CC BY
92
УДК 54.066
02.00.00 Химические науки
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В КОРНЕ ХРЕНА, ВЫРАЩЕННОГО В АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ В ЛЕТНЕ-ОСЕННИЙ ПЕРИОД
Капизова Альфия Манцуровна к.х.н., доцент
Садомцева Ольга Сергеевна к.х.н., доцент
Шакирова Виктория Викторовна к.х.н., доцент
Астраханский государственный университет, г. Астрахань
Реснянская Анна Станиславовна к.х.н., доцент
Астраханский государственный архитектурно-строительный университет, г. Астрахань
Статья посвящена изучению ферментов-антиоксидантов, содержащихся в корне хрена. В статье представлен подробный анализ источников информации, направленный на выяснение содержания ферментов-антиоксидантов, содержащихся в корне хрена, выращенного в Астраханской области в осенне-летний период. В ходе анализа литературы было выяснено, что содержание фермен-тов-антиоксидактов в корне хрена непостоянно и зависит от климатических условий, времени посадки и времени сбора урожая. Нами было изучено содержание антиоксидантов с использованием метода А. Н. Баха и А. И. Опарина в корне хрена, выращенного в Астраханской области в летне-осенний период. В 2 г корневища хрена содержится количество ферментов - антиоксидантов, способное за 30 мин разложить (1,547-100)/ (20-1)= 77,35 мг пероксида водорода, а за 1 мин - 2,56 мг. Так как 1мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 2 г хрена содержится 76 Е ферментов - антиоксидантов (или 38 Е в 1 г хрена). Результаты данной работы станут основой для создания и изучения нового энтеросорбента с антиоксидантными функциями. Энтеросорбент получают адсорбцией на крахмале антиоксидантов, таких как пероксида-за, каталаза и аскорбиновая кислота, из водных вытяжек растительного материала
Ключевые слова: ФЕРМЕНТЫ-АНТИОКСИДАНТЫ, КОРЕНЬ ХРЕНА, ПЕРОК-СИДАЗА, КАТАЛАЗА, ПЕРОКСИД ВОДОРОДА, АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА
UDC 54.066 Chemical sciences
QUANTITATIVE AND QUALITATIVE DETERMINATION OF ENZYMES-ANTIOXIDANTS CONTAINED IN HORSERADISH GROWN IN THE ASTRAKHAN REGION IN THE SUMMER AND AUTUMN
Kapizova Alfiya Mantsurovna Cand.Chem.Sci, docent
Sadomtseva Olga Sergeevna Cand.Chem.Sci, docent
Shakirova Victoria Viktorovna Cand.Chem.Sci, docent Astrakhan State University, Astrakhan
Resnyanskaya Anna Stanislavovna Cand.Chem.Sci, docent
Astrakhan State Architecture Construction University, Astrakhan
The article is devoted to the study of enzymes-antioxidants contained in horseradish root. The article provides a detailed analysis of the sources of information, aimed at clarifying the content of enzymes-antioxidants contained in horseradish root, grown in the Astrakhan region in the autumn and summer. During the analysis of the literature, it was found that the content of enzyme-antioxidants in the root of the horseradish is not constant and depends on climatic conditions, planting time and harvest time. The content of antioxidants in the root of horseradish grown in the Astrakhan region in the summer-autumn period was studied using by the method of A.N. Bach and A.I. Oparin. 2 g of horseradish roots contains the number of enzymes - antioxidants able to expand for 30 min (1,547 • 100) / (20 • 1) = 77.35 mg of hydrogen peroxide in 1 min - 2.56 mg. lmkmol As hydrogen peroxide is 0.034 mg, in 2 g horseradish contains 76 E enzyme -antioxidants (or E 38 1 g horseradish). The results of this work will form the basis for the creation and study of new enterosorbent with antioxidant functions. En-terosorbent prepared by adsorption on starch antioxi-dants such as peroxidase, catalase, and ascorbic acid, from aqueous extracts of plant material
Keywords: ENZYME-ANTIOXIDANTS, HORSERADISH ROOT, PEROXIDASE, CATALASE, HYDROGEN PEROXIDE, ASCORBIC ACID
Известно, что спасителями наших клеток являются антиоксиданты — группа биологически активных соединений, содержащихся в пище и нейтрализующих в организме свободные радикалы — нестабильные атомы и соединения, которые образуются в ходе нормального обмена веществ и присутствуют в окружающей среде, но, накапливаясь сверх меры, становятся опасными. Также антиоксиданты замедляют процесс старения, снижают риск возникновения у человека рака, сердечнососудистых заболеваний, мышечной дистрофии и др. Однако курение, стрессы, экология только способствуют уменьшению антиоксидантов.
Метаболизм кислорода в аэробных клетках сопровождается постоянным образованием токсичных реакционноспособных свободно - радикальных продуктов. В результате эволюции, у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных интермедиантов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках, например: су-пероксиддисмутаза (СОД) (разрушает супероксидные анион-радикалы до перекиси водорода), каталаза (восстанавливает перекись водорода до кислорода и воды) и пероксидаза (также восстанавливающая перекись водорода до воды, но с участием органических восстановителей) [1].
Угроза для клеток со стороны активных радикалов устраняется действием ряда ферментов, эффективно [2,3,4] обезвреживающих эти соединения. Первую линию защиты от свободных радикалов составляют антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза. Су-пероксиддисмутазы (металлоферменты) катализируют реакцию:
02~ + 02~+ 2Н + —► Н202 + 02 Они находятся во всех клетках, потребляющих кислород. Скорость реакции чрезвычайно высока и лимитируется только скоростью диффузии 02-. Каталитический цикл этих ферментов включает восстановление и
окисление иона металла на активном центре фермента. В организме имеется три формы СОД, содержащие медь, цинк (одна находится в цитозоле, другая экстрацеллюлярная — в эндотелии) и магний (находится в матриксе митохондрий) [4]. Супероксиддисмутаза осуществляет инактивацию радикалов кислорода, которые могут возникнуть в ходе биологических реакций переноса электронов или при воздействии металлов с переменной валентностью, ионизирующего, ультрафиолетового излучения, ультразвука, гипербарической оксигенации, различных заболеваниях.
Почти во всех животных клетках и органах определяется каталазная активность. Особенно богаты каталазой клетки печени, почек, эритроциты. Она предотвращает накопление в клетке перекиси водорода, образуемой при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов и из 02 ..
Н202 + Н202 ^02+ 2Н2О
Каталаза может разложить 44 000 молекул Н2О2 в секунду (относится к числу ферментов с наиболее высоким числом оборотов). Для расщепления большого количества перекиси водорода требуется малое количество фермента. Как и в случае супероксиддисмутазы, скорость реакции определяется диффузией и не требует энергии для активации. Каталаза преимущественно находится в пероксисомах [4], внеклеточно каталаза находится в незначительных концентрациях. Наибольшая активность ката-лазы в организме характерна для печени. К алиментарным факторам, понижающим каталазную активность, относят недостаточность витаминов группы В, фолиевой кислоты, биотина, пантотеновой кислоты, рибофлавина, витамина А. Снижение активности каталазы наблюдается при избытке метионина, тирозина, цистина, меди, цинка. В эритроцитах при высокой скорости образования перекиси водорода (1010-109 моль Н2О2 на 1 мг гемоглобина в 1 мин) преобладает активность глутатионпероксидазы, а при низкой скорости образования Н2О2 (109-107) — защитное действие оказывает в основном каталаза.
В печени, почках, нейтрофильных лейкоцитах обнаруживается пе-роксидазная активность.
Н202 + Н202 ^ 2Н2О + Я02 Миелопероксидаза в нейтрофилах окисляет ионы галогенов до свободного галогена, являющегося эффективным бактерицидным агентом. В эритроцитах, печени, хрусталике глаза имеется глутатионпероксидаза, которая содержит селен и специфично окисляет восстановленный глутатион. Как каталаза, так и пероксидаза могут утилизировать как субстраты органические гидроперекиси (например, гидроперекись этила, надуксусную кислоту). Полагают, что в животных тканях каталаза действует, как перок-сидаза.
В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов становится очевидным. Кроме того, в последние годы ферменты антиоксидантной системы представляют большой интерес для практической медицины.
Корень и препараты из хрена обладают противовоспалительными, мочегонными, раздражающими, витаминными, отхаркивающими, соко-гонными, фитонцидными, противоцинготными, болеутоляющими, проти-вомикробными и противогрибковыми свойствами. Имеются также сведения о противоопухолевом действии указанных препаратов. И все это благодаря содержанию различных ферментов-антиоксидантов.
В связи с этим изучению ферментов-антиоксидантов, содержащихся в корне хрена, посвящено достаточное количество работ.
В корне хрена присутствует гликозид синигрин (С10Н16СК8209), который под действием ферментного комплекса мизорина распадается на ал-лиловое горчичное масло, глюкозу и кислую серно-калиевую соль; а также белковое антибиотическое вещество лизоцим, углеводы (глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, сахароза, пентозаны, галактуроновая кислота, поли-
сахариды), азотистые и зольные вещества; жиры; сапонины; флавоноиды. Своеобразный вкус и запах хрена обусловлены наличием эфирных масел, в состав которых входят аллилгорчичное масло.
Содержащийся в хрене лизоцим, фермент класса гидролаз, разрушает стенки бактериальных клеток, в результате чего происходит их растворение. Лизоцим подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, оказывает противовоспалительное действие и стимулирует неспецифическую резистентность организма [5].
Другим важнейшим составляющим хрена является фермент перок-сидаза, принадлежащий к классу оксидоредуктаз, катализирующий окисление органических и неорганических соединений в присутствии перекиси водорода, которая действует как акцептор водорода, превращаясь в воду в ходе данной химической реакции. Пероксидаза, воздействуя на оболочку имеющихся в организме клеток вируса, разрушает ее, что приводит к гибели указанных клеток. Результатом является эффективное повышение неспецифической резистентности. Культивируемые в настоящее время в России сорта хрена содержат до 15 г пероксидазы на 1000 кг исходного сырья, что обеспечивает высокую эффективность содержащей его препарат биологически активной пищевой добавки.
Химический состав частей растения представлен в табл. 1.
Таблица 1.
Химический состав частей растения. Содержание основных веществ на 100 г продукта, %.
Основные вещества в мя- Витамины Минеральные
коти вещества
Вода 77 Аскорбиновая кислота 55-200 Натрий 140
Белок 2,5 в-каротин Следы Калий 579-700
Сырой белок 2,7-4,5 Тиамин (В1) 0,08 Кальций 119
Усвояемые углеводы - общие 16,3-18 Рибофлавин (В2) 0,10 Магний 36
Сахароза 30 Пиридоксин (В6) 0,7 Железо 2,03
Много крахмала Фолиевая кислота (В9) 37мкг Фосфор 70-130
Азотистые 2,73 Ниацин (РР) 0,40 Сера 212
вещества
Жиры 0,4 Хлор 18,8
Клетчатка 2,8-3 Медь 0,14
Зольные 1,4-1,5
элементы
Сухое вещество 17-32,8
Смесь эфирных и 0,34
горчичных масел
Не смотря на большой спектр ферментов, содержащихся в корне хрена, наибольший интерес вызывает пероксидаза.
Пероксидаза - один из наиболее распространенных ферментов, содержащийся в растениях, микробах, тканях животных. Этот фермент катализирует окисление широкого спектра органических соединений перокси-дом водорода с образованием токсичных пероксидов, удаляющихся из живых организмов. Пероксидаза представляет собой гликопротеид, состоящий из полипептидной цепи, формирующей двухдоменную глобулу, и ге-мовой простетической группы с атомом железа, располагающейся между доменами [6].
Введение пероксидазы хрена в пищевой рацион весьма полезно. Это обусловлено в частности (и особенно) наличием гема в структуре фермента. Хотя в литературе прямые сведения об использовании пероксидазы хрена как биологически-активной добавки встречаются редко, очевидно, что потребление пероксидаз растений человеком происходит достаточно активно.
Пероксидазы растений принадлежат к классу гем-содержащих окси-доредуктаз и используют пероксид водорода в качестве донора электронов. Пероксидаза хрена является одним из наиболее изученных ферментов этого класса [7].
В настоящее время существуют различные методы определения пе-роксидазы и ферментов-антиоксидантов: фотометрический, колориметрический, волюмометрический, электрохимический, флуоресцентный, хеми-люминесцентный и ряд более специфических.
Известно, что в водной вытяжке из корней хрена содержится значительное количество антиоксидантов, таких как пероксидаза, каталаза, витамин С, в-каротин, флавоноиды.
Содержание ферментов-антиоксидактов в корне хрена непостоянно и зависит от климатических условий, времени посадки и времени сбора урожая.
Нами было изучено содержание антиоксидантов с использованием метода А. Н. Баха и А. И. Опарина в корне хрена, выращенного в Астраханской области в летне-осенний период [8].
Содержание ферментов-антиоксидантов в корневище хрена непостоянно и зависит от климатических условий, времени посадки и времени сбора урожая.
Порядок выполнения работы. 2 г корневища хрена растирали с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 см3 воды. Для уменьшения кислой реакции добавляли на кончике шпателя карбонат кальция до
прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносили в мерную колбу и доводили объем раствора водой
33
до 100 см . Через 30 мин в коническую колбу емкостью 200 см вносили 25
33
см3 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляли туда же 20 см3 вытяжки хрена, а еще через 30 мин действие фермента прекращали прибавлени-
3
ем 5 см 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Фиксировали количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода. Одновременно ставили контроль с инактивирован-ным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 6 мин 20 см3 вытяжки хрена. К этому раствору после охлаждения добавляли 25 см3 0,1 н. перок-сида водорода. Смесь оставляли на 30 мин, после чего добавляли 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия. Фиксировали количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося количества пероксида водорода. По разности между опытным и контрольным титрованием находили количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.
Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, вели в соответствии с уравнением реакции:
5Н2О2+2КМП04+3И2804 = 2МП804+К2804+502+8И20
3
Согласно этому уравнению, 1 см 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода. Это хорошо иллюстрируется следующим примером. Из 2 г хрена приготовлена водная вытяжка объемом
33
100 см . На титрование опытной пробы (20 см вытяжки хрена) затрачено
33
9,5 см , контрольной - 18,6 см 0,1 н. раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно 18,6 - 9,5 =
3
9,1 см 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно 9,1 х 0,17=15,47 мг пероксида водорода.
В 2 г корневища хрена содержится количество ферментов - антиокси-дантов, способное за 30 мин разложить (1,547-100)/ (20-1)= 77,35 мг перок-сида водорода, а за 1 мин - 2,56 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 2 г хрена содержится 76 Е ферментов - антиокси-дантов (или 38 Е в 1 г хрена).
Результаты данной работы станут основой для создания и изучения нового энтеросорбента с антиоксидантными функциями.
Энтеросорбент получают адсорбцией на крахмале антиоксидантов, таких как пероксидаза , каталаза и аскорбиновая кислота, из водных вытяжек растительного материала.
Литература
1.Меныцикова Е. Б., Зенков Н. К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи совр. Биологии, 1993. Т. 113. №4. С.442-455 .
2. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: в 3 томах. Т.2. // М., Мир, 1981. С. 617.
3. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3-х томах. Т.3. Пер. с англ. // М., Мир, 1981. С. 726
4. .Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т.2. // М., Мир, 1985. С. 368.
5. Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage, and antioxidant therapy // Lancet, 1984. Р.1396-1398.
6. Шеремет С. А. Способ получения биологически активной дабавки. Патент на изобретение № 2452242. Заявл. 2011106642/13, 22.02.2011. 10.06.2012 Бюл. № 16.
7. Преснова Г. В., Рубцова М. Ю., Егоров А. М. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева), 2008, m. LII, № 2. С. 61.
8.Александрова Е. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Изучение пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильности к различным воздействиям // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. № 5. С. 350.
9. Филлипович Ю.Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей химии // М.: Просвещение, 1975. С. 318.
References
1. Menshchikova E.B, Zenkov N.K Antioxidanty and inhibitory radicalnih okislitel-nyh processov // Uspehi sovr. Biologii, 1993. T. 113. №4. S.442-455.
2. White, A., Hendler, F., Smith, E., R. Hill, Lehman I. Fundamentals of Biochemistry: 3, the max. V.2. // M., Mir, 1981. S. 617.
http://ej .kubagro.ru/2016/04/pdf/89.pdf
3. White, A., Hendler, F., Smith, E., R. Hill, Lehman I. Fundamentals of Biochemistry: In 3 volumes. V.3. Trans. from English. // M., Mir, 1981. S. 7264. .Lenindzher A. Fundamentals of Biochemistry:. The 3-ton
4. .Lenindzher A. Fundamentals of Biochemistry: In 3 volumes. V.2. // M., Mir, 1985.
S. 368.
5. Halliwell B.., Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage, and antioxidant therapy // Lancet, 1984. P.1396-1398.
6. Sheremet S.A. Sposop poluchenuya biologicheski aktivnoi dobavki. Patent na izo-bretenie № 2452242. zayavl.. 2011106642/13, 22.02.2011. 10.06.2012 Bul. № 16.
7. Presnova G.V. Rubtsov M.U., Egorov A.M. Electrochimicheskie biosensory na os-nove peroxidase chrena // Ros. Him. g., 2008, m. LII, № 2. S. 61.
8. Alexandrov E. U., Orlova M.A., Neiman P.L. Izuchenie peroxidaznoi activnosti v extraktax iz kornevitscha i kornei hrena i stabilnosti k razlchnim vozdeistviyam// Vest. Mosk. Univ. Ser. 2. Chemistry. 2006. T. 47. № 5. S. 350.
9. Fillipovich U. B, Egorova T.A., Sevastyanov G.A. Praktikum po obtschei himii // M .: Prosbetschenie, 1975. S. 318
