CC BY-ND
27
МАЙ №5 (2И)
37
УДК 578.28 HIV:575.224:615.281.8 (571.1/5) о РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ В СИБИРИ МУТАЦИЙ ВИРУСА
Ц ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА, АССОЦИИРОВАННЫХ
С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АНТИРЕТРОВИРУСНЫМ Ц ПРЕПАРАТАМ
^ А.Н. Коломеец1,2, И.В. Сергеева2, В.К. Ястребов1, А.Т. Тюменцев2,
Е.С. Довгополюк2, А.Х. Нурпейсова1,3, Ю.Л. Рубина2, Л.И. Левахина2
:ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, г. Омск, Россия 2ФБУ «Сибирский федеральный окружной центр по профилактике и борьбе со СПИД» Минздрава России, г. Омск, Россия 3ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск, Россия
Изучена частота распространения мутаций, ассоциированных с устойчивостью вируса иммунодефицита человека к основным трем классам антиретровирусных препаратов у пациентов, проходящих терапию. Отмечено преобладание мутаций ВИЧ к нуклеозидным и не-нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы. При генотипировании установлено доминирование ВИЧ подтипа А1. Ключевые слова: ВИЧ; устойчивость; секвенирование.
A.N. Kolomeyets, I.V Sergeyeva, V.K. Yastrebov, A.T. Tyumentsev, Ye.S. Dovgopolyuk, A.Kh. Nurpeysova, Yu.L. Rubina, L.I. Levakhina □ THE PREVALENCE IN SIBERIA OF MUTATIONS OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ASSOCIATED WITH RESISTANCE TO ANTIRETROVIRAL DRUGS □ FSSE «Omsk Scientific Research Institute of Natural Focal Infections» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Omsk, Russia; FBI «Siberian Federal District Center for Prevention and Control of AIDS» of the Ministry of Healthcare of Russia, Omsk, Russia; SBEI HPE «Omsk State Medical Academy» of the Ministry of Healthcare of Russia, Omsk, Russia.
We studied the frequency of mutations associated with resistance of human immunodeficiency virus to the main three classes of antiretroviral drugs in patients on therapy. We marked prevalence of HIV mutations to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. The dominance of the HIV subtype A1 was established. Key words: HIV; resistance; sequencing.
Введение. В настоящее время основным компонентом лечения больных ВИЧ-инфекцией является антиретровирусная терапия (АРТ), с помощью которой удается предотвратить развитие вторичных заболеваний или добиться их регресса, предотвратить потерю трудоспособности и увеличить продолжительность жизни пациента. [4]. На эффективность АРТ оказывает влияние целый ряд факторов, в том числе наличие первичной (передаваемой) резистентности; недостаточный уровень приверженности пациента лечению и, как следствие, развитие вторичной (приобретенной) резистентности вируса иммунодефицита к применяемым лекарственным препаратам.
В основе развития лекарственной устойчивости ВИЧ лежит его способность мутировать с высокой частотой (примерно одна нуклеотидная мутация на один цикл репликации) [5, 7, 12].
У пациентов, не получающих антиретровирус-ную терапию, каждый день продуцируется 1010 вирионов, что ведет к несчетному количеству вариантов вируса, называемых квазивидами. Такая способность ВИЧ закономерно приводит к приобретению некоторых мутаций, ассоциированных со снижением чувствительности вируса к антиретровирусным препаратам (АРВП) [13]. Необходимо подчеркнуть также высокую частоту рекомбинаций между штаммами ВИЧ при суперинфекции [11]. Ранее проведенные исследования указывают также на предрасположенность ВИЧ подтипа AFSU (подтипа А, вызывающего большинство случаев заболеваний ВИЧ-инфекцией в странах бывшего СССР) к возникновению мутации G190S у пациентов, режим терапии которых включал ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы [10].
38
ЗНиСО
МАЙ №5 Ш)
Данные особенности подчеркивают важность молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции, особенно на фоне постоянного роста числа новых случаев данного заболевания.
Материалы и методы. В 2013 г. арбитражной лабораторией Сибирского федерального окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД были проанализированы 111 образцов плазмы крови, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов из нескольких субъектов РФ, входящих в состав Сибирского федерального округа (СФО).
Целью данной работы было выявление мутаций ВИЧ, ассоциированных с резистентностью к нуклеозидным (НИОТ) и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ), ингибиторам протеазы (ИП), а также анализирование режимов АРТ и приверженности лечению.
Материалы и методы. Большинство пациентов получали АРТ с необходимостью ее коррекции из-за вирусологической или иммунологической неудачи. Для выявления мутаций лекарственной устойчивости был использован набор реагентов «АмплиСенс® HIV-Resist-Seq» в соответствии с инструкцией производителя. Филогенетический анализ был проведен с помощью программы «MEGA6.0», выравнивание последовательностей произведено с использованием программы «ClustalW», в качестве референсных последовательностей были выбраны подтипы А1 и B; циркулирующие рекомбинатные формы (CRF) 63_02A1, CRF02_AG; в качестве внешней группы была выбрана последовательность ВИЧ группы O.
Результаты и обсуждение. Анализ мутаций, ассоциированных с резистентностью к АРВП. Нами было проведено выделение РНК из всех доставленных на исследование проб (111), но получить ПЦР-продукт удалось только для 85 образцов (76,6 % ± 8,0).
При анализе полученного после проведения секвенирования набора последовательностей было
установлено, что более половины (56,6 % ± 10,7) из них содержали хотя бы одну мутацию, связанную ^ с любым уровнем устойчивости к какой-либо ^ группе АРВП, а именно: половина последовательностей (50,0 % ± 10,8) содержала мутации к группе НИОТ; 37,8 % ± 10,5 - к группе ННИОТ; 4,9 % ± 4,7 - к группе ИП. =
Последовательности, содержащие мутации одновременно к нескольким группам АРВП, встречались со следующей частотой: к группам НИОТ+ННИОТ мутации были выявлены в 37,8 % ± 10,5 случаев, к группам НИОТ+ННИОТ+ИП - в 1,2 % ± 2,3. Основные выявленные мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью, представлены в табл. 1.
Таким образом, наиболее часто встречающимися мутациями были: М184У (36,4 % ± 10,4), ведущая к развитию устойчивости высокого уровня к ламивудину, эмтрицитабину и низкого уровня — к диданозину и абакавиру; 01908 (12,9 % ± 7,3), определяющая высокий уровень устойчивости к невирапину и ифавиренцу; К103М (10,6 % ± 6,7) — высокий уровень устойчивости к невирапину; Ь74У/1 (10,6 % ± 6,7) — высокий уровень устойчивости к диданозину и средний — к абакавиру; У181С (9,4 % ± 6,3), вызывающая высокий уровень устойчивости к невирапину и средний - к рилпивирину, ифавиренцу и этравири-ну. К ингибиторам протеазы мутации выявлялись в единичных случаях, что объясняется наличием высокого генетического барьера у препаратов данной группы. Принимая во внимание результаты, полученные нами ранее [2], можно сделать вывод о сохраняющейся тенденции развития мутаций, ассоциированных с резистентностью к препаратам групп НИОТ и ННИОТ.
После построения филогенетического дерева полученные последовательности кластеризовались следующим образом: подтип А1 явно доминировал, составив 73,0 % ± 9,6; на втором месте
Таблица 1. Частота выявления основных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к антиретровирусным препаратам
Мутации к НИОТ и частота их выявления, %
M41L K65R D67N L74V/I K75A/M M184V Y115F T215Y/F K219Q/E
4,7 ± 4,5 3,5 ± 3,9 7,0 ± 5,5 10,6 % ± 6,7 2,3 ± 3,2 36,4 % ± 10,4 3,5 ± 3,9 7,0 ± 5,5 4,7 ± 4,5
Мутации к ННИОТ и частота их выявления, %
K101E K103N Y181C G190A G190S
8,2 ± 5,9 10,6 % ± 6,7 9,4 % ± 6,3 2,3 ± 3,2 12,9 % ± 7,3
Мутации к ИП и частота их выявления, %
L24I M46I G48V/M I54V/I L76V V82A I84V
1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3 1,1 ± 2,3
МАЙ №5 (260
39
по частоте оказались CRF_02AG и CRF63_02A1 ^^ (25,9 % ± 9,5); подтип B был обнаружен только в ^ одном случае (1,1 % ± 2,2). Стоит подчеркнуть, что основная часть (72,7 % ± 18,9) всех последовательностей, образовавших кластер с CRF02_AG и CRF63_02A1, была получена из Новосибирской с= области. Данная закономерность прослеживается и в ряде работ других исследователей [8, 9], описывающих рост доли CRF63_02A1 в структуре подтипов, распространенных на территории Новосибирской области.
Нами также были проанализированы последовательности (69), не несущие мутаций в позиции 190 обратной транскриптазы, с целью выявления вариантов кодирования глицина (G), типичного в данной позиции для «дикого» варианта вируса (табл. 2).
Результаты показывают достоверную разницу между распространением кодонов GGC и GGG в позиции 190 у подтипа А1 и циркулирующих рекомбинантных форм 63_02А1 и 02AG (p<0,05). У подтипа А1 достоверно чаще глицин кодировался как GGC, в отличие от CRF63_02A1 и CRF02_AG, в последовательностях которых глицин в основном был кодирован как GGG. Такая особенность субтипа А1 у вируса с наличием GGC в позиции 190 обратной транскриптазы является предиктором мутации G190S, определяющей высокий уровень устойчивости к невирапину и ифавиренцу, т.к. для замены глицина на аминокислоту серин (S) в данном случае требуется только одна транзиция: GGC (глицин)^AGC (серин). Выявленная предрасположенность является особенно актуальной для пациентов, режим терапии которых включает ННИОТ. Для окончательных выводов об успешности АРТ необходимо обширное исследование с включением максимального количества пациентов, находящихся на терапии.
Анализ режимов антиретровирусной терапии и приверженности лечению. На основании выявленных мутаций был составлен профиль резистентности вируса для каждого пациента относительно препаратов группы НИОТ, ННИОТ и ИП. Высокий уровень резистентности хотя бы к одному препарату был выявлен у 51,8 % ± 10,8 пациентов. Наиболее часто высокий уровень устойчивости выявлялся к ламивудину (43,5 % ± 10,8); невирапину (37,6 % ± 10,5) и ифавиренцу (27,0 % ± 9,6), т.е. к препаратам групп НИОТ и ННИОТ. Что касается среднего уровня устойчивости, то он был наиболее частым к ифавиренцу и ставудину, по 11,8 % ± 6,9 к каждому. Что касается ингибиторов протеазы, то наиболее часто в данной группе выявлялась возможная резистентность низкого уровня к нелфинавиру (11,8 % ± 6,9).
Полученные результаты согласовывались с наиболее часто применяемыми режимами
Таблица 2. Частота использования кодонов для глицина в позиции 190 обратной транскриптазы
Кодон Подтип А1 CRF63 02A1, CRF02_AG
GGT 1,4 % ± 2,8 0,0 ± 2,7
GGC 66,7 % ± 11,3 0,0 ± 2,7
GGA 1,4 % ± 2,8 0,0 ± 2,7
GGG 1,4 % ± 2,8 29,1 % ± 10,9
Всего 71,0 % ±1 0,9 29,0 % ± 10,9
антиретровирусной терапии у обследованных пациентов на момент взятия образца для исследования резистентности: первое место занимала схема 3TC+AZT+EFV (14,6 ± 5,4 %); второе место принадлежало схеме 3TC+AZT+LPV/r (11,7 ± 4,9 %), несколько реже назначались схемы 3TC+fAZT+LPV/r (7,0 ± 3,9 %) и 3TC+ABC+LPV/r (4,6 ± 3,2 %). Таким образом, чаще всего пациентам назначались схемы, содержащие в своем составе ламивудин и зидовудин.
При анализе приверженности терапии было выявлено, что у большинства пациентов (53,0 % ± 10,8) она была средней; низкий уровень приверженности встречался немного реже (29,4 % ± 9,9). Только у 14,1 % ± 7,5 пациентов был высокий уровень приверженности терапии. У троих приверженность к лечению была неизвестна. Недостаточно высокий уровень приверженности пациента и, вследствие этого, нарушение режима приема лекарств ведет к росту популяции вируса, расширяя возможности для его эволюции, в том числе в направлении приобретения устойчивости [1, 6]. Высокий риск развития устойчивости наблюдается в основном при средних значениях приверженности пациента лечению (70—95 %), из чего следует, что более половины всех обследованных нами пациентов представляют потенциальный источник передачи устойчивых штаммов ВИЧ.
Неудаче АРТ способствует много факторов: высокий уровень вирусной нагрузки, низкий уровень лимфоцитов CD4+; наличие тяжелых вторичных заболеваний в начале лечения; изначальная резистентность вируса к применяемым препаратам; неадекватная предшествующая терапия и пр. При неэффективности схемы лечения рекомендуется ее смена в соответствии с обычными алгоритмами [3]. Частая смена схем терапии сокращает количество активных препаратов и увеличивает риск развития множественной устойчивости.
Проанализировав длительность оконченных схем терапии первого ряда (49), мы установили, что в 65,3 % ± 13,6 случаев они продолжались менее одного года; в 16,3 % ± 10,6 случаев — от одного года до двух лет, и в 18,4 % ± 11,1 случаев — два
40
ЗНиСО
МАЙ №5 (266)
года и более. При анализе завершенных схем терапии второго ряда мы получили схожую картину: у большей части пациентов (77,2 % ± 17,8) схема терапии второго ряда была прекращена в течение первого года, у 13,7 % ± 14,3 пациентов — от одного до двух лет; у 9,1 % ± 12,3 пациентов — от двух до трех лет. Таким образом, большинству пациентов схема терапии первого и второго ряда была изменена в течение первого года. Нужно подчеркнуть, что рекомендуется менять терапию по причине вирусологической неэффективности как можно быстрее для предотвращения накопления мутаций резистентности, сужающих спектр активных препаратов для применения в будущем, за исключением 3TC и FTC. [3]. Неблагоприятным является тот факт, что только небольшое количество пациентов продолжало удерживаться на начальной схеме терапии, сохраняя возможности для комбинирования препаратов в будущем. Для получения более точной картины по эффективности терапии необходимо проведение более полного и подробного исследования в перспективе.
Выводы. В образцах, взятых от пациентов, получающих АРТ, наибольшее распространение получили мутации ВИЧ (M184V, G190S), ассоциированные с устойчивостью к препаратам групп НИОТ (ламивудину) и ННИОТ (невирапину и ифавиренцу).
В регионах Сибирского федерального округа преобладал ВИЧ подтипа А1 (73,0 %), за исключением территории Новосибирской области, где доминирующими были циркулирующие реком-бинантные формы: CRF63_02A1 и CRF02_AG (72,7 %).
В исследованной популяции ВИЧ имеются предпосылки для развития мутации G190S гена обратной транскриптазы, обусловленные тем, что вирусам с кодоном GGC требуется только одна нуклеотидная замена в первой позиции для замещения глицина на серин. А поскольку GGC является наиболее часто встречающимся кодоном в данной позиции у подтипа А1, то риск развития мутации достаточно высок.
Большинство обследованных пациентов имело средний уровень приверженности терапии, что является фактором, способствующим развитию устойчивости; более чем у половины пациентов схемы терапии были изменены в течение первого года, что также сокращает спектр активных препаратов для их применения в будущем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бобкова М.Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ. М.:
«Человек», 2014. 288 с.
2. Коломеец А.Н. и др. Анализ распространенности лекарственной устойчивости ВИЧ-1 в регионах Сибирского федерального округа / А.Н. Коломеец, И.В. Сергеева //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 1 (226). С. 22—24.
3. Мазус А.И. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению ВИЧ-инфекции у взрослых / А.И. Мазус, Г.Д. Каминский, В.Н. Зимина [и др.]. М., 2014. 76 с.
4. Покровский В.В. и др. Протоколы диспансерного наблюдения и лечения больных ВИЧ-инфекцией / В.В. Покровский, О.Г. Юрин, А.В. Кравченко [и др.] //Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2012. Приложение 6. 48 с.
5. Урываев Л.В. и др. ВИЧ-инфекция — вызов человечеству. Есть ли шансы победить заболевание? / Л.В. Урываев, М.Р. Бобкова, И.А. Лаповок //Вопросы вирусологии. 2012. Приложение 1. С. 104—126.
6. Федяева О.Н. и др. Социодемографические факторы влияния на приверженность антиретровирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией / О.Н. Федяева, Н.Д. Ющук, И.П. Балмасова //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 6 (255). С. 32—35.
7. Abram M.E. et al. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication / M.E. Abram, A.L. Ferris, W. Shao, W.G. Alvord [et al.] //J. Virol. 2010. V. 84. P. 9864—9878.
8. Baryshev P.B. et al. Genetic characterization of an isolate of HIV type 1 AG recombinant form circulating in Siberia, Russia / P.B. Baryshev, V.V. Bogachev, N.M. Gashnikova //Arch Virol. 2012. V. 157. P. 2335—2341.
9. Baryshev P.B. et al. HIV-1 genetic diversity in Russia: CRF63_02A1, a new HIV type 1 genetic variant spreading in Siberia / P.B. Baryshev, V.V. Bogachev, N.M. Gashnikova //AIDS Res Hum Retroviruses. 2014. V. 30. P. 592—597.
10. Kolomeets A.N. et al. A uniquely prevalent nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutation in Russian subtype A HIV-1 viruses / A.N. Kolomeets, V. Varghese, P. Lemey, M.R. Bobkova [et al.] //AIDS. 2014. V. 28. P. F1—8.
11. Levy D.N. et al. Dynamics of HIV-1 recombination in its natural target cells / D.N. Levy, G.M. Aldrovandi, O. Kutsch, G.M. Shaw //Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. P. 4204—4209.
12. Mansky L.M. HIV mutagenesis and the evolution of antiretroviral drug resistance //Drug Resist Updat. 2002. V. 5. P. 219—223.
13. TangM.W. HIV-1 antiretroviral resistance: scientific principles and clinical applications / M.W. Tang, R.W. Shafer //Drugs. 2012. V. 72. P. 1—25.
Контактная информация:
Коломеец Анна Николаевна, тел.: 8 (960) 983-0386, е-mail: [email protected]
Contact information: Kolomeyets Anna, phone: 8 (960) 983-0386, e-mail: [email protected]
r-b
