CC BY
23СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
68. Mochizuki H. et al. //Gene. — 1998. — V 213. — P. 149-157
69. Draganov D.I., La Du B.N. // Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. — 2004. — V 369.-No.1. — P. 78-88
70. Brophy V.H. et al //Am.J.Hum.Genet. — 2001.- V. 68. — No. 6. — P. 1428-1436
71. Suehiro T. et al. //Atherosclerosis. — 2000. — V. 150. — P.295-298
72. Costa L.G. et al //Annu.Rev.Med. — 2003. — V. 54. — P.371-392
73. Davies HG, Richter RJ. etal //Nat Genet. — 1996. — V. 14. -P. 334-336
74. Li WF, Costa LG, et al //Pharmacogenetics. — 2000. — V 10. — P.767-779
75. Mackness B, Durrington P. et al// Pharmacogenetics. — 2003. — V 13. — P.81-88
76. Mackness B, Davies GK, et al //ArteriosclerThrombVasc Biol. — 2001. — V. 21. — P.1451-1457
77. Gur M, Aslan M, et al //Eur J Clin Invest. — 2006. — V. 36. -P.779-787
78. Sentí M, Tomás M. et al //ArteriosclerThrombVasc Biol. — 2001. — Mar. — V 21. — P.415-420
79. Nagila A., Permpongpaiboon T.et al.// Pharmacol. Rep. — 2009. -V.61. — No.5. — P.892-898
80. Gouédard C., Koum-Besson N.et al // Mol. Pharmacol. — 2003. — V.63. — No.4. — P.945-
956
81. Shihetal.//J. Clin. Invest. — 1996. -V97. — No.7. — P.1630-1639
82. Rao M.N., Marmillot P.et al // Metabolism. — 2003. -V52. -No.10. — P.1287-1294
83. Gouédard C.et al// Mol. Cell. Biol. — 2004. — V. 24. — No. 12. — P.5209-5222
84. Jaichander P., Selvarajan K.et al. // J. Lipid. Res. — 2008. -V49. — No.10. — P.2142-2149
85. Dong Wu, Yang Li. et al. //The FASEB Journal -2009. -V. 23. — P. 1441-1446
86. Tsuchida S. et al. //Hum.Genet. — 1994. — V. 93 — P.255-258
87. Hopkinson D.A. et al. //Ann.Hum.Genet. — 1973. — V 37. — P. 119-137
88. Sparkes R.S. et al. //Science. — 1983. — V 219. — P.971-973
89. Okunoki Y. et al //Mol. Vis. — 2008. — V. 14. — P.1094-1104
90. Fasano M, Curry S. et al. //IUBMB Life. — 2005. — V. 57. — P.787-796
91. Ascenzi P, Bocedi A. et al. //Mini Rev Med Chem. — 2006. — V 6. — P. 483-489
92. Ascenzi P, Fasano M. //Biophys Chem. — 2010. — V. 148. -P.16-22
93. Ghuman J, Zunszain PA. et al. //J Mol Biol. — 2005. — V. 353. — P.38-52
94. Casida J.E., Augustinson K.B. //Biochim.Biophys.Acta. — 1959. — V 36. — P.411-426
95. Tove S.B. //Biochim. Biophys. Acta. — 1962. — V 5. — P.230-235
96. Tildon J.T., Ogilive J.W. //J.Biol.Chem. — 1972. — V. 247. — P.1265-1271
97. Means G.E., Bender M.L. //Biochemistry — 1975. — V 14. -P. 4989-4994
98. Rainsford K.D. et al. //Eur.J.Clin.Investg. — 1998. — V. 10. -P. 413-420
99. Dubois-Presle N. et al. //Mol.Pharmacol. — 1995. — V 47. — P.647-653
100. Kwon C.H. et al. //Canser Res. — 1987. — V 47. — P.1505-1508
101. Salvi A. et al. //Drug Metab. Dispos. — 1997. — V 25. -P.395-398
102. De Vriese C. et al. //Endocrinology. — 2007. — V. 148. — P.2355-2362
103. Manoharan I., Boopathy R. //Arch BiochemBiophys. -2006. — V 452. — P. 186-188
104. Masson P. et al. J. //Enzyme Inhib. Med. Chem. — 2007. — V 22. — P.463-469
105. Sogorb M.A. et al. //Arch. Toxicol. — 1998. — V 72. — P.219-226
106. John H. et al. //Anal.Bioanal.Chem. — 2010. — V. 398. — P.2677-2691
Kurdyukov I.D., Shmurak V.I., Nadeyev A.D., Voitenko N.G., Prokofyeva D.S., Goncharov N.V. «Esterase status» of the organism at exposure to toxic substances and pharmaceutical preparations
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology of St.Petersburg
«Esterase status» is an important indicator characterizing individual responses of the organism to organophosphorous compounds (Ops) exposure. More and more data are being accumulated in relation to its adequate interpretation taking into account a number of additional toxic and pharmacodynamic factors. The analysis of recent reference data related to this issue is presented in the article. Proposals to extend the range of indicators characterizing the «Esterase status» is laid down.
Материал поступил в редакцию 01.12.2012 r.
УДК 577.112.824 : 615.917
Исследование связывания зомана с альбумином методами молекулярного моделирования
Белинская Д.А., Шмурак В.И., Прокофьева Д.С., Гончаров Н.В.
Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова, РАН
ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, г С.-Петербург
етодами молекулярного моделирования произведена оценка взаимодействия зомана с двумя тирозиновы-ми сайтами связывания на поверхности альбумина: Туг-411 и Туг-150. Методом молекулярного докинга охарактеризованы процессы связывания четырех стереоизомеров зо-мана в двух сайтах связывания альбумина и проведена оценка влияния соседних аминокислотных остатков на эффективность связывания. Методом молекулярной динамики проверена стабильность комплексов между альбумином и зоманом.
Ключевые слова: альбумин, зоман, фосфорорганические отравляющие вещества, молекулярное моделирование, до-кинг.
Введение. Альбумин является самым распространенным белком плазмы крови. В отличие от большинства белков плазмы альбумин не имеет карбогидратной оболочки, что делает его аминокислотные остатки более доступными для взаимодействия с ксенобиотиками. До некоторых пор альбумин считался транспортным белком, однако в 1972 году было установлено наличие эстеразной активности альбумина по отношению к р-нитрофенилацетату [1], и белок был включен в перечень ферментов с шифром КФ 3.1.1.55. Таким образом, на сегод-
няшний день альбумин отнесен к классу гидролаз, подклассу эстераз (3.1.), подподклассу гидролаз карбоновых кислот (3.1.1.). Классическими представителями подподкласса являются карбоксилэстераза (КЭ, КФ 3.1.1.1), ацетилхолинэстераза (АХЭ, КФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстераза (БХЭ, КФ 3.1.1.8).
При рассмотрении гидролитической активности альбумина необходимо разделять ферментативную активность данного белка и его способность ковалентно связывать субстраты. В первом случае происходит связывание субстрата с «актив-
ным центром» альбумина с последующим распадом комплекса на фермент и продукт. Во втором случае происходит необратимое связывание субстрата с аминокислотными остатками на поверхности альбумина. Такую активность называют псев-доэстеразной. Характерный пример псевдоэстеразной активности альбумина — ацетилирование. В ходе ацетилирования убыль субстрата обусловлена не его гидролизом, а образованием ковалентных связей между молекулами субстрата и многочисленными аминокислотными остатками на поверхности альбумина. В различных работах была показана псевдоэстеразная активность альбумина по отношению к ряду субстратов: на-фтилацетату и фенилацетату [2], эфирам жирных кислот [3], нитрофенилацетату [1, 4], аспирину [5], глюкурониду кетопро-фена [6], циклофосфамиду [7], эфирам никотиновой кислоты [8], октаноилгрелину [9], нитроацетанилиду [10], нитротриф-торацетанилиду [11]. Обнаружение псевдоэстеразной активности альбумина послужило основанием к изучению взаимодействия с ним таких токсических веществ как инсектициды, относящихся к группе фосфорорганических соединений. Было показано, что альбумин способен связывать следующие фос-форорганические эфиры: тиофос, параоксон [12], зоман, зарин [13], циклозарин, табун [14] и RVX.
Зоман — высокотоксичное фосфорорганическое отравляющее вещество (ФОВ) нервно-паралитического действия, представляющее собой пинаколиловый эфир метилфторфос-фоновой кислоты. При попадании в организм зоман и другие ФОВ током крови транспортируются к своим специфическим мишеням, одновременно взаимодействуя с неспецифическими мишенями. Исследования токсикокинетики ФОВ у различных животных показали, что она имеет нелинейный вид [15]. Активным участником токсикокинетики зомана у грызунов является КЭ. Установлена прямая зависимость величины LD50 для зомана при подкожном введении от концентрации КЭ в сыворотке крови различных животных. У человека КЭ в плазме крови отсутствует, поэтому основным неспецифическим связывающим агентом может выступать альбумин. Для подтверждения данной гипотезы изучали механизмы взаимодействия зомана с альбумином и определяли кинетические параметры этого взаимодействия.
Методами масс-спектрометрии на примере p-нитрофенилацетата показано наличие 82 сайтов ацетилирования альбумина, из них 59 лизинов, 10 серинов, 8 треонинов, 4 тирозина (Туг) и 1 аспартата [16]. Было установлено, что р-нитрофенилацетат проявляет наибольшее сродство к Туг-411 [17]. Высокая реакционная способность Туг-411 по сравнению с остальными тирозиновыми аминокислотными остатками, находящимися на поверхности молекулы альбумина, обусловлена влиянием А^-410. А^-410 находится в непосредственной близости к фенольному кислороду Туг-411, что приводит к повышению нуклеофильной активности последнего. Функциональная значимость Туг-411 и А^-410 подчеркивается их высокой консервативностью в альбуминах млекопитающих [18].
Масс-спектрометрические исследования показали, что Туг-411 является также сайтом связывания для таких фосфорорга-нических эфиров как зоман, зарин, циклозарин и табун [14]. Однако не исключается возможность существования дополнительных сайтов фосфорилирования альбумина различными ФОВ [19], так как с помощью масс-спектрометрических методов можно установить лишь некоторые сайты связывания альбумина с ФОВ и оценить данные методы могут только псевдо-эстеразную активность белка. Истинные фермент-субстратные ковалентные комплексы быстро распадаются в ходе ферментативной реакции и не поддаются детектированию методами масс-спектрометрии. В работе Li et а1. [19] взаимодействие альбумина с Туг-411 оценивали с помощью масс-спектрометрии и путем определения количества высвобождающихся ионов фтора в растворе зомана в присутствии и в отсутствии альбумина. Показано, что фосфорилирование альбумина зоманом по сайту Туг-411 идет очень медленно (константа скорости 15 М"1мин"1), спонтанная реактивация (фосфотриэстеразная активность альбумина) также происходит чрезвычайно медленно (0,0044 ч-1), так что образовавшийся аддукт довольно стабилен
(t1/2 = 6,5 суток). Однако по количеству образуемого в ходе фос-форилирования альбумина фторид-иона была обнаружена некая дополнительная гидролитическая активность альбумина, объяснение которой не найдено и количественный вклад которой не оценен должным образом. Это позволяет сделать предположение, что Tyr-411 ответственен в основном за псевдоэ-стеразную активность альбумина по отношению к зоману, в то время как ферментативный гидролиз зомана происходит в другом сайте или сайтах альбумина. На эту роль в первую очередь претендует Tyr-150, так как масс-спектрометрическими методами был обнаружен аддукт вещества типа VX с альбумином по Tyr-150. Показано, что Tyr-411 образует устойчивые кова-лентные аддукты преимущественно с ФОВ G-типа (зарин, зоман) по сравнению с агентами V-типа (RVX) и наоборот, Tyr-150 лучше взаимодействует с агентами V-типа [20]. В работе Li et al. [19] с помощью программ Autodock 3.0.5 и Gold 3.1 была исследована специфичность гидролитической активности альбумина по отношению к четырем стереоизомерам зомана. В своей работе авторы использовали два варианта кристаллической структуры белка — 2BXH (комплекс белка с индоксилом) и 2BXD (комплекс белка с варфарином) с предварительно удаленными молекулами воды и лигандов. При этом докинг проводили только в сайте связывания «Tyr-411». Метод молекулярной динамики в этой работе не применялся. В результате данные, полученные программами Autodock и Gold применительно как к обеим структурам (2BXH и 2BXD), оказались схожи как по пространственному расположению атомов, так и по рассчитанным значениям свободных энергий взаимодействия. На сегодняшний день работа Li et al. [19] является единственной, в которой применялись методы молекулярного моделирования для изучения процесса взаимодействия зомана с альбумином.
В настоящей работе мы исследовали взаимодействие альбумина с зоманом методами молекулярного моделирования. Известно, что для продуктивного связывания молекул субстратов и необратимых ингибиторов в активном центре холинэстераз необходима активация аминокислот каталитической триады, а именно переход протона с гидроксила серина на имидазольное кольцо каталитического гистидина [21]. Мы предположили, что аналогичный перенос протона необходим и при связывании зомана с альбумином. С помощью метода молекулярного докинга c применением программы Autodock 4.0 были изучены процессы связывания четырех стереоизомеров зомана в двух возможных сайтах связывания альбумина — «Tyr-411» и сайт «Tyr-150» в неактивированном и активированном состоянии. В качестве акцепторов протона были приняты Lys414 и His242 для сайтов «Tyr-411» и «Tyr-150» соответственно. Стабильность полученных комплексов была проверена методом молекулярной динамики c использованием пакета Gromacs.
Материалы и методы исследования. Молекулярный до-кинг лигандов в активные центры альбумина проводили с помощью программного пакета Autodock 4.0 [22]. При расчетах использовали параметры силового поля AMBER [23]. В расчетах использовали ламарковский генетический алгоритм [22]. Энергию системы представляли в виде суммы энергии ван-дер-ваальсовых, электростатических взаимодействий, энергии водородных связей и энергии десольватации. В качестве трехмерной структуры молекулы альбумина сыворотки крови человека использовали данные рентгеноструктурного анализа этого фермента из базы данных белков PDB (код структуры 2BXH). Молекулы воды, сахаров и лигандов были удалены из первоначальных структур. Затем проводили минимизацию молекулы белка методом скорейшего спуска с помощью программы GROMACS [24] и полученную конформацию альбумина использовали для процедуры докинга. Трехмерные модели изомеров зомана конструировали и минимизировали с помощью программы HyperChem 8.0 [25]. Во время процедуры докинга молекула лиганда виртуально помещалась вблизи аминокислот центров связывания фермента. С помощью программы Autodock можно рассчитать зависимость энергии комплекса от конформации и положения лиганда внутри активного центра фермента и отобрать конфигурации с наимень-
шей энергией. Варьируются только геометрические параметры лиганда, фермент остается жестким. Конечным результатом минимизации является набор конформаций комплекса с наименьшей энергией, которые и используются для дальнейшего анализа.
Конформационные изменения лиганд-ферментных комплексов с течением времени были рассчитаны методом молекулярной динамики с помощью программного пакета GROMACS [24]. Комплексы, полученные методом молекулярного докинга, виртуально помещали в периодическую кубическую решетку размером 450 нм, заполненную молекулами воды. Затем энергия системы минимизировали методом скорейшего спуска и далее уже непосредственно проводили расчет траекторий движения комплексов. Длина всех траекторий составляла 1000 пс, шаг интегрирования был принят равным 0,002 пс. Для описания молекул воды использовали модельный потенциал SPC [26]. Для поддержания постоянной температуры 300 К и постоянного давления 1 бар применяли термостат и баростат Берендсена с временными константами 0,1 пс и 1 пс соответственно. Дальние электростатические взаимодействия рассчитывали методом Эвальда. Взаимодействия Леннард-Джонса не учитывали при межатомном расстоянии больше 1 нм. Длины связей поддерживали постоянными с помощью алгоритма LINCS [27].
Продуктивность комплексов альбумина с зоманом оценивалась по двум известным из литературы критериям: 1) геометрия и 2) расстояние между гидроксильным атомом тирозина и атомом фосфора зомана (dist_O-P). Ранее квантово-химиче-скими методами на примере взаимодействия АХЭ с зарином было показано, что реакция гидролиза фторсодержащих ФОС возможна только при определенном положении атома фосфора лиганда относительно каталитического серина, а именно атом гидроксильного кислорода каталитического серина и атомы фтора и фосфора лиганда должны лежать на одной прямой [28]. Аналогичный критерий был использован нами и для реакции альбумина с зоманом: в качестве кандидатов в продуктивные были отобраны только те фермент-лигандные комплексы, в которых атомы гидроксильного кислорода тирозина, атомы фтора и фосфора зомана лежали на одной прямой. Теоретические расчеты показывают, что максимальное расстояние между гидроксильным кислородом тирозина и атакуемым атомом фосфора должно быть не больше 3,7 Â [29].
Результаты и обсуждение. Молекула зомана имеет два хиральных центра: атом углерода и атом фосфора. Следовательно, существует четыре стереоизомера зомана. Синтетический зоман представляет собой смесь четырех стереоизомеров. Пары энантиомеров зомана (С(+)Р(+) и С(-)Р(-); С(+)Р(-) и С(-) Р(+)) представлены в синтетическом С(±)Р(±) зомане в соотношении 45:55, с эквивалентным количеством двух энантиомеров внутри каждой пары [15]. В последнее время применяют новые обозначения конфигураций стереоизомеров. Так, старые обозначения расположений заместителей относительно хиральных центров Р-, Р+, С+ и С- соответствуют новым обозначениям PS, PR, CS и CR соответственно.
Для выявления особенностей механизма связывания ФОС в активных центрах альбумина, был проведен молекулярный докинг четырех изомеров зомана в следующие сайты:
сайт «Tyr-411» альбумина в неактивированном состоянии аминокислот сайта (протонированный Tyr-411, депротониро-ванный Lys414);
сайт «Tyr-411» альбумина в активированном состоянии аминокислот сайта (депротонированный Tyr-411, протонированный Lys-414);
сайт «Tyr-150» альбумина в неактивированном состоянии аминокислот сайта (протонированный Tyr-150, единожды про-тонированный His-242);
сайт «Tyr-150» альбумина в активированном состоянии аминокислот сайта (депротонированный Tyr-150, дважды протони-рованный His-242).
По результатам молекулярного докинга были рассчитаны константы ингибирования альбумина зоманом, которые пред-
ставляют собой константы диссоциации полученных комплексов. С помощью методов молекулярной динамики была проведена оценка продуктивности всех полученных методом докинга комплексов (табл. 1).
Таблица 1
Оценка связывания зомана с БХЭ и двумя тирозиновыми аминокислотными остатками альбумина. Ю - константа связывания
Наименование сайта связывания и его состояние Характеристики связывания Стереоизомеры зомана
Р(-)С(-) Р(+)С(-) Р(-)С(+) Р(+)С(+)
411 неактивированный К (цМ) 578,1 593,9 718,9 859,1
Г еометрия (на одной прямой?) нет нет нет нет
Расстояние О-Р (нм) 0,72 0,73 0,68 0,68
оценка продуктивности нет нет нет нет
411 активированный К (цМ) 439,5 483,7 403,7 684,6
геометрия (на одной прямой?) нет да нет да
Расстояние О-Р (нм) 0,37 0,37 0,37 0,36
оценка продуктивности нет да нет да
150 неактивированный К (цМ) 264,1 451,0 183,5 431,9
Г еометрия (на одной прямой?) да да да да
Расстояние О-Р (нм) 0,36 0,33 0,34 0,34
оценка продуктивности да да да да
150 активированный К (цМ) 277,6 439,4 195,2 431,7
Г еометрия (на одной прямой?) да да да да
Расстояние О-Р (нм) 0,34 0,33 0,34 0,34
оценка продуктивности да да да да
Таблица 2
результаты молекулярного докинга четырех изомеров зомана в неактивированный сайт «^-411» комплекса зомана P(-)C(-) и активированного сайта «Гуг-150»
Наименование сайта связывания и его состояние Характеристики взаимодействия Стереоизомеры зомана
Р(-)С(-) Р(+)С(-) Р(-)С(+) Р(+)С(+)
Ы (цМ) 3610,0 2680,0 1980,0 2050,0
411 геометрия (на одной прямой?) да да да да
неактив. расстояние О-Р (нм) 0,34 0,31 0,32 0,32
оценка продуктивности да да да да
Докинг зомана в «Tyr-411» сайт альбумина
Расстояние между гидроксилом Туг-411 и атомом фосфора лиганда варьируется от 0,68 нм (для С(+) стереоизомеров) до 0,73 нм (для С(-) стереоизомеров). В работе Li et а1. [19] были получены те же значения, но для противоположных изомеров, т.е. 0,68 нм для С(-) и 0,75 нм для С(+) стереоизомеров. Атомы кислорода тирозина, фтора и фосфора зомана не лежат на одной прямой. Константы ингибирования варьируются от 578,1 до 859,1 мкМ, стереохимия атома фосфора не влияет на эффективность связывания, тогда как изомеры по атому углерода взаимодействуют с сайтом с разной эффективностью. Эти данные в целом совпадают с результатами работы Li et а1. [19], но отличаются в большую сторону по величине в 3-4 раза. Геометрия ни одного из комплексов не удовлетворяет параметрам продуктивности: в таких кон-формациях невозможна атака гидроксила тирозина на атом фосфора.
Анализ данных докинга зомана в активированный сайт «Туг-411», то есть с перенесенным протоном с гидрокси-ла тирозина-411 на аммонийную группу лизина-414, показал, что все изомеры зомана связываются с активированным сайтом с одинаковой эффективностью, кроме Р(+) С(+)-изомера, который связывается с сайтом с худшей эффективностью. Но только для Р(+)С(-) и Р(+)С(+) изомеров найдены конформеры, удовлетворяющие всем условиям продуктивности: расстояние между атомом водорода ОН-группы тирозина и атомом фосфора лиганда не превышает 0,37 нм и атомы кислорода тирозина, фтора и фосфора зо-мана лежат на одной прямой.
Докинг зомана в «Tyr-150» сайт альбумина
С(+)- и С(-)-изомеры сорбирутся в сайт «Туг-150» с одинаковой эффективностью. В целом, все изомеры зомана связываются с сайтом «Туг-150» лучше, чем с сайтом «Туг-411». Расстояние между гидроксилом Туг-150 и атомом фосфора лиганда варьируется от 0,33 до 0,36 нм, во всех полученных комплексах атомы кислорода тирозина, фтора и фосфора зо-мана лежат на одной прямой. Таким образом, все полученные комплексы могут считаться продуктивными.
Анализ данных докинга зомана в активированный сайт «Туг-150» показал, что, как и в случае неактивированного сайта, Р(-)-изомеры взаимодействуют с сайтом с лучшей эффективностью, различий в параметрах связывания С(+)-и (С-)-изомеров не выявлено. Расстояние между гидрокси-лом Туг-150 и атомом фосфора лиганда варьируется от 0,33 до 0,34 нм, во всех полученных комплексах атомы кислорода тирозина, фтора и фосфора зомана лежат на одной прямой. Геометрия всех полученных комплексов удовлетворяет всем параметрам продуктивности. В целом, по данным докинга, зоман с одинаковой эффективностью связывается с активированным и неактивированным сайтом «Туг-150».
Анализируя полученные методом докинга значения констант связывания можно заключить, что зоман лучше связы-
вается с сайтом «Туг-150» чем с сайтом «Туг-411». При этом все комплексы зомана с сайтом «Туг-150» могут считаться продуктивными по геометрическим параметрам. Прослеживается незначительная стереоселективность сайта «Туг-411» по отношению к Р(-) стереоизомерам зомана, тогда как для сайта «Туг-150» эта стереоселективность ярко выражена.
Однако метод докинга не учитывает такие факторы как стерическое влияние молекул воды и подвижность белка, которые могут повлиять на процесс взаимодействия белка с лигандом. Молекула альбумина имеет достаточно лабильную структуру, которой присущи такие эффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычно свойственные мультимерным белкам. Для исследования ал-лостерической модуляции в молекуле альбумина мы исследовали влияние сорбции зомана в сайте «Туг-150» на сорбцию зомана в сайте «Туг-411».
Аллостерическая модуляция «Tyr-411»
Был проведен докинг изомеров зомана в сайт «Туг-411» комплекса альбумина с сорбированным в активированном сайте «Туг-150» изомером Р(-)С(-) после 1000 пикосекунд симуляции этого комплекса методом молекулярной динамики. Результаты представлены в табл. 2.
Анализ полученных данных показал, что для всех четырех стереоизомеров зомана полученные комплексы могут считаться продуктивными, расстояние между фосфором ли-ганда и гидроксилом тирозина варьируется от 0,31 до 0,34 нм. Атомы фтора и фосфора лиганда и гидроксильный атом кислорода тирозина лежат на одной прямой во всех случаях. Тот факт, что в этом случае молекула зомана имеет возможность сорбироваться в сайте «Туг-411» намного ближе к тирозину, чем в случае свободного белка, может быть объяснен тем, что за 1000 пс симуляции комплекса зоман-сайт «Туг-150» происходят конформационные изменения в глобуле, приводящие к увеличению стерических размеров сайта «Туг-411» либо к перераспределению зарядов аминокислот. Таким образом, сорбция зомана в сайте «Туг-150» облегчает продуктивную сорбцию зомана в сайте «Туг-411», но при этом константы ингибирования все равно на порядок выше, чем для продуктивного связывания в сайте «Туг-150» и непродуктивного в сайте «Туг-411». Это свидетельствует о небольшом времени жизни такого продуктивного комплекса и, следовательно, о низкой эффективности псевдохолинэсте-разной активности сайта «Туг-411».
Молекулярная динамика
Известно, что время, необходимое для реакции образования новой ковалентной связи не превышает 10 пикосекунд [30]. Чтобы проверить стабильность полученных методом докинга комплексов альбумина с зоманом, был проведен расчет траекторий движения атомов методом молекулярной динамики. Длина траекторий составила 1000 пикосекунд. По полученным траекториям была построена зависимость расстояния dist(O-P) от времени.
Комплексы зомана с неактивированным сайтом «Tyr-411» нестабильны. За расчетное время расстояние между атомом кислорода тирозина и атомом фосфора зомана не принимает значения меньше 0,38 нм. Отсюда можно сделать вывод, что структурных изменений данных комплексов недостаточно для образования продуктивного фермент-лигандного комплекса. По всей видимости, для гидролиза зомана в сайте «Tyr-411» необходимы химические изменения в структуре самого сайта, возможно, перенос протона на другие аминокислоты.
Комплексы зомана с неактивированным сайтом «Tyr-150» также нестабильны. За весь период симуляции ни у одного из изомеров расстояние (O-P) не остается меньшим необходимых 0,37 нм достаточное для реакции время. Результат не опровергает гипотезу о том, что для прохождения реакции гидролиза в сайте «Tyr-150» необходима активация аминокислот сайта, а именно перенос протона с тирозина на гистидин. Результат молекулярной динамики комплексов изомеров зомана с активированным сайтом «Tyr-150» показаны на рис. 1 и более подробно первые 20 пс симуляции на рис. 2.
Как видно из представленных графиков, только комплексы активированного сайта «Tyr-150» c Р(-)-изомерами зомана остаются стабильными в течение 20 пс, что является достаточным временем для реакции фосфорилирования тирозина.
Выводы. Результаты проведенной работы свитель-ствуют о том, что
• зоман с лучшей эффективностью связывается с сайтом «Tyr-150»;
• для гидролиза в сайте «Tyr-411» необходимы либо химические изменения в структуре сайта, либо связывание зомана в других сайтах;
• для образования продуктивного фермент-лигандного комплекса зомана с сайтом «Tyr-150» необходим перенос протона с Tyr -150 на His-242;
• к переносу протона может приводить связывание зо-мана в других сайтах (аллостерическая модуляция).
Расчет показал, что перенос протона с Tyr-411 на Lys-414 не является достаточным условием для образования продуктивного фермент-лигандного комплекса. Однако результаты многочисленных экспериментов in vitro однозначно свидетельствуют об образовании аддуктов зомана с альбумином по Tyr -411. Для разрешения данного противоречия необходимо проведение дальнейших исследований с целью обнаружения дополнительных сайтов связывания зомана с альбумином.
Рис. 1. Зависимость расстояния между гидроксильным кислородом активированного Туг-150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана (^^О-Р) от времени
Рис. 2. Зависимость расстояния между гидроксильным кислородом активированного Туг-150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана от времени (первые 20 секунд симуляции)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tildon J.T., Ogilvie J.W. The esterase activity of bovine mercaptalbumin. The reaction of the protein with p-nitrophenyl acetate // J. Biol. Chem.- 1972. — V.247. — N.4. — P.1265-12671.
2. Casida J.E., Augustinsson K.B. Reaction of plasma albumin with I-naphthyl N-methylcarbamate and certain other esters // Biochim. Biophys. Acta.- 1959. — N.36. — P.411-426.
3. Tove S.B. The esterolytic activity of serum albumin // Biochim Biophys Acta.- 1962. — N.57. — P.230-235.
4. Means G.E., Bender M.L. Acetylation of human serum albumin by p-nitrophenyl acetate// Biochemistry. — 1975. — V14. — N.22. — P.4989-4994.
5. Rainsford K.D., Ford N.L., Brooks P.M., Watson H.M. Plasma aspirin esterases in normal individuals, patients with alcoholic liver disease and rheumatoid arthritis: characterization and the importance of the enzymic components // Eur. J. Clin. Invest.- 1980. -V.10. — N.5. — P.413-420.
6. Dubois-Presle N., Lapicque F., Maurice M.H., Fournel-Gigleux S., Magdalou J., Abiteboul M., Siest G., Netter P. Stereoselective esterase activity of human serum albumin toward ketoprofen glucuronide //Mol. Pharmacol.- 1995. — V.47. — N.3. — P.647-53.
7. Kwon C.H., Maddison K., LoCastro L., Borch R.F. Accelerated decomposition of 4-hydroxycyclophosphamide by human serum albumin // Cancer Res.- 1987. -V.47. — N.6. — P.1505-1508.
8. Salvi A., Carrupt P.A., Mayer J.M., Testa B. Esterase-like activity of human serum albumin toward prodrug esters of nicotinic acid // Drug Metab. Dispos.- 1997.- V.25. — N.4. — P.395-398.
9. De Vriese C., Hacquebard M., Gregoire F., Carpentier Y., Delporte C. Ghrelin interacts with human plasma lipoproteins // Endocrinology.- 2007- V.148. — N.5. — P.2355-2362.
10. Manoharan I., Boopathy R. Diisopropylfluorophosphate-sensitive aryl acylamidase activity of fatty acid free human serum albumin // Arch. Biochem. Biophys. — 2006. -V.452. -P.186-188.
11. Masson P., Froment M.T., Darvesh S., Schopfer L.M., Lockridge O. Aryl acylamidase activity of human serum albumin with o-nitrotrifluoroacetanilide as the substrate // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. — 2007. — V.22. — N.4. — P.463-469.
12. Mourik J., de Jong L. P. Binding of the organophosphates parathion and paraoxon to bovine and human serum albumin // Arch. Toxicol. — 1978 — V.41 — P.43-48.
13. Black R. M., Harrison J. M., Read R. W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site. Arch. Toxicol — 1999 — V.73 — P.123-126.
14. Li B., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Masson P., Lockridge O. Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of- flight mass spectrometry assay for organophosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr-411 // Analytical Biochemistry. — 2007. — V.361 — P. 263-272.
15. Chemical warfare agents: toxicity at low levels / Edited by Satu M. Somani, James A. Romano. — Jr. CRC Press. — 2001, — 447 P.
16. Lockridge O., Xue W., Gaydess A., Grigoryan H., Ding S.J., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Masson P. Pseudo-esteraseactivity of humanalbumin: slow turnover on tyrosine 411 and stable acetylation of 82 residues including 59 lysines // J. Biol. Chem. — 2008 -V283. — N.33. — P.22582-22590.
17. Watanabe H., Tanase S., Nakajou K., Maruyama T., KraghHansen U., Otagiri M. Role of Arg-410 and Tyr-411 in human serum albumin for ligand binding and esterase-like activity. // Biochem. J. — 2000. — V.349. — P. 813-819.
18. Kosa T., Maruyama T., Otagiri M. Species differences of serum albumins: I. Drug binding sites
// Pharm. Res. — 1997. — V.14. — N.11. — P.1607-1612.
19. Li B., Nachon F., Froment M.T., Verdier L., Debouzy J.C, Brasme B.,DGillon E., M. Schopfer L.M., Lockridge O., Masson P. Binding and Hydrolysis of Soman by Human Serum Albumin // Chem. Res. Toxicol. — 2008. — V.21. — P.421-431.
20. John H., Breyer F., Thumfart J.O., Hochstetter H., Thiermann H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for detection and identification of albumin phosphylation by organophosphorus pesticides and G- and V-type nerve agents // Anal. Bioanal. Chem. — 2010. — V. 398. — P.2677-2691.
21. Belinskaya D.A., Shestakova N.N, Juffer A.H. Theoretical investigation of substrate sorption into cholinesterase active site. // The FEBS Journal. 2008. V.275. Supplement 1.
22. -P.158.
23. Morris G.M., Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W.E., Belew R.K., Olson A.J. Automated docking using a lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. // J. Comp. Chem. — 1998. — V. 19. — P.1639-1662.
24. Cornell W.D., Cieplak P., Bayly C.I., Gould I.R., Merz K.M. Jr., Ferguson D.M., Spellmeyer D.C., Fox T., Caldwell J.W., Kollman P.A. A second generation force field for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. // J. Am. Chem. Soc. — 1995. — V.117. — P.5179-5197.
25. Berendsen H.J.C., van der Spoel D., van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation // Comp. Phys. Comm. — 1995. — V91. — N.1. — P.43-56.
26. Hypercube: Computational Chemistry, Publication HC40-00-03-00, Inc. HyperChem Manual, 1994, ch. 12,-P. 255-259
27. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Gunsteren W.F., Hermans J. Interaction models for water in relation to protein hydration // Intermolecular Forces / Eds Pullman B. Dordrecht: Reidel D. Publishing Company. — 1981. — P.331-342.
28. Sharma S., Pirila P., Kaija H., Porvari K., Vihko P., Juffer A.H. Theoretical investigations of prostatic acid phosphatase // Proteins. — 2005. — V58, N 2. — P. 295-308.
29. Enyedy I.J., Kovach I.M., Bencsura A. Molecular dynamics study of active-site interactions with tetracoordinate transients in acetylcholinesterase and its mutants // Biochem J. — 2001. — V.353, N 3. — P. 645-53.
30. Wang Z., Ling B., Zhang R., Suo Y., Liu Y., Yu Z,. Liu C. Docking and molecular dynamics studies toward the binding of new natural phenolic marine inhibitors and aldose reductase // J. Chem. Inf. Model. — 2009. — V.28, N 2. — P. 162-169.
31. Chen, X., Fang, L., Liu, J., Zhan, C.G. Reaction pathway and free energy profile for butyrylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of acetylcholine // J Phys Chem B. — 2011 — V.115 — P.1315-22.
Belinskaya D.A., Shmurak V.I., Prokofyeva D.S., Goncharov N.V Investigation of soman binding with albumin by a molecular modeling method
I.M. Sechenov Research Institute of Evolutional Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, St.Petersburg
The interaction of soman with two tyrosine binding sites on the albumin Tyr-411 and Tyr-150 surface was evaluated by a method of molecular modeling. Processes of binding four soman stereoisomers on the albumin binding sites were characterized by a molecular docking method and the influence of neighboring amino acid residues on binding effectiveness was evaluated. The stability of soman and albumin complexes was verified by a molecular dynamic method.
Материал поступил в редакцию 21.03.2012 г.
