CC BY
64
Определение чувствительности микробных клеток к полимиксину методом электроакустического анализа
О. И. ГУЛИЙ'23, Б. Д. ЗАЙЦЕВ4, А. М. ШИХАБУДИНОВ4, И. А. БОРОДИНА4, О. С. ЛАРИОНОВА2, Е. Г. ЖНИЧКОВА2
' Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
2 Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, Саратов
3 Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт, Саратов
4 Саратовский филиал Института радиотехники и электроники им. В. А. Котельникова РАН, Саратов
Determination of Microbial Sensitivity to Polymyxin by the Method of Electroacoustic Analysis
0. I. GULIY1'2'3, B. D. ZAITSEV4, A. M. SHIKHABUDINOV4,
1. A. BORODINA4, O. S. LARIONOVA2, E. G. ZHNICHKOVA2
1 Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Saratov
2 Saratov State Vavilov Agrarian University, Saratov
3 Saratov Scientific Research Veterinary Institute, Saratov
4 Saratov Branch of the Kotel'nikov Institute of Radio Engineering and Electronics of RAS, Saratov
Впервые исследовано влияние полимиксина на изменение электрофизических (ЭФ) параметров суспензии клеток Escherichia coli штамма К-12 методом электроакустического анализа. Показано, что максимальные изменения регистрируемого сигнала происходят при концентрации полимиксина 25 мкг/мл, при этом они не зависели от времени воздействия антибиотика. Данные, полученные методом акустического анализа, подтверждены стандартным микробиологическим способом определения чувствительности микроорганизмов к полимиксину. Показана возможность регистрации чувствительности микробных клеток к антибактериальным препаратам и определения их антибактериальной активности на примере полимиксина методом электроакустического анализа клеточных суспензий.
Ключевые слова: полимиксин, Escherichia coli, микробные клетки, чувствительность, акустический биологический датчик.
The influence of polymyxin on the change in the electrophysical parameters of a suspension of Escherichia coli cells of the K-12 strain was studied for the first time by electroacoustic analysis. It was shown that the maximum changes in the detected signal occur at a concentration of polymyxin of 25 ^g/ml, furthermore they did not depend on the time of exposure to the antibiotic. The data obtained by the acoustic analysis method was confirmed by the standard microbiological method for determining microorganisms' sensitivity to polymyxin. The article shows the possibility of recording the sensitivity of microbial cells to antibacterial drugs and determining their antibacterial activity by the example of polymyxin with the use of the method of electroacoustic analysis of cell suspensions.
Keywords: polymyxin, Escherichia coli, microbial cells, sensitivity, acoustic biological sensor.
Введение
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам является одним из диагностических методов, широко применяемым в терапии инфекционных заболеваний. Чувствительными к антибиотикам считаются те микроорганизмы, на которые испытуемый антибиотик оказывает бак-териостатическое или бактерицидное действие. Мерой чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация препарата, подавляющая рост микроорганиз-
© Коллектив авторов, 2017
Адрес для корреспонденции: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. E-mail: [email protected]
ма при стандартных условиях опыта. В настоящее время для определения чувствительности микробов к антибиотикам используют стандартные методы диффузии в гель агар-агара с применением дисков, методы серийных разведений, а также модификации этих стандартных методик [1—2]. Кроме того, созданы автоматизированные системы для определения чувствительности бактерий к антибиотикам. В одних системах автоматизированы только операции разведения и инкубации, тогда как рост бактерий определяется традиционными методами. В других системах все начальные операции выполняются вручную и автоматизированы лишь этапы считывания и регистрации результатов. Некоторые системы автоматизации предусматривают создание программ для всех
операций, используемых в определении чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам (приготовление образца и бактериального посевного материала, инкубация, считывание результатов и их регистрация) [3—6]. Поэтому развитие новых методов определения чувствительности микробных клеток к антибактериальным препаратам является весьма актуальным для микробиологии, медицины и ветеринарии.
Общие теории действия лекарственных веществ основываются на представлении о связывании веществ со специфическим рецептором (часто мембранным белком), вызывающим биохимический отклик [7]. В результате происходит ускорение или замедление определённой реакции обмена или изменение проницаемости мембран, что, в свою очередь, приводит к изменению электрофизических свойств микробных клеток, проводимости среды и её вязкости. В связи с этим методы электрофизического анализа, основанные на исследовании клеток как электрофизических объектов со сложной структурой, представляют собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности [8]. В этом плане весьма перспективным является применение метода электроакустического анализа, основанного на регистрации биоспецифических реакций в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика. В отличие от традиционных резонаторов с продольным полем эти резонаторы более чувствительны к контактирующей жидкости, поскольку реагируют на изменение как механических, так и электрических её свойств [9—11]. Существует большое количество публикаций, посвящённых этим резонаторам и их использованию для решения ряда микробиологических и биотехнологических задач [10—15]. Описанные преимущества открывают перспективы использования метода акустического анализа для регистрации воздействия антибактериальных препаратов на микробные клетки и определения их антибиотикочувствительности.
Полимиксины — амфифильные (содержат и гидрофильные, и гидрофобные группы) катион-ные поверхностно-активные соединения. Взаимодействуя с фосфолипидами, полимиксины нарушают структуру бактериальных мембран и повышают их проницаемость. Повреждение структуры мембраны приводит к изменению её проницаемости как внутри, так и вне клеток [16]. Данные повреждения мембраны могут приводить к изменению электроакустических параметров суспензии клеток, регистрируемых акустическим датчиком.
Целью работы являлась оценка воздействия полимиксина на микробные клетки методом акустического анализа.
Материал и методы
В работе использовали микроорганизмы Escherichia coli штаммов К-12, полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Саратов).
Микроорганизмы хранили при +4°С на чашках Петри с твёрдой питательной средой LB, содержащей 3% агар-агара. Микробные клетки пересевали каждые 2 нед.
Для культивирования бактерий использовали жидкую питательную среду LB [17] следующего состава (г/л): NaCl (Becton, Dickinson & Co., США) — 10,0; пептон (Becton, Dickinson & Co., США) — 5,0; дрожжевой экстракт (DIFCO, США) — 5,0. Полужидкая среда LB содержала 0,7% агар-агара; твёрдая — 1,5 и 3% агар-агара.
Культуры бактерий выращивали в 250 мл колбах Эрлен-мейера на жидкой среде LB. Инкубирование клеток проводили на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при 30±1°С в течение 18—20 ч.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальному препарату (АБП) осуществляли с помощью метода серийных разведений в жидкой питательной среде. Питательный бульон для определения чувствительности разливали по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяли необходимым диапазоном разведений АБП и увеличивали на одну для постановки «отрицательного» контроля [1]. Рабочий раствор АБП готовили из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрацию рабочего раствора рассчитывали исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений, учитывая фактор разбавления препарата при последующей инокуляции. В исследованиях концентрация антибиотика уменьшалась от 25 мкг/мл до 0,025 мкг/мл. Конечный объём среды в каждой пробирке составлял 1 мл. Контролем служила пробирка, содержащая чистую питательную среду («отрицательный» контроль хранили в холодильнике при 4 °С до учёта результатов). Пробирки инкубировали 18 ч при 37°С. По истечению указанного срока результаты оценивали по изменению оптической плотности среды визуально.
Перед проведением электроакустического анализа микробные клетки отмывали трёхкратным центрифугированием при 2800xg в течение 5 мин, затем ресуспендировали в небольшом количестве дистиллированной воды (электропроводность 1,8 ^S/см). Для устранения конгломератов суспензию клеток вновь центрифугировали при 110xg в течение 1 мин и использовали суспензию, оставшуюся в на-досадочной жидкости. Затем доводили оптическую плотность подготовленной суспензии D670 для каждого вида использованных микроорганизмов до 0,4—0,42.
Все эксперименты по изучению изменений механических и электрических свойств суспензий микробных клеток при воздействии полимиксина проводили с помощью специально изготовленного датчика на основе пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем в диапазоне частот 6—7 МГц. Этот резонатор был изготовлен из пластины ниобата лития X-среза толщиной 0,5 мм. На нижней стороне пластины были нанесены два прямоугольных электрода с размерами 5x10 мм2 с зазором между ними 3 мм. Область вокруг электродов и часть электродов были покрыты специальным лаком, который демпфировал паразитные волны Лэмба [9] и обеспечивал достаточно высокую добротность ~630. На верхней стороне пластины была приклеена жидкостная ячейка объёмом ~1 мл. На рис. 1 представлена схема используемого биосенсора, содержащего резонатор с двумя прямоугольными электродами на пластине ниобата лития X-среза и жидкостной контейнер. Присутствие контейнера объёмом 1 мл никак не меняло характеристики резонатора, поскольку его поперечные размеры были существенно больше, чем область электродов.
Для проведения электроакустического анализа подготовленные суспензии микробных клеток вносили в вышеупомя-
Рис. 1. (I) Биологический датчик.
Вид сбоку (а) и сверху (б) на биологический датчик: 1 - пьезоэлектрическая пластина; 2 - электроды; 3 - акустический луч; 4 - контейнер для суспензии; 5 - суспензия; 6 - слой поглощающего лака; к и Р - направления волнового вектора и электрической поляризации, соответственно; X и У - кристаллографические оси пластины. (II) Частотные зависимости реальной (а) и мнимой (б) частей электрического импеданса ненагруженного резонатора.
нутую жидкостную ячейку и проводили измерения частотных зависимостей реальной и мнимой частей электрического импеданса датчика с помощью прецизионного измерителя LCR параметров Agilent 4285A, затем вносили исследуемый антибиотик и измерения повторялись.
Каждый эксперимент проводился не менее чем пять раз. Относительная погрешность результатов измерений исследуемых образцов составляла ±2%.
Результаты исследования
Полимиксины, впервые исследованные в 1947 г., представляют собой близкие по строению антибиотики, вырабатываемые некоторыми штаммами аэробной спорообразующей палочки Bacilluspolymyxa, обнаруженной в почве. Существует несколько разновидностей полимиксина. Например, колистин (полимиксин Е) продуцируется Paenibacillus polymyxa (Bacillus nolymyxa) — микроорганизмом, который был выделен из пробы почвы, взятой в префектуре Фукусима (Япония). В клинической практике используются по-
лимиксин В (смесь полимиксинов В1 и В2) и колистин (полимиксин Е), структурные формулы которых представлены на рис. 2. Препарат оказывает бактерицидное действие, связанное с нарушением целостности мембраны микробной клетки. Антибактериальная активность полимиксинов распространяется только на грамот-рицательную микрофлору: Escherichia coli, Enterobacter spp., Brucella spp., Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp., Klebsiella spp., Haemophilus influenzae, Acinetobacter spp. [17]. Во многих случаях полимиксины остаются высокоактивными антибиотиками в отношении бактерий, устойчивых к большинству противоми-кробных препаратов [18]. Меньшая активность проявляется против анаэробов. Нечувствительны к действию полимиксинов все виды Proteus spp., Serratia marcescens, грам (+) бактерии и многие анаэробы, в частности Bacteroides fragilis. Приобретённая бактериальная резистентность развива-
" y-NH,
t
ДАБ -» D-фелилала. -» Лейцин /
R ДАБ - Трипт. - ДАБ н> ДАБ
1 ч v
y-NII, Трипг. *■ ДАБ ДАБ
1 1 y-NH, y-NH,
ДАБ - 1^-сг,у-диаминобутировая кислота
Полимиксин В, R = (+)-6-метилоктаноил В2 R = 6-метилгентаноил
б
y-NH2 t
L-ДАБ -» D-лейцин -» Лейцин /
R -> L-ДАБ -> Трипт. -> L-ДАБ ■* L-ДАБ
I \ U
y-NH2 Трипт. - L-ДАБ - L-ДАБ
I I
y-NII, y-NH,
ДАБ - а, у-диамипобутировая кислота
Колистин A, R = (+)-б-ыетилоктаноил Полимиксин Е2 R = 6-метилгептаноил
Рис. 2. Структурные формулы (а) полимиксина В и (б) полимиксина Е.
ется медленно и обычно связана со снижением проницаемости мембран для полимиксинов.
Поскольку полимиксин является антибиотиком широкого спектра действия и активен в отношении большого числа грамотрицательных палочек, в качестве объекта исследования использовали микробные клетки Е.соИ штамма К-12.
Биологическая активность полимиксина связана с воздействием на цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки при взаимодействии с фосфолипидами. Полимиксины связываются с анионными участками мембраны и по характеру действия напоминают катионные детергенты. Повреждение структуры мембраны приводит к изменению её проницаемости как для внутри-, так и вне-клеточных компонентов [16]. Для оценки воздействия полимиксина на микробные клетки использовался резонатор с поперечным возбуждающим электрическим полем, в котором электроды с простейшей геометрией были нанесены на пластину из ниобата лития Х-среза. На область вокруг электродов было нанесено покрытие, поглощающее нежелательные колебания [9].
Согласно предварительным экспериментам по оптимизации условий проведения электроакустического анализа (выбор частоты измерения, времени взаимодействия, количества микробных клеток в измерительной ячейке) был выбран диапазон частот 6—7 МГц, при этом время эксперимента составляло ~10 мин. В измерительную ячей-
Рис. 3. Общая схема проведения электроакустического анализа.
Рис. 4. Частотные зависимости реальной (а) и мнимой (б) частей электрического импеданса при воздействии на микробные клетки E.coli XL-1 полимиксина.
1 - контроль - суспензия клеток без добавления антибиотика; 2, 3, 4, 5, 6 и 7 -суспензия клеток с добавлением разных концентраций антибиотика 1, 3, 6, 12, 25, 30 мкг/мл, соответственно.
Рис. 5. Зависимость изменения максимальной величины реальной части электрического импеданса от концентрации полимиксина.
ку вносили микробные клетки в количестве 108 клеток/мл.
Первоначально нами исследовались изменения электроакустических параметров клеточной суспензии штамма К-12 при инкубации с разными концентрациями полимиксина. Для этого в измерительную ячейку вносили подготовленную суспензию клеток и измеряли частотные зависимости реальной и мнимой частей электрического импеданса. Затем в суспензию клеток добавляли полимиксин с заданной концентрацией и измерения повторялись. Общая схема проведения экспериментов представлена на рис. 3. На рис. 4 представлены реальные (a) и мнимые (б) части электрического импеданса датчика, когда в жидкостной ячейке находилась суспензия бактериальных клеток E.coli штамма К-12 с добавлением разного количества полимиксина (1, 3, 6, 12, 25, 30 мкг/мл). Из представленных данных видно, что изменение электрического импеданса происходит уже при количестве полимиксина в образце из расчёта 1 мкг/мл. Для удобства представления экспериментальных данных на рис. 5 приведена зависимость изменения реальной части импеданса на резонансной частоте от концентрации полимиксина.
Как видно из полученных данных, с увеличением удельного количества вносимого антибиотика в клеточную суспензию изменение реальной части импеданса во всем диапазоне увеличивается вплоть до количества антибиотика 25 мкг/мл, и затем наступает насыщение. Поскольку при экспозиции клеток с полимиксином происходит повреждение структуры мембраны, что приводит к изменению её проницаемости как для внутри-клеточных, так и вне-клеточных компонентов, увеличение аналитического сигнала после инкубации клеток с антибиотиком может быть объяснено по-
Рис. 6. Частотные зависимости реальной (а) и мнимой (б) частей электрического импеданса при воздействии на микробные клетки E.coli XL-1 полимиксина в течение различного временного интервала.
1 — суспензия клеток без добавления антибиотика; 2, 3, 4 и 5 суспензия клеток после инкубации с антибиотиком в течение 1, 10, 20 и 30 мин, соответственно).
вреждением мембраны клеток, выходом из клетки макромолекул цитоплазмы и изменением проводимости суспензии. В целом, полученные данные свидетельствуют о чувствительности микробных клеток к действию полимиксина.
На следующем этапе нами изучалась динамика изменений акустических параметров клеток Е.еоН К-12 при инкубации с полимиксином. Поскольку, при использовании антибиотика с концентрацией 3 мкг/мл фиксировалась существенная величина аналитического сигнала, в последующих экспериментах использовали антибиотик именно этой концентрации — 3 мкг/мл. Для этого суспензии клеток инкубировались с антибиотиком при 30°С в течение различного временного интервала (5, 10, 20, 30 мин) и проводились измерения частотных зависимостей реальной и мнимой частей электрического импеданса. Было показано (рис. 6), что по-
сле 5 мин инкубации клеток штамма К-12 с антибиотиком происходило значительное увеличение величины сигнала. Дальнейшие изменения параметров клеточной суспензии Е.еоН К-12 незначительно зависели от времени воздействия антибиотика. Известно, что изменение проницаемости мембраны происходит сразу после контакта бактериальной клетки с препаратом. Поэтому, увеличение аналитического сигнала после 5 мин инкубации клеток штамма К-12 с антибиотиком может быть объяснено повреждением мембраны клеток и выходом из клетки макромолекул цитоплазмы.
Следовательно, регистрация изменений измеряемых параметров резонатора с суспензией клеток при воздействии на них антибактериальным препаратом позволяет сделать заключения о чувствительности исследуемых клеток к данному антибиотику.
Далее представляло интерес сравнить результаты, полученные с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий с данными, полученными при помощи стандартного микробиологического способа определения чувствительности микроорганизмов к полимиксину методом серийных разведений. В результате исследований показано, что наименьшая концентрация антибиотика полимиксина, подавляющая видимый рост Е.еоН, составила ~2,0 мкг/мл. Таким образом, данные, полученные двумя независимыми методами, практически совпадают.
Активность антибиотиков — это способность подавлять синтез клеточных компонентов микроорганизмов. Существуют стандартные методы определения активности антибиотиков: определение минимальной подавляющей концентрации в жидкой среде; определение минимальной подавляющей концентрации на плотной среде; определение активности антибиотиков методом диффузии в агаре и т.д. Поскольку изменение физических свойств суспензии клеток К-12 при инкубации с полимиксином мы связываем с проявлением их чувствительности к антибиотику, эти изменения могут зависеть от концентрации антибиотика. В этом случае величину электроакусти-
ческого эффекта можно было бы использовать для определения минимальной концентрации активности антибиотика. Данные, представленные на рис. 4 и 5 могут быть использованы для определения величины антибактериальной активности полимиксина. В отличие от стандартных методов, использование метода электроакустического анализа для определения активности антибиотиков в отношении микробных клеток имеет ряд преимуществ, к которым относится быстрота получения результата, простота анализа, кроме того, определение может быть осуществлено в минимальных объёмах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984.
2. Antibiotic Resistance. Stephen H. Gillespie (ed.). Methods in Molecular Medicine, 48. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2001/
3. Cavalieri S.J., Biehle J.R., Sanders W.E. Synergistic activities of clar-ithromycin and antituberculous drugs against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobi Agents Chemother 1995; 39: 1542-1545.
4. Fleschin S, Bala C, Bunaciu A.A., Panait A., AboulEnein H.Y. Enalapril microbial biosensor. Preparativ Biochem Biotechnol 1998; 28: 261—269.
5. Galindo E, Lagunas F, Osuna J., Soberon X., Garcia J.L. A microbial biosensor for 6-aminopenicillanic acid. Enzym Microb Technol 1998; 23: 5: 331—334.
6. Antibiotic Resistance Protocols: Second Edition, Gillespie SH, McHugh TD (eds.), Methods in Molecular Biology, vol. 642, Springer Science+Business Media, LLC, 2010.
7. Маршелл Э. Биофизическая химия. М.: Мир, 1981; 1: 347—358.
8. Guliy O.I., Bunin V.D., O'Neil D, Ivnitski D, Ignatov O.V. A new electro-optical approach to rapid assay of cell viability. Biosensor Bioelectron 2007; 23: 583—587.
9. Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е., Шихабудинов A.M., Васильев A.A. Новый способ подавления паразитных мод в пьезоэлектрическом резонаторе с поперечным электрическим полем. Письма в журн техн физ 2011; 37: 11: 27—33.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Гулий Ольга Ивановна — д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, профессор кафедры микробиологии, биотехнологии и химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И.Вавилова; ведущий научный сотрудник Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института, Саратов Зайцев Борис Давидович — д. физ-мат. н., заведующий лабораторией физической акустики Саратовского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института радиотехники и электроники им. В. А. Котельникова Российской академии наук, Саратов Шихабудинов Александр Магомедович — к. физ-мат. н., старший научный сотрудник лаборатории физической акустики Саратовского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института радиотехники и электроники им. В. А. Котельникова Российской академии наук, Саратов
Таким образом, впервые показана возможность регистрации чувствительности микробных клеток к антибактериальным препаратам и определения их антибактериальной активности на примере полимиксина методом электроакустического анализа клеточных суспензий.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 16-07-00818 и № 16-07-00821.
10. Гулий О.И., Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е, Шихабудинов A.M., Матора Л.Ю., Макарихина С.С., Игнатов О.В. Детекция микробных клеток с помощью электроакустического датчика. Микробиология 2013; 82: 2: 218-227.
11. Гулий О.И., Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е, Шихабудинов A.M., Дык-ман ЛА, Староверов С.А., Караваева О.А., Павлий С.А., Игнатов О.В. Определение спектра литической активности бактериофагов методом акустического анализа. Биофизика 2015; 60: 4: 722—728.
12. Baílalo A, Hatch E.R, Mizan M, Lukaszek T.J. Lateral field equivalent networks and piezocoupling factors of quartz plates driven in simple thickness modes. IEEE Trans on Ultrason, Ferroelectr Freq Contr 1986; 33: 4: 385—393.
13. Khan A., Ballato A. Lateral field excitation predictions for plates of langa-site and isomorphs driven in simple thickness mode. IEEE/EIA Intern Freq Contr Symp and Exhibition 2000; 180—185.
14. Pinkham W, French L, Frankel D, Vetelino J. A lateral field excited acoustic wave pesticide sensor. Proc. IEEE Ultrason Symp 2005; 2279—2283.
15. WarkM, Kalanyan B, Ellis L,m Fick J., ConnelL, NeivandtD, Vetelino F.A lateral field excited acoustic wave sensor for the detection of saxitox-in in water. Proc of IEEE Ultrason Symp 2007; 1217—1220.
16. Ермаков, А.Д. Ермаков А.Д.Росс мед журн 2003;7: 10—12.
17. Маниатис Т., Фрич Э, СэмбрукД. Методы генетической инженерии. Мол клон М.: Мир, 1984.
18. Сазыкин, Ю.О., Орехов С.Н, Чакалева ИИ. Биотехнология: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / под ред. А.В. Кат-линского. 3-е изд., стер. М.: Издательский центр «Академия», 2008.
Бородина Ирина Анатольевна — к. физ-мат. н., старший научный сотрудник лаборатории физической акустики Саратовского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института радиотехники и электроники им. В. А. Котельникова Российской академии наук, Саратов
Ларионова Ольга Сергеевна — д.б.н., заведующий кафедрой микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, Саратов
Жничкова Елена Григорьевна — к.б.н., доцент кафедры микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, Саратов
