CC BY
9химические вещества и метод фито-экстракции //Медицина Кыргызстана. - 2011. - №.2. - С. 40-42.
56. Кулданбаев Н.К., Фогт Р.Д., Арнолдуссен А., Сыдык-баев Т.Н., Окланд Т.И., Эйлертсен О., Рыскулова Г.К., Кудайбердиева Ж.К. Содержание тяжелых металлов в почве арчевыхлесов участка Гауян вблизиХайдарканского ртутного комбината //Вестник КНУ.-2012.-Спец. выпуск.
- 400-406.
57. Кулданбаев Н.К., Фогт Р.Д., Арнолдуссен А., Сыдыкбаев Т.Н., Окланд Т.И., Эйлертсен О. Эколого-гигиеническая оценка территории Сары-Челекского государственного биосферного заповедника//Медицина Кыргызстана.
- 2012. - №.8. - С. 46-53.
58. Кочкорова Ф.А. Гигиеническая оценка питания и состояния здоровья детей в детских дошкольных учреждениях г.Бишкек Автореф. дисс. на соиск уч. степени канд. мед. наук. - Бишкек, 2009. - 28 с.
59. Султашев А.Ж. Гигиеническая оценка качества водных
объектов юга Ысыккульской области. Автореф. дисс. на соиск уч. степени канд. мед. наук. - Бишкек, 2005. - 25 с.
60. СаитовЖ.К. Гигиеническая оценка качества жилой среды и состояние здоровья населения города Ош. Автореф. дисс. на соиск уч. степени канд. мед. наук. - Бишкек, 2010. - 24 с.
61. Тен Е.Е. Гигиеническая оценка транспорта, как фактора влияющего на качество среды обитания и состояние здоровья населения - Автореф. на соискание ученой степени канд. мед. наук. - Бишкек, 2008 - 24 с.
62. Шахматова А.К. Гигиеническая оценка содержания основных поллютантов в атмосферном воздухе города Бишкек//ВестникКАЗНМУ. - 2013. № 1. - С.247-250.
63. ШЫаnd T., Kuldanbaev N.K., Eilertsen O. Establishment of monitoring reference area in Kara-Koi, Osh oblast, the Kyrgyz Republic, 2005. TEMP-CA monitoring site No.1// Oppdragsrapport fra Skog og landskap (Norway, As), 04/2011: 1-42.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОТИПОВ И ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА ИММУННОДЕФИЦИТА
ЧЕЛОВЕКА I -ТИПА
Г.Т. Юлдашова, Н.Г. Кан, Н.С. Ибадуллаева
Научно-исследовательский институт вирусологии мз руз, г. ташкент, узбекистан
Генотиптерин жана адамдын I -тип иммундук жетишсиздик вирусунун штаммдарынын дарыга болгон туруктуулугун аныктоо
Юлдашова ТТ., Кан Н.Г., Ибадуллаева Н.С.
Determination of genotypes and drug resistance of HIV type-1 strains
G.T. Yuldashova, N.G. Kan, N.S. Ibadullaeva Research Institute of Virology of the Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan, Tashkent
В настоящее время, одной из важнейших проблем практического здравоохранения и всего человечества является ВИЧ-инфекция и СПИД. В течение последних двадцати лет инфекция, вызываемая ВИЧ-1, приобрела тенденцию к стремительному распространению на территориях стран СНГ. Развитие эпидемии ВИЧ-инфекции делает настоятельной необходимость широкого применения высоко активной антиретровирусной терапии (ВААРТ (HAART)) для лечения ВИЧ-инфекции.
Эффективность лечения во многом зависит от особенностей биологических свойств вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в стране. В частности, успех терапии определяется наличием в составе генома ВИЧ-1 мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к АРВ препаратам.
Информация, касающаяся генетических вариантов ВИЧ-1, имеющих мутации лекарственной устойчивости, крайне важна как для лечения инфицированных пациентов, так и для оценки эпидемиологической ситуации в популяции в целом.
Абсолютное большинство мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью
и описанных в литературе, были выявлены в составе генома ВИЧ-1 подтипа В, типичного для ВИЧ-инфицированных лиц в странах Западной Европы и Северной Америки. На основе сравнения последовательностей гена pol (polymerase) ВИЧ-1, выделенного от леченых и не леченых пациентов, инфицированных вирусом ВИЧ-1 подтипа В, были сделаны выводы о причастности этих мутаций к лекарственной резистентности (устойчивости) к АРВ препаратам.
В исследованиях, проведенных в 1997-2004 гг. в лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, показано, что в России и странах бывшего СССР наблюдается преимущественное распространение варианта штамма ВИЧ-1, принадлежащего к подтипу А (92%). Особого внимания заслуживает факт высокой степени генетической гомогенности этого варианта вируса среди разных географических регионов.
Результаты молекулярно-генетичексих исследований, проведённые в 1999-2000гг. сотрудниками НИИ Иммунологии (Зилялиева М.В., и др.) с целью
определение генотипов и лекарственной устойчивости штлммов вируса иммунодефицита
изучения генотипов и серотипов, циркулирующих на территории Узбекистана, показали, что в 63,6% случаев был идентифицирован генотип А ВИЧ-1; в 24,3% - генотип В, в 3% - генотип D, а остальные образцы, на тот момент, не удалось амплифици-ровать.
В научных исследованиях по изучению распространения Западно-Африкантских рекомбинантных форм ВИЧ-1, проведённых в г. Ташкенте (Узбекистан), в 2002-2003 гг.(Сагг JK, Nadai Y., Eyzaguirre L., Saad M.D., Khakimov M.M., Yakubov S.K., Birx D.L., Graham), из 142 собранных образцов, от ВИЧ-инфицированных пациентов - в 13 (9,2%) был выявлен GRF02_AG рекомбинантный штамм ВИЧ-1; в 2 (1.4%) - сочетание GRF02_AG с подтипом А; а в 12 (8,5%) - были выделены мозаичные, уникальные, раннее не выявленные нигде, циркулирующие рекомбинантные формы ВИЧ-1.
Относительно мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1 подтипа А и его циркулирующих рекомбинантных форм, связанных с полиморфизмом этого варианта вируса, сведений имеется очень мало.
Проблема заключается в том, что в отсутствие лечения АРВ препаратами, те же мутации могут присутствовать в составе последовательностей генома ВИЧ-1 различных генетических подтипов и вариантов, будучи следствием естественного генетического полиморфизма гена pol (5%), или, так называемой, передаваемой лекарственной резистентностью вируса. Присутствие таких мутаций в составе вирусного генома может осложнять интерпретацию результатов генотипического анализа гена pol ВИЧ-1 у леченых пациентов в случае неуспеха АРВ терапии.
Согласно рекомендациям организации WHO HIV Res Net, анализ, направленный на выявление мутаций, ассоциированных с лекарственной резистентностью ВИЧ, целесообразно проводить всем ВИЧ-инфицированным пациентам, получающим АРВ терапию, в случае, если первичная резистентность (под первичной резистентностью подразумевают частоту выявления резистентных штаммов среди циркулирующих штаммов ВИЧ в изучаемом регионе) в регионе достаточно высокая, т.е. превышает 10-15%. А если она составляет менее 5%, такая распространенность считается достаточно низкой и рекомендуется вновь оценить данный показатель через 1-2 года. В случае же, если первичная резистентность ВИЧ обнаруживается на уровне 5-10% (средний показатель), в дальнейшем необходимо проведение более расширенных исследований в этом направлении.
Основой этиотропного лечения ВИЧ-инфицированных пациентов, как указывалось выше, являются антиретровирусные препараты, благодаря которым удалось поднять уровень жизни больным ВИЧ/СПИД и снизить смертельные исходы при ВИЧ-инфекции.
Ранее АРВ терапия осуществлялась только
одним зидовудином. При этом срок выживания после клинических проявлений СПИДа продлевался, в среднем, только до 2-х лет (в отличие от 6 месяцев без лечения). На сегодняшний день, срок выживания ВИЧ-инфицированных пациентов продлевается до 10-15 лет и более.
К настоящему времени разработано значительное количество специфических антиретровирусных средств, которые по механизму действия (ингиби-рование ферментов ВИЧ) подразделяются на две группы: ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ) и ингибиторы протеазы (ИП).
Ингибиторы обратной транскриптазы, в свою очередь, подразделяются на нуклеозидные (НИОТ) и ненуклеозидные (ННИОТ).
нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы препараты (НИОТ), которые встраиваются в нуклеотидную цепочку вируса вместо стандартного нуклеозида. В результате измененной структуры тормозится образование цепочки ДНК вируса. Однако, препараты этого ряда непосредственного влияния на активность самого фермента не оказывают.
Химическая формула НИОТ практически полностью совпадает со структурой нуклеотидов вируса (это соединение молекул азотистых оснований -Аденозин, Тимидин, Цитидин, Гуанозин, Гуанидин), но в составе НИОТ, на конце, вместо ОН-группы, находится другая химическая группировка. Эти, так называемые «неправильные нуклеозиды», могут встраиваться в растущую цепочку комплементарной ДНК (кДНК) вируса, тем самым становится невозможным дальнейший рост цепочки и процесс обратной транскрипции прекращается.
ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (нниот) препараты, которые напрямую связываются с обратной транскриптазой и непосредственно блокируют ее.
В отличие от НИОТ, эти препараты непосредственно связываются с ферментом в его самом уязвимом участке, что приводит к конформации фермента, вследствие чего резко ограничивается его подвижность и тем самым замедляется процесс образования комплементарной ДНК ВИЧ.
ингибиторы протеазы (ИП) - это препараты, действие которых направлено непосредственно на активный центр протеазы.
В результате присоединения ингибитора, нарушается основная функция фермента - «нарезание» предшественника Gag-Pol на основные структурные и ферментативные полипептиды. Это приводит к образованию дефектных вирусных частиц, не содержащих полноценных белков ВИЧ и неспособных к дальнейшему заражению новых клеток - хозяина.
На сегодняшний день разработаны несколько схем АРВ терапии. Наиболее приемлемой для Узбекистана принята схема первого ряда: два препарата из группы НИОТ и один препарат ННИОТ. цель.
В связи с этим, целью нашего исследования явились молекулярно-генетические исследования направленные на изучение штаммов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Узбекистана, и выявления в них имеющихся мутаций, ассоциированных с лекарственной резистентностью к АРВ препаратам группы НИОТ и ННИОТ.
Материалы и методы
Нами была отобрана группа пациентов с подтверждённым клиническим диагнозом ВИЧ-инфекция - 24 человека, госпитализированных в НИИ Вирусологии МЗ РУз, в период с 2006 по 2008 гг. Забор крови для исследования был произведён у пациентов, перед назначением им АРВ терапии. Из собранных образцов крови была отделена плазма, а так же культуральным методом были выделены грубые лизаты мононуклеарных клеток периферической крови (лимфоцитов, PBMC).
Образцы клинического материала хранились в холодильной камере, при температуре -30°С.
Только 22 образца при помощи молекуляр-но-генетического метода удалось амплифици-ровать, а затем просиквенировать на автоматическом капиллярном сиквенаторе "Beckman Coulter", USA.
Определение мутаций, ассоциированных с устойчивостью ВИЧ-1 к АРВ препаратам, в клиническом материале, проводилось с использованием набора реагентов «АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph» (Россия), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), с последующим сиквенированием комплементарной ДНК (кДНК).
Этапы исследований:
Проведение ПЦР анализа.
Этап 1. Выделение РНК из плазмы крови.
Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции
ПЦР-амплификации - I раунд
Этап 3. Проведение ПЦР-амплификации - II раунд
Этап 4. Очистка продуктов ПЦР-амплифика-ции
Этап 5. Детекция продуктов ПЦР-амплификации методом электрофореза в агаразном геле.
Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграм-ме специфических полос амплифицированной кДНК.
Длина специфических полос амплифицирован-ных фрагментов кДНК ВИЧ составляла:
ген протеазы - 570 п.н. (пар нуклеотидов);
ген обратной транскрипции - 765 п.н.
Определение количества ДНК проводилось в агарозном геле путем сравнения с интенсивностью окраски маркера молекулярных масс.
Реакцию циклического сиквенирования, очистку продуктов сиквенирования и автоматическую детекцию сиквенса проводили согласно инструкции к набору реагентов и прибору, используемого для сиквенирования (Beckman Coulter).
Для проведения реакции сиквенирования, приготовили сиквенирующие смеси согласно инструкции к наборам для сиквенирования.
Готовились три смеси:
- смесь с праймером Pro;
- смесь с праймером Rev 1;
- смесь с праймером Rev 2.
В пробирки содержащие смесь для сиквениро-вания Pro, добавляли очищенный продукт амплификации ДНК гена протеазы (Pro).
В пробирки содержащие смесь для сиквенирования Rev 1 и Rev 2, добавляли очищенный продукт амплификации ДНК обратной транскриптазы (Rev).
Для интерпретации результатов сиквенирования ДНК ВИЧ использовали программу, разработанную в Стенфордском университете и находящуюся в свободном доступе в интернете на сайте http:// hivdb6.stanford.edu. Данная программа позволяет не только выявить мутации, ответственные за устойчивость ко всем известным антиретровирусным препаратам, но и дает генотипическую интерпретацию выделенных штаммов ВИЧ.
результаты
Мутации, обнаруженные в геноме ДНК ВИЧ - A62V, T69P/N, K70Q, с частотой встречаемости: 18,2%; 9,1%; 4,5%, соответственно, по программе международной базы данных были интерпретированы, как мутации ответственные за лекарственную резистентность ВИЧ к АРВ препаратам группы НИОТ.
Одновременно были выявлены мутации в кодоне ДНК ВИЧ L10I (9,1%) и L10V (4,5%), ассоциированные с мутациями лекарственной резистентности к препаратам ИП.
В одном образце с генотипом GRF02_AG, что составило 4,5%, были выявлены множественные уникальные мутации I13A, K14R, G16E, K20I, E35D, M36I, N37D, R41K, H69K, L89M, P14E, V35T, E36D, I135V, S162A, K173I, Q174N, D177E, T200A, Q207A.
А в образце (4,5%), с выявленным сочетанным генотипом подтипа А и GRF01_AE были обнаружены мутации в стоп-кодоне 39 и 93 гена обратной транскриптазы, и также редко встречающиеся мутации в кодонах: 13, 14, 19, 29, 40, 70, 73, 92, 95,96, 113, 119, 121. В этом же образце были выявлены мутации L10I, Т69Р, K70Q.
В собранных образцах, мутаций, ассоциированных с лекарственной резистентностью, к препаратам группы ННИОТ обнаружено не было.
Параллельно, в собранных образцах, с помощью программы Стенфордского университета в интернете, были интерпретированы результаты генотипирования штаммов ВИЧ.
Предварительные результаты нашего исследования по генотипированию показали превалирование CRF_02 AG штамма ВИЧ-1 - 68% (Circulating Recombinant Forms - рекомбинантные циркулирующие формы) (рис.1). По литературным данным,
определение генотипов и лекарственной устойчивости штаммов вируса иммунодефицита
А
9%
А + АЕ
23%
Рис. 1. Результаты генотипирования штаммов ВИЧ
100%
80%
60%
40%
20% 0%
А+АЕ
Ав
□ РК-необычные
■ НИОТ
□ ИП-малые
□ ИП-большие
■ ОТ- необычные(14)
□ ОТ-стоп кодон
Рис. 2. Сравнительные результаты генотипирования ВИЧ с мутациями с лекарственной устойчивостью
23%
77%
□ дикий штамм ВИЧ-1 ■ резистентный штамм ВИЧ -1
Рис. 3. Сравнительная оценка резистентности к АРВ-препаратам штаммов ВИЧ-1
по отношению к дикому штамму
это редко встречающимся под-подтип, некогда обнаруженный при эпидемии в Буркина - Фассо, а также в Западной Африке, Саудовской Аравии и России.
В 23% случаев было выявлено сочетание CRF_ 01 АЕ с подтипом А, данное сочетание этих двух под-подтипов является редким. Сам же под-подтип CRF_01 АЕ, как наиболее часто встречающийся под-подтип в мире, особенно на территориях Ази-
атских стран, в 80-85% случаев обнаруживается в Таиланде, в наших образцах не выделен.
В 9% случаев был определён подтип А ВИЧ-1, в 85-92% случаев циркулирующего на территории России.
Оказалось, что наибольшее число типов мутаций, причастных к лекарственной устойчивости к АРВ препаратам, принадлежат рекомбинантному штамму ВИЧ-1 CRF - 01 АЕ с подтипом А (шесть
типов мутаций), а менее резистентным штаммом оказался подтип А ВИЧ-1 (один тип). CRF - 02 AG штамм ВИЧ-1 обладал тремя типами данных мутаций
При общей интерпретации результатов исследования, была проведена так же сравнительная оценка выявленных резистентных к АРВ препаратам штаммов ВИЧ-1 по отношению к «дикому» штамму. Оказалось, что 5 (23%) больных были заражены резистентными штаммами ВИЧ-1, а 17 (77%), так называемым «диким» штаммом ВИЧ-1 (рис. 3).
Выводы
1. Предварительные полученные данные указывают на возможное существование различных, независимых друг от друга, источников заражения ВИЧ-1 в Узбекистане, в результате чего сформировались и продолжают распространяться собственные очаги ВИЧ-инфекции.
2. Дальнейшее изучение генотипов ВИЧ-1 является стратегической необходимостью для разработки новых и апробации уже известных диагностических тест-систем и лечебных антиретровирусных препаратов. Использование молекулярных тестов, предназначенных для определения вирусной нагрузки, выявления РНК или ДНК, возможно обладающих низкой чувствительностью по отношению к циркулирующим рекомбинантным формам ВИЧ-1, доминирующие в нашей стране, в дальнейшем, может приводить к появлению ложнонегативных результатов.
3. Необходимо расширить молекулярно-гене-тические исследования в области определения геномных мутаций ВИЧ, причастных к лекарственной резистентности в качестве мониторинга эффективности АРВ терапии, а так же для эпидемиологического надзора за развитием и распространением резистентных штаммов ВИЧ-1 на территории Узбекистана.
Литература
1 БобковаМ.Р., «Иммунитет и ВИЧ-инфекция» (популярные
лекции) -М.: Олимпия Пресс, 2006. -.240 с.
2 Бобкова М.Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ и лабораторные методы её определения (лекция) //Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №1. - С.25-32.
3 ВИЧ-инфекция //Информ. Бюл. - 2002. - №24. - 24 с.
4 ВИЧ-инфекция / Под общей редакцией Академика АНРУз Даминова Т.А. - Ташкент, 2010.
5 ЗалялиеваМ.В., РузыбакиевР.М. Генетические и иммунологические особенности ВИЧ-1 инфекции в Узбекистане.
- Ташкент, 2010.
6 Запорожан В.М., АряевМ.Л. ВИЧ-инфекция и СПИД. -К.: Здоровья, 2003. - С.3-55.
7 Приказ Министерства Здравоохранения Республики Узбекистан №80 «Совершенствование профилактических мероприятий и организации медико-социальной помощи в связи с ВИЧ-инфекцией в Республике Узбекистан» от 28.03.2012 года.
8 Berger P.B. The XIV International AIDS Conference: a call for action ...now // CMAJю - 2002ю - Vol.167, N 5. - P. 483484.
9 Bibollet-Ruche F., Gao F., Bailes E., et al. Complete genome analysis of one of the earliest SIVcpzPtt strains from Gabon (SIVcpzGAB2) //AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 2004.
- Vol.20. -P.1377-1381.
10 Clevenbergh P., Durant J., Halfont P. et al. //Antivir. Ther.
- 2000.- Vol.5, N1. -P.65-70.
11 Carr J.K., Nadai Y., Eyzaguirre L., Saad M.D., Khakimov M.M., Yakubov S.K., Birx D.L. Graham Outbreak of a West African recombinant of HIV-1 in Tashkent, Uzbekistan // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. - 2005. - Vol.39, N 5. - P.570-575.
12 Tebit D.M., Arts E.J. Tracking a century of global expansion of HIV to understanding and to combat disease // Lancet (infectious disease). - 2011. -N2. -P.76-89.
13 Grant A.D., De-Cock K.M. ABC of AIDS. HIV Infection and AIDS in the developing word // BMJ. - 2002. - Vol.322, N 7300. -P.1475-1478.
14 Plantier J.C., Leoz M., Dickerson J.E., et al. A new human immunodeficiency virus derived from gorillas // Nat. Med.
- 2009. - Vol.15. -P.871-872.
15 Report on global HIV/AIDS epidemic - UNADS, July, 2002
- 226p.
КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ (КЫРГ)
ЦИРРОЗ ПЕЧЕНИ - НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ
М.А. Абдукадырова, А.С. Хикматуллаева
Научно-исследовательский институт вирусологии мз руз, г. ташкент
Боордун циррозу - патогенетикалык дарылоонун айрым бир аспектилери М.А. Абдукадырова, А.С. Хикматуллаева
Liver cirrhosis - some aspects of pathogenetical treatment
M.A. Abdukadyrova, A.S. Khikmatullaeva Research Institute of Virology of the Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan, Tashkent
Вирусные гепатиты остаются важной проблемой часть населения в мире. Они являются главной здравоохранения и затрагивают значительную причиной развития цирроза, гепатоцеллюлярной
