако БСМ-2 в течение всего процесса, а БСМ-1 - к 20-му часу гидролиза в наибольшей степени расщеплялись ферментами гепатопанкреаса.

При гидролизе белков сои гепатопанкреас также позволил получить максимальную степень конверсии.

Полученные данные, представленные в виде функции

скоростей гидролиза от времени [Р/t = f(t)], графически выражают гиперболическими кривыми. Линеаризацией этих кривых получают участки, которые можно рассматривать как отрезки прямых псевдопервого порядка (рис. 1). При этом условно выделяют 2 стадии процесса: «быструю» (первые 3 ч) и «медленную» (3...20 ч), обеспечивающие накопление приблизительно равных количеств аминного азота. На второй стадии скорость гидролиза значительно снижается, происходит насыщение системы продуктами реакции, и процесс приближается к стационарной фазе.

Представленные графики позволяют рассчитать максимальные скорости реакции и эффективное время ферментативного гидролиза: точки, соответствующие пересечению линейных отрезков при экстраполяции с осью ординат, рассматривают как максимальные скорости гидролиза (Vmax), а с осью абсцисс — как эффективное время гидролиза.

Обозначения. См. таблицу 1.

Максимальная скорость и эффективное время гидролиза

Зависимость логарифма скоростей от времени позволяет определить константу интенсивности процесса гидролиза К1, а значит, и эффективную константу Михаэлиса Км.

Рассчитанные макрокинетические характеристики гидро-

2. Макрокинетические характеристики «быстрой стадии» гидролиза белков

Фермент/ субстрат V 10-4, max ' г-л-с-1 К-10-4, с-1 Км- гл-1 Еа, кДж/ моль

ПЖА /БСМ-1 10,0 ± 0,3 3,62 2,76 22,46

ПЖА /БСМ-2 7,78 ± 0,3 2,68 2,90 22,98

ПЖНА/БСМ-2 12,2 ± 0,3 3,52 3,46 21,24

ГП/БСМ-2 15,6 ± 0,3 4,29 3,64 20,41

ПЖА /соя 7,78 ± 0,2 2,68 2,90 22,98

ПЖНА/соя 7,78 ± 0,4 4,30 1,81 24,07

ГП/соя 5,55 ± 0,5 3,94 1,41 25,39

Б/соя 3,33 ± 0,3 1,89 1,76 26,58

ПЖА /мясо [2] 3,2 ± 0,28 2,02 1,59 28,25

Обозначения. См. таблицу 1.

лиза белковых субстратов различными ферментными комплексами для «быстрой» и «медленной» стадий представлены в таблицах 2 и 3.

Как видно из таблиц 2 и 3, одни и те же ферментные системы имеют более высокие максимальные скорости и константы при гидролизе БСМ в сравнении с ИСБ, что, вероятно, связано с присутствием в ИСБ остатков ингибиторов протеаз. Протеазы ПЖ и гепатопанкреаса быстрее гидролизуют БСМ, чем ИСБ.

Ферменты ПЖ свиньи и КРС показали достаточно высокую активность. При этом активирование фермента не дало существенных результатов.

3. Макрокинетическия характеристики «медленной стадии» гидролиза белков

Фермент/ субстрат V -10-4, max ' г-л-с-1 К!-10-4, с-1 Км- гл-1 Еа, кДж/ моль

ПЖА /БСМ-1 3,89 ± 0,4 0,21 18,52 9,21

ПЖА /БСМ-2 3,43 ± 0,3 0,45 7,62 20,45

ПЖНА/БСМ-2 2,87 ± 0,3 0,38 7,55 20,99

ГП/БСМ-2 3,70 ± 0,3 0,53 6,98 20,89

ПЖА /ИСБ 2,04 ± 0,3 0,56 3,64 26,00

ПЖНА/ИСБ 2,13 ± 0,2 0,35 6,09 23,24

ГП/ИСБ 2,22 ± 0,2 0,37 6,00 23,00

Б/ИСБ 0,95 ± 0,1 0,62 1,53 32,97

ПЖА /мясо [2] 1,13 ± 0,08 0,37 3,09 32,20

Обозначения. См. таблицу 1.

______Сравнение действия разных ферментных препаратов на одни и те же источу ники белка на основании расчета максима мальных скоростей реакции показало в Время, ч «быстрой» фазе гидролиза наиболее высокую активность гепатопанкреаса для БСМ, ПЖ — для ИСБ (табл. 2); на «медленной» стадии - гепатопанкреаса для обоих белков (табл. 3).

Бромелайн не позволил получить полноценный гидроли-зат БСМ и вызывал желирование субстрата. Эта растительная протеаза проявила достаточно высокое сродство с белками сои (Км = 1,76 для быстрой стадии; 1,53 - для медленной), но имела самую низкую скорость гидролиза и наименьший выход аминного азота при наибольших затратах энергии активации (табл. 1).

Наблюдения, сделанные при изучении максимальных скоростей протеолиза и кинетических констант, подтверждаются данными по энергиям активации этих процессов: реакции с высокими максимальными скоростями имеют низкие энергии активации.

Сравнение кинетических характеристик гидролиза белков немясного происхождения ферментами ПЖ с характеристиками аналогичного гидролиза мясного сырья, проведенное нами на основании литературных данных [2, 4], свидетельствует о более высокой степени конверсии первых: большей скорости гидролиза и меньшей энергии активации.

Выводы

1. БСМ подвержены более глубокому гидролизу разными ферментными системами, чем ИСБ.

2. Из числа испытанных ферментных препаратов гепато-панкреас подвергает белки БСМ и ИСБ наиболее глубокому расщеплению в течение длительного гидролиза (20 ч), однако при краткосрочном гидролизе, принятом в производстве (5... 6 ч), ПЖ дает сравнимые с гепатопанкреасом результаты по

РВЖ СХЖ №1-2009

43

СВИНЬЯ

ферментированию белков и имеет более высокие кинетические характеристики для белков сои, что позволяет рекомендовать их применение в промышленных условиях.

3. Растительная протеаза бромелайн при гидролизе ИСБ дает наиболее низкий выход конечного продукта.

4. Белки немясного сырья в сравнении с белками мяса имеют более высокие скорости расщепления и являются перспективными для получения ферментативных гидролизатов.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. - М.: Аграрная наука, 2000. УДК 619:616.98:579.887.111

2. Бердутина А.В. Разработка технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясной промышленности. - М., 2000.

3. Евстафьева Е.А. Автореферат диссертации на соиск. уч. степени к.т.н. Разработка технологии комплексного использования боенской крови. - М., 2000.

4. Неклюдов А.Д., Бердутина А.В., Иванкин А.Н. и соавт. Определение кинетических констант гидролиза кератинсодержащего сырья. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35, 1, 45—49.

5. Баер Н.А., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. и соавт. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья убойных животных. Патент РФ № 2112397, 1999._

М.А. Kalinichenko, L.Y. Telishevskaya. Determination kinetic constants of hydrolysis protein substances by different proteolytic preparates.

Макролиды — препараты выбора для борьбы с микоплазмозами животных

И.И. Лещинский, Представительство АО «Хювефарма» (Болгария) в Москве

Ключевые слова: антибиотики, микоплазмы,птица ти-лозин

Макролиды, история применения которых в ветеринарии насчитывает уже почти 50 лет, представляют собой один из наиболее интересных и перспективных классов антибиотиков.

Основой химической структуры макролидов служит макроциклическое лактонное кольцо, к которому присоединены один или несколько углеводных остатков в виде боковых цепей. Антимикробное действие таких соединений обусловлено нарушением синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных бактерий.

Макролиды обладают уникальным комплексом фар-макокинетических свойств. Они хорошо аккумулируются в клетках многих тканей и органов, что позволяет им действовать на внутриклеточные возбудители, такие как, например, хламидии и микоплазмы, причем активность макролидов in vivo нередко бывает выше, чем in vitro [1]. В этом заключается их существенное преимущество перед бета-лактамными антибиотиками и аминогликозидами. Кроме того, макролиды способны действовать на ряд грам-положительных кокков, резистентных к пенициллинам. Несомненным достоинством макролидов является надежный профиль безопасности, что существенно отличает их, например, от тетрациклинов, также хорошо проникающих внутрь клеток.

Среди антибиотиков этого класса в ветеринарии наиболее широко применяют тилозин. Болгарские ученые получили его чистую субстанцию в 1976 г. Тилозин состоит из нескольких компонентов, основным из которых является тилозин А. От соотношения этого компонента с другими зависит эффективность и безопасность препарата [3].

Уже первые исследования тилозина, проведенные Дж.М. МакГуиром и соавт. [2], показали, что этот антибиотик проявляет высокую активность в отношении ми-коплазм. На протяжении многих лет он остается лучшим средством контроля микоплазмозов животных. Интенсивное применение тилозина в животноводстве и особенно в птицеводстве не ведет к появлению резистентных к нему штаммов микоплазм. Одним из подтверждений тому служит недавно опубликованная статья датских исследователей [4], которые протестировали 17 полевых изолятов M. sinoviae на чувствительность к наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам (рисунок). Основываясь на начальных и конечных значениях минимальной ингибирующей концентрации, они установили, что

все исследованные штаммы чувствительны к макролидам тилозину и тилмикозину. В то же время было отмечено повышение уровня резистентности этой микоплазмы к фторхинолоновым антибиотикам (рисунок). О снижении чувствительности микоплазм к применяемым в птицеводстве фторхинолоновым антибиотикам сообщали и другие исследователи [5].

El I I I

5 Энрофлоксацин ДтЬлоксзцин Тилозин Тилмикозин

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Чувствительность штаммов M. sinoviae к антибиотикам по [4]

Микоплазмы оказывают на животных иммунодепрес-сивный эффект. В частности, наблюдали снижение иммунного ответа птиц, инфицированных M. gallisepticum, на заражения вирусом болезни Марека и Haemophilus gallinarum [6, 7]. Это имеет по меньшей мере 2 нежелательных последствия: снижает интенсивность поствакцинального иммунитета у инфицированных микоплазмами животных и их резистентность к инфекционным болезням. Применение макролидов, обладающих выраженной антимикоплазмозной активностью, позволяет избежать таких осложнений. Кроме того, эти антибиотики аккумулируются в нейтрофилах в высокой концентрации, помогая последним справиться с фагоцитированными бактериями. Это обеспечивает не только непосредственное воздействие макролидов на микроорганизмы, но и стимуляцию ими экзоцитоза, что предотвращает инги-бирование рядом бактерий фаголизосомальной функции нейтрофилов [8]. Благодаря таким эффектам ряд иссле-

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.