CC BY
84
Определения чувствительности микробных клеток к сульфаниламидным препаратам методом электрооптического анализа
О. И. ГУЛИЙ'23, В. Д. БУНИН4, О. С. ЛАРИОНОВА2, Е. Г. ПОТЕМКИНА2, О. В. ИГНАТОВ'
1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
2 Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, Саратов
3 Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАН, Саратов
4 EloSystem GbR, Берлин, Германия
Determination of Microbial Susceptibility to Sulfanilamides by Electrooptic Analysis
O. I. GULIY, V. D. BUNIN, O. S. LARIONOVA, E. G. POTEMKINA, O. V. IGNATOV
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Saratov
N. I. Vavilov Saratov State Agrarian University, Saratov
Sarstov Research Veterinary Institute, Russian Academy of Sciences, Saratov
EloSystem GbR, Berlin, Germany
Исследовано влияние сульфаниламидных препаратов (на примере стрептоцида растворимого) на изменение электрофизических (ЭФ) свойств микробных клеток Escherichia coliштаммов XL-1, BL-Ril, Pseudomonasputida C-11 и BA-11. Установлено, что существенные изменения в ориентационных спектрах (ОС) суспензий клеток, инкубированных с различными концентрациями сульфаниламидного препарата, приводит к изменению величины электрооптического (ЭО) сигнала суспензии клеток на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля (10—1000 кГц) при использовании стрептоцида растворимого в концентрации 0,3 мкг/мл. Изучение динамики воздействия препарата на микробные клетки показало, что происходит снижение величины ЭО сигнала после 5 мин воздействия препарата на ~59% от контрольного значения (клетки без воздействия сульфаниламидного препарата), при последующем воздействии сульфаниламидного препарата величина ЭО сигнала клеток практически не изменялась (в пределах 5%). Установлено, что изменения в ОС суспензий клеток при действии стрептоцида растворимого были различными для чувствительных и резистентных штаммов микробных клеток. Показана возможность регистрации активности сульфаниламидных препаратов методом электрооптического анализа в отношении клеточных суспензий. Выявленные изменения ОС микробных суспензий при действии сульфаниламидов можно использовать в качестве теста на чувствительность к данному соединению у исследуемых клеток.
Ключевые слова: сульфаниламидные препараты, Escherichia coli, микробные клетки, чувствительность, стрептоцид растворимый.
The effect of sulfanilamides (soluble streptocid as an example) on changing of the electrophysical properties (EP) of microbial cells of Escherichia coli XL-1, BL-Ril, Pseudomonas putida C-11 and BA-11 was studied. It was shown that significant changes in the orientation spectra (OS) of the cell suspensions incubated at various concentrations of the sulfanilamide resulted in changing of the electrooptic (EO) signal of the cell suspension at the first five frequencies of the orientation electric field (10—1000 Hz) with the use of soluble streptocid in a concentration of 0.3 mcg/ml. The dynamics of the drug effect on the microbial cells demonstrated a decrease of the EO signal value 5 minutes after the exposure by ~59% vs. the control (the cells not exposed to the drug). During the following exposure the EO signal value practically did not change (within 5%). The changes of the OS of the cell suspensions exposed to soluble streptocid significantly differed for the susceptible and resistant strains. Determination of the activity of sul-fanilamides by electrooptic analysis of microbial cell suspensions was considered possible. Changing of the microbial suspencion OS under the effect of sulfanilamides can be used as a test on the microbial cell susceptibility to drugs.
Key words: sulfanilamides, Escherichia coli, microbial cells, susceptibility, soluble streptocide.
Введение
Сульфаниламидные препараты — группа химически синтезированных соединений, используемых для лечения инфекционных болезней, главным образом бактериального происхожде-
© Коллектив авторов, 2015
Адрес для корреспонденции: 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
ния. Сульфаниламиды стали первыми лекарственными средствами, позволившими проводить успешную профилактику и лечение разнообразных бактериальных инфекций. Благодаря этим препаратам, вошедшим в медицинскую практику с 1930 годов, удалось значительно снизить смертность от воспаления лёгких, заражения крови и многих других бактериальных инфекций. Сульфаниламидные препараты были открыты немец-
кой корпорацией «И.Г.Фарбениндустри» в ходе исследований азокрасителей — синтетических красителей, в структуру которых входит сульфаниламид. В 1909 г. была получена краска — хризо-идин, по своей прочности превосходящая многие другие, существовавшие в то время. В 1913 г. было установлено, что хризоидин обладает бактерицидным действием, и после испытания он был предложен как лекарственный препарат под названием пиридиум. В 1932 г. химики немецкого концерна «И.Г.Фарбениндустри» получили прон-тозил (красный стрептоцид) и в этом же году запатентовали несколько азокрасителей, в том числе и пронтозил. А в 1934 г. венгерский ученый-фармаколог Г.Домагк открыл небывалое по тем временам лечебное действие красного стрептоцида у мышей [1]. С появлением пенициллина и других антибиотиков, а в последнее время фторхиноло-нов, применение сульфаниламидов несколько сократилось, однако значения препараты этой группы не потеряли и в ряде случаев они успешно используются при инфекционных заболеваниях, вызванных чувствительными к ним микроорганизмами. Поэтому проблема определения активности сульфаниламидных препаратов в отношении микробных клеток весьма актуальна.
Сульфаниламиды препятствуют синтезу диги-дрофолиевой кислоты в микробной клетке из глю-таминовой и парааминобензойной кислот [2]. В результате такого взаимодействия происходит изменение проницаемости мембран по отношению к специфическим ионам или молекулам, что, в свою очередь, может приводить к изменению электрофизических (ЭФ) свойств микробных клеток. Данные изменения могут быть зарегистрированы методом электроориентации клеток в переменном электрическом поле [3—5]. Ранее нами проводились исследования по изучению изменений электрофизических свойств микробных клеток под влиянием ряда антибиотиков [6, 7]. С нашей точки зрения, перспективным направлением исследований является использование метода ЭО анализа клеточных суспензий для определения активности сульфаниламидов, обладающих, в отличие от антибиотиков, бактериостатическим механизмом действия. Целью данной работы является оценка изменений электрофизических свойств микробных клеток Escherichia coli при воздействии на них сульфаниламидных препаратов на примере стрептоцида растворимого.
Материал и методы
Микроорганизмы. В работе использовали бактерии штаммов Escherichia coli XL-1, BL-Ril, полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН. Штаммы Pseudomonas putida C-11 и ВА-11 получены из Саратовского НИИ «Биокатализа».
Микробные клетки выращивали на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): NaCl — 10; дрожжевой экс-
тракт — 5; пептон — 5. Культивирование проводили в аэробных условиях на круговой качалке (160 об/мин) при постоянной температуре 30°С в течение 18 ч. Выращенные клетки использовали для ЭО исследований.
Подготовка клеток к электрооптическому анализу. Перед проведением ЭО анализа клетки отмывали трёхкратным центрифугированием при 2800xg в течение 5 мин, затем ресус-пендировали в небольшом количестве дистиллированной воды (электропроводность 1,8 ^S/см). Для устранения конгломератов суспензию клеток вновь центрифугировали при 110xg в течение 1 мин и использовали суспензию, оставшуюся в надосадочной жидкости. Затем доводили оптическую плотность подготовленной суспензии D670 для каждого вида использованных микроорганизмов до 0.4-0.42.
Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий. Измерение ориентационных спектров (ОС) клеток проводили на электрооптическом анализаторе ELUS («Государственный научный центр прикладной микробиологии», Россия) с дискретным набором частот ориентирующего электрического поля 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц как описано в работе [3] при 670 нм, напряженности электрического поля 17 В/см, времени его приложения 16 с. Длина оптического пути электрооптической ячейки составляла 8 мм, объём — 1 мл, концентрация клеток — 4,5x108 клеток/мл. Количество клеток определяли стандартным методом с использованием светового микроскопа (Ergaval, Carl Zeiss, Jena, Германия).
Ориентационный спектр представлялся в виде зависимости разности значений оптической плотности суспензий (¿OD) на длине волны 670 нм от частоты воздействующего электрического поля при распространении пучка неполяри-зованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована по значению оптической плотности при 670 нм для хаотически ориентированных клеток. Для измерений использовались относительные единицы, которые с точностью до константы, равной примерно 1-5x10-32, соответствовали анизотропии поляризуемости частиц с размерностью Ф/m2.
Все анализы проводились, по крайней мере, в пяти по-вторностях, и результаты представлены в виде средних значений, полученных с указанием стандартного отклонения. Относительная погрешность результатов измерений стандартных образцов составляла ±3%.
Определение чувствительности микробов к сульфаниламидным препаратам. Проводили методом серийных разведений [8]. Количество препарата в пробирке с отчётливо видимой задержкой микробного роста представляет минимальную подавляющую концентрацию для испытываемого штамма.
Обработка клеток сульфаниламидным препаратом. Суточные культуры микробных клеток подготавливали для ЭО анализа, после чего в суспензию клеток (D670= 0.4-0.45) вносили стрептоцид растворимый (Sigma, США). Суспензия клеток с препаратом инкубировалась при 30°С в течение 5, 15, 20, и 30 минут. В качестве контроля использовалась суспензия клеток, инкубированная при той же температуре то же время без добавления препарата. После инкубации клетки отмывались трижды в дистиллированной воде (1,6—2,0 ^S/см) и использовались для ЭО измерений.
Результаты и обсуждение
Микроорганизмы в своем развитии синтезируют фолиевую кислоту. В процессе метаболизма фолиевая кислота превращается в дигидрофолие-вую, из которой образуется тетрадигидрофолие-вая кислота. Последняя контролирует биосинтез аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Механизм противомикробного действия сульфаниламидов связан с их конкурентным антагонизмом с «-аминобензойной кислотой, ко-
II / \ 11
и A=/ ö
Рис. 1. Структурная формула стрептоцида растворимого.
торая включается в структуру фолиевой кислоты. Но в присутствии сульфаниламидов фермент, осуществляющий биосинтез фолиевой кислоты, вместо w-аминобензойной кислоты использует её имитатор-антагонист (сульфамидный фрагмент). В результате микроорганизм вместо фолиевой кислоты синтезирует псевдофолиевую кислоту. Эти изменения в структуре блокируют образование нормальных метаболитов. В результате угнетается синтез нуклеиновых кислот, вследствие чего рост и размножение микроорганизмов подавляется (в чем и проявляется бактериостатиче-ский эффект) [9].
Поскольку сульфаниламидные препараты активны в отношении ряда грамотрицательных палочек, в качестве объекта исследования использовались микробные клетки E.coli. В связи с тем что сульфаниламидные препараты имеют общий механизм действия, в наших исследованиях был использован один вид сульфаниламидного препарата — стрептоцид растворимый (Streptocidum solubile).
Стрептоцид растворимый (Streptocidum solubile), (n-аминобензол-сульфамид) — препарат, хорошо растворимый в воде, эффективен при стрептококковых, гонококковых, пневмококковых и колибациллярных инфекциях. Структурная формула препарата представлена на рис. 1. Препарат активен в отношении грамположительных и грамотрицательных кокков, Escherichia coli, Shigella spp., Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, Bacillus anthracis, Cory neb acterium diphtheriae, Yersinia pestis, Chlamydia spp., Actinomyces israelii, Toxoplasma gondii.
Первоначально проводили исследования с использованием клеток E.coli штамма XL-1. Бактерио-статическое действие сульфаниламидов проявляется только при определённой концентрации препаратов в окружающей микробов среде. Эта концентрация должна быть достаточна для предотвращения использования микроорганизмами w-амино-бензойной кислоты, содержащейся в тканях. Поэтому изначально проводили эксперименты по определению оптимальной концентрации препарата. Для этого в суспензию клеток изучаемого штамма вносили сульфаниламидный препарат в разных концентрациях и регистрировали изменения ЭО параметров суспензии. При исследовании изменений
Рис. 2. (а) Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток E.coli XL-1 при действии разных концентраций стрептоцида растворимого. б. Изменение величины ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц: 1 — контроль (суспензия клеток без добавления препарата); суспензия клеток с добавлением разных концентраций препарата: 2— 0,04; 3 — 0,08; 4 — 0,3; 5— 0,6 мкг/мл.
ЭО характеристик клеточной суспензии клеток E.coli штамма ХЬ-1 при действии стрептоцида растворимого в разных концентрациях (0,04, 0,08, 0,3, 0,6 мкг/мл) бышо показано, что изменения в ОС суспензий клеток Exoli ХЬ-1 имели место на частотах ориентирующего электрического поля в интервале 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц (рис. 2). Поскольку ранее нами было показано, что ЭО анализатор фиксирует значительные изменения ЭО параметров суспензии клеток в течении 5—10 мин воздействия антибактериального препарата [6—7], то на данном этапе время воздействия стрептоцида растворимого составляло 10 мин. Для удобства представления экспериментальных данных была использована величина ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц (см. рис. 2).
Как видно из представленный: данныгх (см. рис. 2), происходит снижение величины ЭО сигнала суспензии клеток штамма ХЬ-1 при концентрации стрептоцида растворимого 0,04 мкг/мл на 35% по сравнению с контролем (клетки без воздействия сульфаниламидного препарата). При этом макси-
500 -
450 -
а 400 5
1 350 Н
а
3 300 -
-с
Р 250 =
| 200 -
5 150 О
100 50 0
1000 Частота, кГц
п п
2 3
Рис. 3. (а) Динамика изменения ОС клеток Е.еоН ХИ, инкубированных с стрептоцидом растворимым (0,3мкг/мл): 1— контроль суспензия клеток без добавления препарата; суспензия клеток с добавлением препарата: 2 — 5 мин; 3 — 10 мин; 4 — 20 мин; 5 — 30 мин. б. Изменение величины ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц.
мальное снижение величины ЭО сигнала суспензии клеток наблюдается при концентрации сульфаниламидного препарата 0,6 мкг/мл — на ~77% по сравнению с контролем. Дальнейшее увеличение концентрации сульфаниламида не приводило к существенным изменениям величины ЭО сигнала, и изменения величины ЭО сигнала фиксировались в пределах ~5%. Уменьшение величины ЭО сигнала клеток при концентрации сульфаниламида 0,3 и 0,6 мкг/мл, возможно, обусловлено разбуханием клеток, прекращением размножения и бактериостатическим действием препарата в отношении клеток E.coli штамма ХЬ-1. В последующих экспериментах использовали концентрацию препарата 0,3 мкг/мл.
При изучении динамики воздействия сульфаниламидного препарата (концентрация 0,3 мкг/ мл) на микробные клетки штамма ХЬ-1 в течение 5, 10, 20, 30 мин было показано, что происходит снижение величины ЭО сигнала после 5 мин воз-
450 -
400 ■
г 350 -
=
& 300 ■
X
■Л
X -о 250 -
-
г 200 -
о
X
о 150 "
(=Г
Г)
ю 100 -
50 -
0 -
1000 Частота, кГц
5 200 -
73 100 -
п
Рис. 4. (а) Динамика изменения ОС клеток Е.еоН В1-К\\, инкубированных с стрептоцида растворимого (0,3мкг/мл): 1 — контроль (суспензия клеток без добавления препарата); суспензия клеток с добавлением препарата: 2 — 5 мин; 3 — 10 мин; 4— 20 мин; 5— 30 мин. б. Изменение величины ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц.
действия на 30%, после 10 мин воздействия — на 59% от контрольного значения (клетки без воздействия сульфаниламидного препарата); при последующем воздействии сульфаниламидного препарата величина ЭО сигнала клеток практически не изменялась (рис. 3, а). Для удобства представления экспериментальных данных была использована величина ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц (рис. 3, б).
Таким образом, регистрируя изменения ЭО параметров суспензии клеток при добавлении стрептоцида растворимого, можно сделать вывод о том, что используемый препарат активен в отношении клеток Е.соИ штамма ХЬ-1, т. е. данный микроорганизм является чувствительным к изучаемому веществу.
На следующем этапе проводились исследования с микробными клетками Е.соИ другого штамма ВЬ-ЯИ. Для этого в суспензию клеток штамма ВЬ-ЯЦ вносили стрептоцид растворимый в концентра-
а
а
б
б
1
4
5
1
2
3
4
5
ции 0,3 мкг/мл и фиксировали изменения величины ЭО сигнала через разные временные промежутки (рис. 4). Бышо показано, что величина ЭО сигнала после 5 мин воздействия уменьшается на 67% от контрольного значения (клетки без воздействия сульфаниламидного препарата), при последующем воздействии сульфаниламидного препарата величина ЭО сигнала клеток практически не изменялась (в пределах ~5%) (рис. 4, а). Для удобства представления экспериментальных данных была использована величина ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц (рис. 4, б).
Как видно из полученных данных, при инкубации клеток штаммов ХЬ-1 и ВЬ-Ш1 с сульфаниламидным препаратом происходит значительное снижение величины ЭО сигнала, вероятно, микробных клетки данных штаммов являются чувствительными к стрептоциду растворимому. В результате действия сульфаниламидного препарата на микробные клетки происходит изменение проницаемости мембран по отношению к специфическим ионам или молекулам, что, в свою очередь, приводит к изменению электрофизических свойств микробных клеток. Снижение сигнала в области частот 200 кГц- 1 МГц обусловлен изменением электропроводности цитоплазмы при прочих равныгх условиях (постоянном ОБ, электропроводности среды и электропроводности суспензии). В растущих клетках — это свидетельствует о повышении концентрации ионов органических кислот, ионов калия, протонов и т.д. с учётом степени их диссоциации от внутреннего значения рН. Как результат воздействия препарата происходит повышение ЭО сигнала на активной фазе и устранение за счёт активного транспорта ионов наружу при завершении процесса. В стационарной культуре — это либо активный транспорт, либо, что более вероятно, перфузия мембраны, когда локальные повреждения мембраны способствуют более сильному пассивному транспорту ионов по градиенту во внешнюю непроводящую среду.
На частотах 500 кГц- 1 МГц величина ЭО сигнала линейно связана с величиной удельной электропроводности клеточной цитоплазмы. Поэтому нормировка ЭО спектра, полученного после воздействия антибактериального препарата, на величину сигнала от чистой культуры клеток на частоте, например 1 МГц, позволяет определить изменение степени проницаемости мембраны. При пассивной диффузии через мембрану степень её проницаемости определяется количеством вновь образованный пор. При малых повреждениях мембраны по изменению нормированного ЭО сигнала таким образом можно напрямую определять кинетику изменения этого параметра.
На следующем этапе проводились эксперименты по изучению изменений ЭО параметров
суспензии клеток других микроорганизмов. В качестве тестируемых обыектов исполызовали микробные клетки 2 штаммов Pseudomonas putida C-11 и ВА-11. Для этого к суспензии клеток P.putida C-11 добавляли стрептоцид растворимый (0,3 мкг/мл), при этом время воздействия составляло 5,10, 20, 30 мин, и измеряли ЭО параметры клеток. В резулытате исследований было показано, что значителыныгх изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток при воздействии стрептоцида растворимого не происходит. Для микробныгх клеток P.putida ВА-11 получены аналогичные резулытаты. Из полученных данных можно заключиты, что микробные клетки P.putida C-11 и ВА-11 устойчивы к воздействию изучаемого препарата.
Таким образом, в резулытате проведённыгх исследований показано, что изменения ОС суспензий при действии стрептоцида растворимого можно исполызоваты в качестве показателя активности препарата в отношении микробных клеток. В настоящее время для определения чувствителы-ности микробов к сулыфаниламидным препаратам исполызуют стандартные методы диффузии в гелы агара с применением дисков, методы серий-ныгх разведений, а также модификации этих стандартный методик [8]. Наиболее доступным интег-ралыным методом оценки качества определения чувствителыности является сопоставление ре-зулытатов определения чувствителыности (МПК или диаметров зон подавления роста) контролы-ныгх (референтных) штаммов микроорганизмов с соответствующими показателями, приведёнными в их паспортной характеристике. Тестирование контролыных штаммов проводят в соответствии с описанными методами, параллелыно тестированию клинических изолятов [10]. Кроме того, созданы автоматизированные системы для определения активности антибактериалыных препаратов. В одних системах автоматизированы толыко операции разведения и инкубации, тогда как рост бактерий определяется традиционными методами. В других системах все началыные операции выполняются вручную и автоматизированы лишы этапы считывания и регистрации ре-зулытатов. Некоторые системы автоматизации предусматривают создание программ для всех операций, исполызуемых в определении (приготовление образца и бактериалыного посевного материала, инкубация, считывание резулытатов и их регистрация) [11—14]. Основные проблемы данных методов состоят в сборе и подготовке образца, длителыности получения резулытата, устранении ложноположителыных резулытатов. Поэтому проблема разработки новых технологий и методов определения активности препаратов к бактериям весыма актуалына для микробиологии, медицины и ветеринарии. Основываясы на полу-
ченных данных, можно сделать вывод, что использование метода ЭО анализа клеточных суспензий для определения чувствительности бактерий к сульфаниламидным препаратам является достаточно перспективным. В отличие от стандартных методов, использование метода ЭО анализа для определения активности сульфаниламидных препаратов в отношении микробных клеток имеет ряд преимуществ, к которым отно-
ЛИТЕРАТУРА
1. Domagk G. Ein Beitrag zur Chemotherapie der bakteriellen Infektionen, Deutsche Medizinische Wochenschrift 1935; 61: 250—253.
2. Краткая Медицинская Энциклопедия, издательство «Советская Энциклопедия», М.: 1989.
3. Ignatov O.V., Guliy O.I., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. Effect of P-nitrophenol metabolites on microbial cell electrophysical properties. FEMS Microbiol Lett 2002; 214:1: 81—86.
4. Bunin V.D., VoloshinA.G. Determination of cell structures, electrophysical parameters, and cell population heterogeneity. J Colloid Interface Sci 1996; 180: 122—126.
5. Маршелл Э. Биофизическая химия. М.: Мир, 1981; 1: 347—358.
6. Гулий О.И., Маркина Л. Н, Игнатов О.В., Щеголев C. Ю, Зайцева И. С, Бунин В.Д., Игнатов В В. Влияние ампициллина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli. Микробиология 2005; 74: 1: 126—131.
7. Гулий О. И., Маркина Л. Н, Бунин В. Д., Игнатов В В., Игнатов О. В. Исследование электрооптических параметров суспензий клеток
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Гулий Ольга Ивановна — д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук; профессор кафедры микробиологии, биотехнологии и химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова; ведущий научный сотрудник Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии наук.
Бунин Виктор Дмитриевич — д.т.н., научный руководитель фирмы EloSystem GbR, Берлин, Германия.
сится быстрота получения результата, простота анализа, кроме того, определение может быть осуществлено в минимальных объёмах.
Использование ЭО метода анализа клеточных суспензий при воздействии на них сульфаниламидов может предоставлять, с нашей точки зрения, широкие возможности для решения различных биотехнологических задач, в том числе, и для определения антибактериальной активности препаратов.
Escherichia coli при действии канамицина. Микробиология 2008; 77: 3: 380—385.
8. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984; 1: 458—464.
9. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. III издание. Учебник. Пятигорск, 2003.
10. Методические указания МУК 4.2.1890-04.
11. Galindo E., Bautista D, Garcia J.L., Quintero R. Microbial sensor for penicillins using a recombinant strain of Escherichia coli. Enzym Microb Technol 1990; 12: 9: 642—646.
12. Galindo E., Lagunas F., Osuna J., Soberon X., Garcia J.L. A microbial biosensor for 6-aminopenicillanic acid. Enzym Microb Technol 1998; 23: 5: 331—334.
13. Fleschin S, Bala C., Bunaciu A.A., Panait A., AboulEnein H.Y. Enalapril microbial biosensor. Preparat Biochem Biotechnol 1998; 28: 3: 261—269.
14. Cavalieri S. J., Biehle J.R., Sanders W. E. JR. Synergistic activities of clarithromycin and antituberculous drugs against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis// Antimicrobial Agents Chemother 1995; 39: 7: 1542—1545.
Ларионова Ольга Сергеевна — д.б.н., заведующий кафедрой микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова.
Потемкина Елена Григорьевна — к.б.н., доцент кафедры микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова.
Игнатов Олег Владимирович — д.б.н., заведующий лабораторией физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук.
