CC BY
22Профилактическая токсикология УДК 615.917
Определение эстеразной активности альбумина в токсикологическом эксперименте
В опытах in vitro количественно определена эстеразная активность человеческого и бычьего сывороточного альбумина по отношению к субстратам, используемым для определения
Введение. Сывороточный альбумин, являясь наиболее распространенным белком в человеческом организме и наиболее изученным белком сыворотки крови, выполняет множество функций, таких как поддержание коллоидно-осмотического давления крови, антиоксидантные функции, транспорт различных эндогенных и экзогенных веществ, многие из которых не растворимы в воде. Альбумин также известен как основной транспортный белок для большого количества лекарственных препаратов [1].
О способности альбумина гидролизовать соединения со сложноэфирной связью известно достаточно давно [2]. Такую активность называют псевдоэстеразной. Это связано с тем, что альбумин не является ферментом. В то же время он имеет множество сайтов ацилирования (OH группы), на которых происходит необратимый гидролиз различных субстратов, среди которых некоторые лекарственные вещества (аспирин, кетопрофен), эфиры длин-ноцепочечных и короткоце-почечных жирных кислот, фосфорорганические пестициды и нервнопаралитические агенты [3], а также субстраты, используемые для оценки эстеразной активности: фени-
активности основных эстераз сыворотки крови. Полученные данные сопоставлены с общей эстеразной активностью сыворотки крови человека и крысы и сделан вывод об условном вкладе альбумина в
лацетат, а- и Р-нафтилацетат, р-нитрофенилацетат [4].
Тирозин-411 был выявлен как сайт альбумина, ответственный за быстрое образование продукта ацетилирова-ния p-нитрофенилацетата на основании исследований методом сайт-специфического мутагенеза [5]. Масс-спектро-метрические исследования показали, что тирозин-411 является сайтом связывания для таких фосфорорга-нических эфиров как диизо-пропилфторфосфат (DFP), зоман, зарин, циклозарин, табун, дихлофос и хлорпи-рофос оксон [6]. Меченый DFP альбумин теряет быструю фазу своей эстеразной активности, что подтверждает вывод о том, что DFP и р-нитрофенилацетат связываются с одним и тем же сайтом, а именно, с тирози-ном-411 [7].
Когда Минс и Бендер одними из первых обнаружили ускоренное образование p-нитрофенола из p-нитро-фенилацетата в присутствии альбумина, они объяснили это быстрым ацетилированием альбумина, а не его гидролитической активностью [4]. Тем не менее, более 30 лет исследователи сосредотачивали свое внимание на тирозине-411 как на сайте эстеразной активности альбумина.
Шмурак В.И.
НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, г. С.-Петербург
общую эстеразную активность сыворотки по каждому из четырех субстратов.
Ключевые слова: альбумин, эстеразная активность, фос-форорганические соединения
В работе [8] методом масс-спектрометрии были выявлены 82 сайта ацетилирования на альбумине человека, среди которых 59 лизинов, 10 сери-нов, 8 треонинов, 4 тирозина и 1 аспарагиновая кислота. В этой же работе было определено время полураспада комплекса тирозин-411-ацетат, которое составило 61 ±4 часа. Другие остатки аминокислот образуют еще более стабильные комплексы. После ацети-лирования 82 остатков эсте-разная активность альбумина была практически полностью заингибирована. Таким образом, было показано, что эсте-разная активность альбумина не является результатом каталитической реакции на сайте тирозин-411, а является результатом ацетилирования 82 остатков аминокислот на поверхности альбумина. Тем не менее, в литературе нет данных, количественно характеризующих вклад альбумина в отношении гидролиза конкретных субстратов.
Ранее нами были получены результаты по эстеразной активности бычьего сывороточного альбумина (БСА) по отношению к основным субстратам эстераз крови [9]. Целью данной работы была количественная оценка эсте-разной активности альбумина в сыворотке крови человека и
Токсикологический вестник n°2 (107)
Таблица 1
Значения активности ЧСА (42мг/мл) и контрольной человеческой сыворотки по исследуемым субстратам.(Данные представлены в форме М±БР).
субстрат Активность, мкмоль-мин'Чл-1 Условный вклад в активность, %
человеческая сыворотка ЧСА, [42 мг/мл]
НФА 651±15 265±12 41
ФВ 239±10 36±5 15
АТХ 2410±38 32±4 1,3
БТХ 4803±55 27±2 0,6
крысы по отношению к ацетил-тиохолину (АТХ), бутирилти-охолину (БТХ), которые являются наиболее специфичными субстратами для определения собственной ферментативной активности ацетилхолинэсте-разы (АХЭ) и бутирилхолинэ-стеразы (БХЭ), соответственно, а также по отношению к р-нитрофенилацетату (НФА) и фенилвалерату (ФВ), которые используются для определения активности кар-боксилэстеразы (КЭ) и нейротоксиэстеразы (НТЭ), соответственно.
Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали венозную кровь здоровых людей и кровь крыс-самок, полученную после де-капитации животных. Для получения сыворотки кровь выдерживали при комнатной температуре в течение часа, а затем центрифугировали 20 мин при 3000g. Содержание альбумина в сыворотке человека и крысы определяли методом с бромкрезоловым зеленым на автоматическом биохимическом анализаторе Biocode Hycel Lisa 300 Plus.
В качестве образца сравнения использовали растворы БСА и альбумина человека (ЧСА, Sigma) в фосфатном буферном растворе.
Определение эстеразной активности по отношению к
БТХ и АТХ производили с помощью планшетного варианта метода Эллмана [10]. Этот метод основан на расщеплении субстрата с образованием тиохолина, который при взаимодействии с 5,5/-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБ), так называемым реагентом Эллмана, образует окрашенный продукт.
В лунку 96-луночного планшета вносили 180 мкл ФБ и 10 мкл исследуемой пробы. Каждую пробу измеряли в тройном повторе против холостой пробы. Далее в каждую лунку добавляли по 80 мкл раствора, содержащего ДТНБ (0,8 мг/ мл) и БТХ или АТХ (20 мг/мл) в соотношении 9:1. Планшет инкубировали в течение 10 минут при температуре 37°С, после чего проводили измерения величины абсорбции при длине волны 405 нм (Thermo Scientific Multiskan FC microplate photometer). Расчет активности производили по формуле :
А = У/(е ' l ' v) ' (DE/Dt) = [ мкмоль-мин-1-л-1], (1)
где У - объем реакционной смеси, л , v - объем образца, л, (DE/Dt) - изменение экс-тинкции за 1 минуту, l - толщина поглощающего слоя, см, е - коэффициент микромолярной экстинкции 2-нитро-5-меркаптобензоата (0,0137).
Активность относительно НФА определяли спектро-
фотометрически (405 нм) по накоплению нитрофенола образующегося в результате гидролиза НФА. В лунку 96-луночного планшета вносили 165 мкл ФБ и 10 мкл исследуемой пробы. Каждую пробу измеряли в тройном повторе против холостой пробы. Далее в каждую лунку добавляли по 5 мкл раствора субстрата НФА в этаноле (50мМ). Планшет инкубировали в течение 10 минут при температуре 37°С, после чего проводили измерения величины абсорбции при длине волны 405 нм. Расчет активности производили по формуле (1), где е - коэффициент микромолярной экстинкции нитрофенола (0,01845).
Активность относительно ФВ определяли по методу Джонсона (492 нм) [11]. В лунку 96-луночного планшета вносили 75 мкл раствора субстрата (фенилвалерата) и 15 мкл исследуемой пробы. Планшет инкубировали в течение 10 минут при температуре 37°С, затем в каждую лунку добавляли по 75 мкл раствора БББ 10% и 4-Аминоантипирина и 37,5мкл красной кровяной соли и проводили измерение при длине волны 492 нм. Каждую пробу измеряли в тройном повторе против холостой пробы. Расчет активности производили по формуле (1), где е - коэф-
фициент микромолярной экс-тинкции фенола (0,0139).
Результаты и обсуждение.
Для понимания вклада альбумина в эстеразную активность сыворотки крови человека, а, значит, и его роли в возможном искажении данных при определении активности хо-линэстераз, НТЭ и карбок-силэстеразы, был проведен эксперимент, в котором мы оценивали активность ЧСА относительно субстратов, которые обычно используются для определения активности эстераз крови. Полученные значения сравнивали с эстераз-ной активностью сыворотки крови относительно этих субстратов. Концентрация ЧСА в модельном растворе была взята исходя из содержания альбумина в человеческой сыворот-
ке. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Из представленных данных видно, что наибольшая эстеразная активность ЧСА, а также условный вклад в ферментативную активность человеческой сыворотки наблюдается относительно гидролиза НФА и ФВ. Активность относительно АТХ и БТХ невелика. Высокий процент условного вклада альбумина в активность сыворотки относительно НФА связан с тем, что в человеческой сыворотке отсутствует карбоксилэстераза, и НФА расщепляется в основном бутирилхолинэстеразой, альбумином и параоксоназой [12].
В силу недоступности выделенного крысиного альбумина, для оценки вклада кры-
синого альбумина в общую эстеразную активность сыворотки крысы были взяты два модельных раствора альбумина: раствор БСА с концентрацией равной концентрации альбумина в крысиной сыворотке (50мг/мл) и раствор ЧСА с концентрацией 25 мг/ мл. Первичная структура человеческого и бычьего сывороточного альбумина схожа на 76% [13], однако, известно, что ЧСА имеет большую эстеразную активность по отношению к НФА чем БСА [14]. Данных по эстеразной активности сывороточных альбуминов различных млекопитающих по отношению к другим субстратам не обнаружено. Результаты этой части эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2
Значения активности контрольной крысиной сыворотки, ЧСА (25мг/мл) и БСА (50мг/мл) по исследуемым субстратам. (Данные представлены в форме М±БР; п - количество измеренных образцов сыворотки крыс)
субстрат Активность, мкмольмин'1^'1 Условный вклад в активность, %
крысиная сыворотка ЧСА, [25 мг/мл] БСА, [50 мг/мл] ЧСА, [25 мг/мл] БСА, [50 мг/мл]
НФА 975±38 (n=20) 175±5 217±4 17,9 22,3
ФВ 816±22 (n=6) 28±3 63±4 3,4 7,7
АТХ 350±30 (n=10) 15±2 27±3 4,3 7,7
БТХ 139±34 (n=25) 21±2 20±2 15,1 14,4
Из представленных данных видно, что условный вклад ЧСА (25 мг/мл) в эстеразную активность крысиной сыворотки по отношению к НФА и БТХ практически не отличается от аналогичного вклада БСА (50 мг/мл), при том что концентрации отличаются в 2 раза. В то же время активности по ФВ и АТХ отличаются почти в 2 раза, что соответствует различию концентраций.
Острое отравление фос-форорганическими соединениями сопровождается уг-
нетением ферментативной активности эстераз крови. В наших экспериментах по определению активности АХЭ и БХЭ после острого отравления (2 х 0.4LD50) экспериментальных животных зоманом, активность АХЭ подавлялась на 80-90%, а активность БХЭ на 50% [15].
Таким образом, относительный вклад альбумина в эсте-разную активность сыворотки крови может оказаться довольно существенным и привести к получению ложноотрицатель-
ного ответа при оценке эсте-разного статуса после острого отравления ФОС. В особенности это утверждение справедливо при оценке активности БХЭ в сыворотке крови крыс.
Выводы. В результате проделанной работы было показано, что наибольшая эстеразная активность альбумина человека, а также условный вклад в ферментативную активность сыворотки наблюдается относительно гидролиза нитрофе-нилацетата и фенилвалерата при сравнении с сывороткой
Токсикологический вестник м°2 (107)
человека. Сравнение эстераз- няется отличиями в структуре
ной активности ЧСА и БСА белков.
показало различия в актив- Дальнейшая работа будет ности по отношению к НФА направлена на определение кии БТХ, что, очевидно, объяс- нетических параметров фер-
Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. T. Peter Jr. All About Albumin, Biochemistry, Genetics, and Medical Applications: Academic Press, San Diego, 1996.
2. Tildon J.T., Ogilvie J.W. The esterase activity of bovine mercaptalbumin. The reaction of the protein with p-nitrophenyl acetate // J. Biol. Chem. -1972. - Vol. 247. - P. 1265-1271;
3. Sogorb M.A., Carrera V., Vilanova E. Hydrolysis of carbaryl by human serum albumin. // Arch. Toxicol. - 2004. - Vol. 78. - P. 629-634;
4. Means G.E., Bender M.L. Acetylation of human serum albumin by p-nitrophenyl ac-etate.// Biochemistry. - 1975. - Vol. 14. - P. 4989-4994;
5. Watanabe H., Tanase S., Nakajou K., Maruyama T., KraghHansen U., Otagiri M. Role of Arg-410 and Tyr-411 in human serum albumin for ligand binding and esterase-like activity. // Bio-chem. J., 2000. - V.349. - P.813-819.
6. Li B., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Mas-son P., Lockridge O. Matrix-assisted laser de-sorption/ionization time-of- flight mass spectrometry assay for organophosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr411 // Analytical Biochemistry. 2007. 361:263-272.
7. Means G.E., Wu H.L. The reactive tyrosine residue of human serum albumin: characterization of its reaction with diisopropylfluorophosphate. // Arch. Biochem. Biophys. 1979. - V.194, 526-530.
8. Lockridge O., Xue W., Gaydess A., Grigoryan H., Ding S.-J., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Mas-son P. Pseudo-esterase Activity of Human Albumin. // J. Biol. Chem., 2008. - V.283. - № 33. - P.25582-25590.
9. Шмурак В.И., Надеев А.Д., Прокофьева Д.С., Гончаров Н.В. Исследование эстеразной активности сывороточного альбумина // В сб. «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях». Труды всероссийской научно-практической конференции. 27-28 мая 2010г., СПб. - С.246-248.
10. Ellman G., Courtney D., Andres V. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. -1961. - V.7 - P.88-95.
11. Johnson M.K. Improved assay of neurotoxic esterase for screening organophosphates for delayed neurotoxicity potential. // Arch. Toxicol. -1977. - V.37 - P.113-115.
12. Li B., Sedlacek M., Manoharan I., Boo-
ментативной активности альбумина и комплексную оценку его ферментативных и транспортных функций, учитывая видовую специфичность.
pathy R., Duysen E.G., Masson P., Lockridge O. Butyrylcholinesterase, paraoxonase, and albumin esterase, but not carboxylesterase, are present in human plasma. // Biochem. Pharmacol. - 2005. - V.70. - №11. - Р.1673-1684.
13. Huang B.X., Kim H.Y., Dass C. Probing three-dimensionalstructure of bovine serum albumin by chemical cross-linking and mass-spec-trometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2004. -V.15. - P.1237-1247.
14. Sakurai Y., Ma S.F., Watanabe H., Ya-maotsu N., Hirono S., Kurono Y., Kragh-Hansen U., Otagiri M. Esterase-like activity of serum albumin: characterization of its structural chemistry using p-nitrophenyl esters as substrates. Pharm. Research, 2004. - V.21. - № 2. - P.285-292.
15. Надеев А.Д., Шмурак В.И., Глашкина Л.М., Войтенко Н.Г. Исследование эстераз-ной активности крови крыс в динамике после острого отравления фосфорорганическими отравляющими веществами // В сб. «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях». Труды всероссийской научно-практической конференции. 27-28 мая 2010г., СПб. - С. 217-219.
Shmurak V.I.
Determination of the albumin esterase activity in a toxicological experiment
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, St.Petersburg
The esterase activity of human and bovine serum albumin was quantitavely determined in experiments " in vitro" in relation to substrates used to determine the activity of the main blood serum esterase. Results obtained were compared with a general esterase activity of human and rat blood serum and a conclusion was drawn about an arbitrary contribution of albumin to the general esterase activity for every four substrates.
Материал поступил в редакцию 26.11.2010 г.
