CC BY
11
Определение аутоантител против Pi-адренорецептора и влияние их удаления на сократительную функцию миокарда левого желудочка у больных дилатационной кардиомиопатией
Е.А. Табакьян*, А.Г. Тоневицкий, Д.М. Атауллаханова*, А.Ю. Заруба*, В.В. Кухарчук*
НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава, *НИИ клинической кардиологии
им. А.Л.Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава.
Москва, Россия
Pi-adrenoreceptor antibody measurement and antibody removal effects on left ventricular contractility in dilated cardiomyopathy patients
E.A. Tabakyan*, A.G. Tonevitsky, D.M. Ataullakhanova*, A.Yu. Zaruba*, V.V. Kukharchuk*
Research Institute of Transplantology and Artificial Organs, State Federal Agency for Health and Social Development, *A.L. Myasnikov Research Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiology Scientific and Clinical Complex, State Federal Agency for Health and Social Development. Moscow, Russia
Цель. Разработать тест-систему для определения аутоантител против Pi-адренорецептора (анти-Pi-AP). Изучить влияние удаления аутоантител на сократительную функцию миокарда левого желудочка (ЛЖ). Материал и методы. Пептиды, соответствующие фрагментам второй внеклеточной петли Pi-AP человека (197-222 а.о.) были синтезированы модифицированным твердофазным методом и лиофилизованы. Контроль молекулярной массы осуществляли с помощью лазерно-десорбционной масс-спектрометрии. Были обследованы 47 больных с целью выявления анти-Pi-AP. Из них с диагнозом дилатационная кардио-миопатия (ДКМП) — 22, ишемическая кардиомиопатия — 8, постинфарктный кардиосклероз — 6, миокардит — 3, алкогольная кардиомиопатия — 1, посттрансплантационная кардиомиопатия — 7. Удаление анти-Pi-AP проводили 4 больным с ДКМП: 3 — методом плазмафереза (ПФ) и 1 пациенту — методом иммуноадсорбции (ИА).
Результаты. Разработана иммуноферментная тест-система для определения аутоантител с использованием в качестве антигена пептида, содержащего 26 аминокислот второй внеклеточной петли Pi-AP. Показано, что удаление анти-Pi-AP у больных ДКМП методами ИА и ПФ приводит к улучшению сократительной функции миокарда ЛЖ.
Заключение. Важно выяснить, объясним ли факт улучшения сократительной функции миокарда только удалением анти-Pi-AP. Следует разработать более совершенные методы детекции анти-Pi-AP, других аутоантител к миокарду, установить их роль в нарушении сократительной функции миокарда.
Ключевые слова: аутоантитела против Pi-адренорецептора, иммуноадсорбция, плазмаферез, сократимость миокарда левого желудочка.
Aim. To develop a test system measuring Pi-adrenoreceptor antibody (anti-Pi-AR) level. To study the effects of autoantibody removal on left ventricular (LV) contractility
Material and methods. Peptides, according to second human extracellular Pi-AR loop fragments (i97-222 amino acid fragments), were synthesized by modified hard-phase method and then lyophilized. Molecular mass control was performed by laser desorption mass spectrometry. In total, 47 patients were examined, with the aim of anti-Pi-AR detection. Dilated cardiomyopathy (DCMP) was diagnosed in 22 patients, ischemic CMP — in 8, postinfarction cardiosclerosis — in 6, myocarditis — in 3, alcohol CMP — in i, and post-transplantation CMP — in 7 participants. Anti-Pi-AR were removed in 4 DCMP patients, by plasmapheresis (PF; n=3) or immunoadsorption (IA; n=i).
©Коллектив авторов, 2006 e-mail: tabakyan@mail.ru Тел.: (495) 4i4-63-48.
Results. A new immuno-enzyme test system for autoantibody detection has been developed, using the second extracellular Pj-AR loop 26 amino acid peptide as the antigen. Anti-Pj-AR removal by IA or PF methods resulted in improved LV contractility among DCMP patients.
Conclusion. It is important to determine whether LV contractility improvement is explained by anti- Pj-AR removal exclusively. More advanced methods for anti- Pj-AR and other anti-myocardial antibody detection should be developed, and auto-antibodies’ role in impaired myocardial contractility should be studied.
Key words: Pj-adrenoreceptpor auto-antibodies, immuno-adsorption, plasmapheresis, left ventricular myocardial contractility.
Введение
Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) определяется как заболевание сердца, характеризующееся расширением и прогрессирующим нарушением сократимости миокарда левого желудочка (ЛЖ) или обоих желудочков. Несмотря на использование для лечения хронической сердечной недостаточности (ХСН) новых групп лекарственных препаратов, смертность этой категории больных за 5-летний период составляет от 20-25% до 46% [1,2]. Нарушения гуморального и клеточного иммунитета, а именно аутоиммунная реактивность, рассматривается как один из главных механизмов в патогенезе ДКМП [3]. Показана роль аутоантител к вгадренорецепторам (анти-^-АР) в нарушении функционирования симпатоадре-наловой системы сердца. Установлено, что содержание антител, взаимодействующих с функциональными эпитопами Р1-АР у больных с ДКМП, осложненной желудочковыми аритмиями и нарушениями проводимости, встречается значительно чаще, чем с ДКМП без этих осложнений [4]. Высокий титр анти-^-АР обнаруживается в сыворотке примерно 35% больных с ДКМП [5].
На основании фармакологических критериев в-АР подразделяют на вь в2, вз-подтипы, классически определяя их как рецепторы сердечной ткани, гладких мышц дыхательных путей и жировой ткани, соответственно. В мембранах кардиомиоцитов в-АР представлены в основном в1 и в2-подтипами. Все подтипы вАР представляют собой гликопротеины с молекулярной массой порядка 65 кДа. Гены в-АР расположены на длинном плече хромосомы 5, имеют размер порядка 1200 пар оснований и не содержат интронов [6].
вгАР составляет приблизительно 80% всех в-АР сердца. Подобно в2-АР (54% полной гомологии), вгАР имеет три внеклеточные и три внутриклеточные полипептидные последовательности («петли») с 7 трансмембранными а-спиралями. Внутриклеточными доменами в-АР
26
связываются с стимуляторными гетеротример-ными гуанинтрифосфат (ГТФ)-связывающими белками ^-белки). Активация вгАР нуждается в специфической конформации рецептора, стабилизируемой при помощи агониста [7]. Кроме того, причиной активации рецептора, возможно, является димеризация в1-АР, что также может лежать в основе агонистических свойств анти-в1-АР антител, обнаруженных у пациентов с ХСН. Стимуляция в-АР вызывает каскад последовательных реакций: во-первых происходит активация G белков, затем адени-латциклазы с последующим образованием циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), и наконец, цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА). Активированная ПКА последовательно фосфорилирует молекулы, необходимые для регулирования концентрации саркоплазмати-ческого [Са2+] [7], и, таким образом, возрастает сократимость кардиомиоцитов, хронотропия, склонность к отклонениям от нормы. Активация G белков может также увеличить направленный ток в Са2+ -каналах Ь-типа [8].
Важной чертой функционирования в-АР системы является достаточно быстрая потеря чувствительности (десенситизация) в ответ на продолжительное действие или чрезмерно высокую дозу агониста. Десенситизация происходит за счет фосфорилирования рецептора регуляторными киназами. Фосфорилирование снижает способность связанного с агонистом рецептора стимулировать Gg белок. Для в-АР известно два вида ПКА, вызывающих фосфо-рилирование, и, следовательно, различные механизмы десенситизации. Быструю десенсити-зацию в-АР вызывает специфическая в-адре-нергическая киназа (в-АРК) или другие близко родственные G белок-сопряженные рецепторные киназы ^РК), которая за короткое время (время полуреакции составляет ~ 20 сек.) фосфорилирует связанный с агонистом рецептор. Это фосфорилирование сопровождается связыванием с другим цитозольным белком-кофактором, в-арестином, что приво-
дит к отделению рецептора от G-белка с дальнейшей интернализацией рецептора внутрь клетки. Существует также более общая, неспецифическая форма десенситизации (гетероло-гическая десенситизация), катализируемая цАМФ зависимой ПКА, которая действует медленнее (время полуреакции ~ 3,5 мин.) и которая может активироваться, наряду с различными другими лигандами, более низкими, чем для в-АРК, концентрациями в-агонистов. Кроме функционального нарушения сопряжения рецепторов с Gs-белком и их интернализации существует более глобальный процесс десенсибилизации в ответ на долговременное (часы или дни) воздействие агониста, который сопровождается необратимой потерей количества рецепторов (downregulation). В основе этого процесса лежат два главных механизма — усиленный распад рецепторов и их сниженный синтез [3].
В экспериментах на животных было показано, что длительная иммунизация пептидом, соответствующим второй экстрацеллюлярной петле вгАР вызывала СН, подобную таковой при ДКМП [9]. Экспериментальная модель ДКМП продемонстрирована в работе [10]. Исследователи применили изогенные инъекции анти-в1-АР антисывороток у инбредных крыс для развития у них КМП, возникающей без воспаления. Аутоантитела к вгАР иммуноглобулины подкласса G (анти-в1-АР IgG) оказались самодостаточны вызвать множество дисфункций миокарда, характерных для развития систолической СН [10].
Известно, что удаление аутоантител методом иммуноадсорбции IgG приводит к улучшению сократительной функции миокарда, показателей центральной гемодинамики и качества жизни пациентов с ДКМП [11,12].
Остаются не выясненными вопросы: какая стратегия — избирательная иммуноадсорбция (ИА) на сорбентах, содержащих фрагменты второй петли вгАР или полное удаление иммуноглобулинов более эффективна; надо ли понижать максимально концентрацию анти-в1-АР или достаточно удалить 60-70% для достижения клинического (терапевтического) эффекта. Во втором случае возможно использование плазмафереза (ПФ), что значительно проще и доступнее. В данной работе впервые сравнили влияние двух методов лечения на состояние насосной функции сердца, течение заболевания и клинический эффект от этих процедур.
Материал и методы
Методика определения аутоантител. Пептиды, соответствующие фрагментам второй внеклеточной петли Pj-AP человека (i97-222 а.о.) были синтезированы модифицированным твердофазным методом и лиофилизованы как описано ранее [4]. Контроль молекулярной массы осуществляли с помощью лазерно-десорбционной масс-спектрометрии (Thermo Bioanalysis Corp., Anra^).
В иммуноферментном анализе (ИФA) растворы пептидов в карбонатном буфере (0,04 М Na2CO3, pH 9,6) сорбировали по 100 мкл в лунках поливинилхлоридных планшетов (Titertek, Шотландия). Для блокирования неспецифических реакций использовали 5% раствор обезжиренного молока в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБP) pH 7,4, по 100 мкл в лунку в течение 20 мин. при 37оС. Исследуемые сыворотки крови разводили в 3% растворе обезжиренного молока в ФСБ^ содержащего 0,05% твина-20, вносили по 100 мкл в лунку и выдерживали на планшете в течение 2 ч при 37оС. Для отмывки планшетов и разведения конъюгата использовали ФСБ^ содержащий 0,05% твина-20. В качестве вторых антител использовали конъюгат с пероксидазой хрена кроличьих антител к иммуноглобулинам человека (ИМТЕК, Pос-сия). Конъюгат разводили в ФСБ^ содержащем 0,05% твина-20, вносили по 100 мкл в лунки планшета и инкубировали 45 мин. при 37оС. В качестве субстрата использовали раствор о-фенилендиамина и перекиси водорода в фосфатно-цитратном буфере, рН 4,7. Pеакцию останавливали 10% раствором серной кислоты, оптическую плотность замеряли на многоканальном спектрофотометре Multiscan MS (Labsystems, Финляндия) при 492 нм. Для контроля сорбции пептидов на планшет использовали систему со стрептавидин-пероксидазой. Для контроля неспецифических реакций в ИФA образцов, содержащих аутоантитела, использовали несорбированные (без антигена) лунки планшета.
Отрицательным контролем служили сыворотки крови здоровых доноров, а положительным — сыворотки крови больных с подтвержденным диагнозом ДКМП, наличием систолической СН, снижением фракции выброса (ФВ) ЛЖ < 40%, находящиеся на лечении в НИИ трансплантологии.
Для предсказания антигенности используют показатели, отражающие физико-химические характеристики отдельных аминокислот. Метод Хоппа и Вудса базируется на анализе первичной структуры белков и предсказании антигенных эпитопов на основе локальной гидрофиль-ности аминокислотных остатков. Метод Джеймсона и Вульфа основан на анализе доступности аминокислотных остатков растворителю, гибкости углеродного скелета и особенностях вторичной структуры [13].
Обследование пациентов и проведение процедур ПФ и ИА. Были обследованы 47 больных с целью выявления анти-Pj-AP. Из них с диагнозом: ДКМП — 22; ишемическая кардиомиопатия (ИКМП) — 8; постинфарктный кардиосклероз (ПИКС) — 6; миокардит (МК) — 3; алкогольная КМП — 1; посттрансплантационная КМП — 7 (после пересадки сердца). Повышенное содержание анти-Pj-AP наблюдалось у 7 больных с ДКМП, 3 — с ИКМП, 1 — с МК, 3 — с посттрансплантационной КМП. Удаление ан-ти-P^AP проводили 4 больным с ДКМП: 3 — методом ПФ и 1 пациенту методом ИЛ.
Все больные мужчины с ДКМП, систолической СН (ФВ ЛЖ < 40%), наличием анти-P^AP (дважды подтверждено до проведения процедур). В результате обследова-
ния у них были исключены: коронарная болезнь сердца (^C) после проведения коронароангиографии (KAF), клапанные поражения миокарда, алкогольная KM^, артериальная гипертония (AT), хронические заболевания легких (бронхит, эмфизема, пневмосклероз), обострение сопутствующих хронических инфекций, сахарный диабет (ОД), гипотиреоз. У всех пациентов был синусовый ритм; наличие постоянной формы мерцательной аритмии служило исключающим критерием в связи со сложностью точной оценки динамики размеров полостей сердца, ФВ ЛЖ.
Пациенты получали стандартную терапию — ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, диуретики, Р-адреноблокаторы, антагонисты альдостерона; один пациент получал дигоксин, не менее З месяцев до проведения процедур HA или ПФ. Терапия не была изменена по завершении процедур. Mетоды обследования до курса процедур и в последующие контрольные точки: эхокардиография (ЭхоЕГ), проба на толерантность к физической нагрузке (ТФН) (тест с б-минутной ходьбой), суточное мониторирование электрокардиограммы (CM ЭСТ); до и после каждой процедуры определение содержания калия, натрия, креатинина, общего белка, альбуминов, IgG в плазме крови, анти-PJ-AP.
Процедуры ПФ проводили каждый день курсом по З-4 дня. Применяли непрервный ПФ методом плазмасе-парации (сепаратор крови COBE-SPECTRA, CШA). За процедуру удаляли 1/2 объема плазмы. Объем плазмы пациента рассчитывали по номограмме с учетом веса, пола, гематокрита. Замещение в эквивалентном объеме раствором Рингера, реополиглюкином, раствором альбумина 5% по 40г за процедуру.
Два курса ИA: первый курс 4 дня подряд по 1 процедуре и второй курс З дня подряд осуществляли путем перфузии плазмы, отделенной на сепараторе крови COBE-SPECTRA, поочередно через 2 колонки с поликлональными антителами — против IgG человека (An^m^ По-кард, Россия). Порость тока плазмы через колонку — 25-З0 мл/мин. Объем перфузированной плазмы в среднем за процедуру составил 4700 мл, а время процедуры в среднем — 200 мин. ^ждая колонка, прошедшая цикл сорбции Ig, регенерировалась путем последовательного ее промывания: а) 400 мл. физиологического раствора, б) 400 мл. глицинового буфера с pH 2,5 во время чего происходит десорбция Ig, в) 400 мл. фосфатного буфера с pH 7,4 для восстановления физиологического pH колонки, г) 400 мл. физиологического раствора. После этого колонка готова к повторному применению на процедуре или заполнению консервирующим раствором азида натрия и хранения при температуре +4°C до очередной процедуры у данного пациента. Замещение во время HA не проводили. В качестве антикоагулянта в обоих случаях использовали гепарин.
Непосредственно после последней процедуры курса ПФ и ИA назначали иммунотерапию внутривенно препаратом донорского иммуноглобулина человека Октагам® (OCTAPHARMA Pharmazeutika Production ges m.b.H, Ab-стрия) в дозе 0,25 г/кг.
Результаты и обсуждение
Известно, что основной мишенью для аутоантител является вторая внеклеточная петля рецептора. В опытах in vitro такие антитела
197 200 205 210 215 220 222
Н№тАЕ$ОЕАКЕСтаОРКССОРУгаК (18,1)
HWWRAE (27,2) ОБУгаЯ (27,5)
RAESDE (27,3)
БЕАЯЯСУ (27,4)
АЯКСГОО (28,2)
Рис. 1 Химически синтезированные фрагменты второй внеклеточной петли (197-222) Р^-АР человека.
оказывали стимулирующее влияние на изолированные крысиные кардиомиоциты.
Для определения сайтов связывания аутоантител провели пептидное картирование второй внеклеточной петли ві-АР (аминокислотная последовательность 197-222). Химически синтезированы были короткие 6-7 членные пептиды, соответствующие различным фрагментам этой последовательности (рисунок 1). Также был синтезирован 26-членный пептид (197-222). Взаимодействие аутоантител с различными фрагментами Р^-АР изучалось с помощью метода иммуноферментного анализа. Среди коротких пептидов наиболее активными были пептиды (204-210) [ОЕАЯЯСУ] (последовательность аминокислот в белке, заглавные буквы означают первые буквы названия аминокислоты) (рисунок 2). Этот пептид соответствует пикам расчетных профилей антигенности (рисунок 3). При этом для предсказания В-клеточных эпитопов было использовано два метода: шкала гид-рофильности и профиль индекса антигенности, включающий в себя такие параметры, как гид-рофильность, доступность, подвижность и две шкалы вторичной структуры [4].
Пептид [ОЕАЯЯСУ] содержит также в своем составе аминокислотный остаток Су8209 (рисунок 3). Аминокислотные остатки Су8131 и Су8209 участвуют в образовании дисульфидной связи между первой и второй внеклеточными петлями рецептора и таким образом играют существенную роль в поддержании правильной конформации лиганд-связывающего центра [14]. По сравнению с короткими пептидами максимальной антигенной активностью в ИФА обладал 26-членный пептид (197-222), что, очевидно, связано с гетерогенностью популяции аутоантител, а также, возможно, со стеричес-кими факторами — меньшей степенью деформации молекулы при иммобилизации.
На следующем этапе работы определяли аминокислотные остатки, гипотетически входящие в состав активного центра Р1-АР. Наиболее исследована структура активно го центра Р2-АР Агонист-связывающий центр Р2-АР располо-
жен на 1/3 глубины мембранного пакета рецептора (15А°) с внешней стороны клеточной мембраны. Критическими для связывания агониста являются остатки аспарагиновой кислоты (0113) на третьем гидрофобном трансмембранном домене, два остатка серина (8204 и 8207) на пятом гидрофобном домене и два остатка фенилаланина (Б282 и Б290) на шестом гидрофобном домене. Таким образом, существует модель аго-нист-связывающего сайта Р2-АР? в которой лиганд связывается внутри мембранного гидрофобного кармана рецептора и «заякоривается» специфическими молекулярными взаимодействиями между аминокислотными остатками рецептора и функциональными группами лиганда [15,16]. На рисунке 4 показано выравнивание участков последовательностей III, V и VI трансмембранных доменов ^!- и Р2-АР; аналогичные аминокислоты и Р2-АР совпадают. Таким образом, можно предположить, что для ві -АР ана- £
логичные аминокислоты также входят в состав з
активного центра. с
Чтобы определить к какому классу имму- ^
ноглобулинов относятся исследуемые аутоан- Е
титела в ИФА для проявления реакции использовали меченые пероксидазой моноклональные антитела к различным классам иммуноглобулинов человека. Было установлено, что аутоантитела относятся к иммуноглобулинам М и G, чаще всего имеет место сочетания IgG и ^М. Известно, что IgG и ^М аутоантитела присутствуют при органоспецифических аутоиммунных заболеваниях [17]. При этом патогенность, как правило, характерна для антител к антигенам клеточной поверхности, в частности к рецепторам (т.н. реакция гиперчувствительности II типа). Разработанный метод определения аутоантител был апробирован на образцах сыворотки крови больных с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и здоровых доноров. Предел чувствительности в тест-системе для несомненно положительных сывороток соответствовал разведению 1/625. Исходя из калибровочной кривой по препарату IgG человека в системе сэндвич-ИФА, ориентировочно оценили концентрацию аутоантител в положительных сыворотках как 5-10 мкг/мл, что приблизительно соответствует 30-70 нМ.
Одной из причин появления таких аутоантител считают наличие перекрестных реакций с бактериальными белками. При хроническом повреждении тканей миокарда, вызванном
0,6 -0,5 -
2
~ °'4" ГП 1—1
о>
с 0,3° —
0,2" —
0,1 "
о -М——^—L-1 I ——L-n-1—L-1—,
27,2 27,4 28,2 18,1
пептиды
□ положительная □ отрицательная сыворотка сыворотка
Примечание: концентрации пептидов 27,2; 27,4; 28,2 10 мкг/мл, пептида 18,1-1 мкг/мл.
Рис. 2 Взаимодействие аутоантител с различными фрагментами Pj-AP (разведение сывороток 1/25).
2,21,71.2 -0,70,2'
-о,з-
-0,8 ...........................................
0 5 10 15 20 25
аминокислота
------метод Норр & .....метод Jameson &
Woods Wolf
Примечание: последовательность 204-210 подчеркнута, аминокислотный остаток Cys209 помечен звездочкой. Рис. 3 Pасчетные профили антигенности второй внеклеточной петли Pj-AP.
138
ELWTSV§VLCVTASIETLS
113
EFWTSI§VLCVTASIETLC * ***;************
229 232
nrayaias|s|w|s|fyvplcimafvylr
204 207
nqayaias|s|iv|s|fyvplvimvfvysr * *******:******* ** *** *
333 341
KALKTLGI IMGV(F|TLCWLPF[F|LANV
282 290
KALKTLGI IMGT|F|TLCWLPF|F|l VNI *********** *********: *;
Примечание: идентичные аминокислотные остатки обозначены звездочкой; сходные — двоеточием внизу; аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра выделены прямоугольниками.
Pro. 4 Выравнивание участков последовательностей III, V и VI трансмембранных доменов Pi- и р 2-AP.
Ill: Pi-АР Рг-АР
V: Pi-АР
Рг-АР
VI: Pi-АР
Рг-АР
Содержание общего белка, IgG, альбумина, анти- Таблица 1 -Р^АР после курсов процедур ПФ и ИА
Пациенты ПФ/ИА ^О, г/л до ^ после Общий белок, г/л до ^ после Альбумин, г/л до ^ после Анти-в-АР А492, опт.ед. до ^ после
«С» (ПФ) 12,56 ^ 3,53 76 ^ 53 45 ^ 31 0,40 ^ 0,26 (К-0,14, К+0,71)
«М» (ПФ) 12,19 ^ 4,51 74,5 ^ 45 43,5 ^ 30 0,48 ^ 0,29 (К-0,08, К+0,59)
«Л» (ПФ) 12,36 ^ 3,91 68 ^ 51 40,6 ^ 35 0,34 ^ 0,18 (К-0,16, К+0,5)
«Ш» (ИА) 14,00 ^ 2,60 65 ^ 50 43 ^ 34 0,96 ^ 0,42 (К-0,38, К+0,98)
Таблица 2
Результаты ЭхоКГ пациентов с ДКМП до и через 2 недели после курсов ПФ и ИА
Пациенты ПФ/ИА КДР ЛЖ, см. КСР ЛЖ, см. СДЛА, мм рт.ст. ПЖ, см. ФВ ЛЖ, %
до ^ после до ^ после до ^ после до ^ после до ^ после
«С» (ПФ) 9,1 8,2 - - 58 45 2,6 2,6 19 23
«М» (ПФ) 6,8 5,8 5,8 4,2 < 25 < 25 2 4 5 3 ,6 3, ,6 3,
«Л» (ПФ) 8,1 8,0 ,6 6, ,7 6, > 25 < 25 4,7 3,9 22 26
«Ш» (ИА) 7,2 6,2 ,6 4, ,0 6, 28 27 2,8 2,8 28,6 34,4
трипаносомой Т.еги2І, были обнаружены анти- мент [AESEE] (последовательность аминокис-тела к внутриклеточным бактериальным бел- лот в белке, заглавные буквы — первые буквы кам, в частности к С-концевым доменам рибо- аминокислоты), расположенный на С-конце-сомальных Р белков [18]. Одним из основных вом домене рибосомального белка Р0 (34 кДа). антигенных эпитопов при этом является фраг- Было показано, что антитела к рибосомальным
Примечание: до ИА, КСО 167 мл, ФВ 28,6% (А); через 14 месяцев, КСО 138 мл, ФВ 35,2% (Б). Рис. 5 А. Б. КСО и ФВ ЛЖ до и через 14 месяцев после 1 курса ИА.
Примечание: до ИА - ИС=0,9 ^ - 0,55) (А); через 14 месяцев - ИС=0,84 (Б). Рис. 6 А. Б. ИС ЛЖ до и через 14 месяцев после 1 курса ИА.
Таблица 3
Расстояние, пройденное за 6 минут в максимально быстром темпе до и через 2 недели после проведения процедур
Пациенты ПФ/ИА До курса процедур После курса процедур
«С» (ПФ) 480 540
«М» (ПФ) 515 580
«Л» (ПФ) 480 560
«Ш» (ИА) 725 769
Таблица 4
Динамика ЖHP сердца после иммуноадсорбции
Тип НРС До Ig-афереза 2 недели после Ig-афереза 4 месяца после Ig-афереза 1,5 года после Ig-афереза
Рі-АГ (+)* Pi-^T (-)* Pi^T (+) Pi-^T (-)
ЖЭ Общее число 4432 3391 6455 7300
ЖЭ - Пары 254 102 209 74
ЖТ/ЖЭ В ЖТ 16/50 3/9 17/56 4/14
Примечание: Pj-АТ (+) — наличие аутоантител; Pj-АТ (-) — отсутствие аутоантител.
Р белкам трипаносомы перекрестно реагируют со второй внеклеточной петлей Р^-АР человека и в опытах in vitro оказывают стимулирующее влияние на крысиные неонатальные кардиоми-оциты. Полагают, что появление перекрестных реакций антител связано с гомологией аминокислотных последовательностей антигенных эпитопов этих белков. Фрагмент [AESEE] белка Р0 трипаносомы обладает высокой гомологией с фрагментом (201-205) Pj-АР человека (рисунок 1). Таким образом, можно предположить, что являясь первоначально антителами к бактериальным белкам, аутоантитела к в -АР человека играют существенную роль в патогенезе СН.
Пациенту: «Ш» 30 лет, вес 85 кг, рост 181 см, индекс массы тела (ИМТ) 25,7 кг/м2, дважды проводили курсы ИА (с разницей в полгода) из 4 и 3 процедур.
Пациентам: «С» 37 лет, вес 94 кг, рост 183 см, ИМТ 28,5 кг/м2; «М» 30 лет, вес 77 кг, рост 174 см, ИМТ 25,6 кг/м2; «Л» 30 лет, вес 91 кг, рост 193 см, ИМТ 24,5 кг/м2 проводили курсы ПФ.
В таблице 1 представлена динамика уровней белков плазмы крови после 3 (пациенты «С» и «М»), 4 (пациент «Л») процедур ПФ и 3 процедур ИА (пациент «Ш»).
Проведение курса ПФ с замещением 40 г альбумина за каждую процедуру вызывало умеренное снижение его содержания. Осложнений во время курса процедур, связанных с колебаниями уровня альбумина, не отмечено, при этом, концентрация альбумина через 3 дня после окончания курсов процедур существенно не отличалась от исходного.
С помощью ИА удается эффективнее снизить уровень IgG. Однако неселективное удаление IgG методом ПФ было достаточным
для существенного снижения концентрации анти-^-АР Удаление анти-^-АР при ПФ оказалось сравнимо с таковым при применении ИА.
Изменение показателей, характеризующих состояние насосной функции сердца через 2 недели после окончания курсов процедур, представлены в таблице 2: размеры левого желудочка (ЛЖ) сердца, конечный диастолический и систолический размеры (КДР и КСР) ЛЖ, а также размеры правого желудочка (ПЖ), величина систолического давления в легочной артерии (СДЛА), ФВ ЛЖ.
Незначительное уменьшение размеров ЛЖ сердца, увеличение ФВ наблюдали в случаях применения как ПФ, так и ИА. У 2 больных при ПФ наблюдали снижение СДЛА, уменьшение размера ПЖ, что также может быть результатом улучшения насосной функции сердца. Ухудшения показателей гемодинамики не наблюдалось ни в одном случае.
Изменение ТФН оценено при проведении пробы с 6-минутной ходьбой. Незначительная положительная динамика присутствовала во всех случаях (таблица 3).
Пациенту «Ш» процедуры ИА выполняли на 1,5-2 года раньше, чем остальным пациентам, в связи с чем возможно представить результаты ЭхоКГ через 14 месяцев после проведения первого курса процедур ИА (рисунки 5 А и Б). Конечный систолический объем (КСО) ЛЖ уменьшился, а ФВ ЛЖ увеличилась через 14 месяцев после 1-го курса ИА. Уменьшение КСО сопровождалось снижением конечного диастолического объема (КДО) с 234 мл перед курсом ИА, до 203 мл после ИА, соответственно), увеличением ФВ ЛЖ с 28,6% до 35,2%.
Увеличение ударного объема, однако, не отмечено — 67 мл до и 65 мл через 14 месяцев. Улучшение сократимости миокарда ЛЖ, вероятно, также связано с его ремоделированием, на что указывает изменение индекса сферичности (ИС) ЛЖ —отношение размеров ЛЖ по длинной и короткой осям. При ДКМП это отношение приближается к единице (рисунок 6).
Положительная динамика размеров полости ЛЖ и показателей сократимости через 2 недели после ИА сохранялась после 14 месяцев наблюдения (рисунки 6 А, Б). Результаты наблюдения пациента после процедур ИА и иммунотерапии согласуются с результатами, опубликованными немецкими исследователями (кратковременный эффект и отдаленные результаты) [11,12].
У пациента «Ш» также удалось проследить связь между повышением уровня анти Pi-АР IgG и частотой желудочковых нарушений ритма (ЖНР) сердца: желудочковых экстрасистол (ЖЭ), эпизодов желудочковой тахикардии (ЖТ). Данные представлены в таблице 4.
Что касается динамики ЖНР через 2 недели после проведения процедур ПФ, то существенных положительных или отрицательных изменений не наблюдалось.
Литература
1. Grogan M, Redfoeld MM, Bailey KR, et al. Long-term outcome of patients with biopsy-proved myocarditis: comparison with idiopathic dilated cardiomyopathy. JACC 1995; 26(1): 80-4.
2. Erdmann E. Tne management of the heart failure — an overview. Basic Res Cardiol 2000; 95: 13-7.
3. Freedman NJ, Lefkowitz RJ. Anti-P1-adrenergic receptor antibodies and heart failure: causation, not just correlation. J Clin Invest 2004; 113: 1379-82.
4. Шумаков В.И., Рулева Н.Ю., Коробов Н.В. и др. Разработка аналитического метода на основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител к Р^-адренорецепторам в сыворотке крови больных с дилатационной кардиомиопатией. Вест трансплант искусст орг 1999; 34-41.
5. Caforio AL, Goldman JH, Baig MK, et al. Cardiac autoantibodies in dilated cardiomyophathy become unedetectable with disease progression. Heart 1997; 77: 62-7.
6. Tomaszewski M, Brain NJ, Charchar FJ, et al. Essential Hypertension and P2-Adrenergic Receptor Gene. Hypertension 2002; 40: 286-91.
7. Lohse MJ, Engelhardt S, Eschenhagen, T. What ist he role of P-adrenergic signaling in heart failure? Circ Res 2003; 93: 896-906.
8. Lader AS, Xiao YF, Ishikawa Y, et al. Cardiac Gsa overexpression enhances L-type calcium channels through an adenylyl cyclase independent pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 9669-74.
9. Matsui S, Fu ML, Hoebeke JJ. Peptides derived from cardiovascular G-protein-coupled receptors induce morphological cardiomyopatic changes in immunized rabbits. Mol Cell Cardiol 1977; 29: 641-55.
Выводы
Выполнен эпитопный анализ аутоантител анти — Pi-АР в сыворотках больных ДКМП. Основным эпитопом для аутоантител является аминокислотная последовательность DEAR-RCY. Разработана иммуноферментная тест-система для детекции аутоантител с использованием в качестве антигена пептида, содержащего 26 аминокислот второй внеклеточной петли Р1-АР.
Удаление аутоантител анти — Р1-АР у больных ДКМП методами ИА и ПФ улучшает насосную функцию сердца. Это улучшение функции сердца через 2 недели после курсов ПФ сравнимо с таковым при проведении ИА. Следует отметить удовлетворительную переносимость больными процедур ПФ и ИА; побочные реакции, осложнения отсутствовали.
В дальнейшем важно выяснить объясним ли факт улучшения сократительной функции миокарда только удалением анти-р1-АР, или же необходимо удаление и других аутоантител. Для этого необходимо создать более совершенные методы детекции анти-р1-АР, других аутоантител к миокарду, установить их роль в нарушении сократительной функции миокарда.
10. Jahns R, Вoivin V, Hein L, et al. Direct evidence for a Pj-adrener-gic receptor—directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. J Clin Invest 2004; 113: 1419-29.
11. Knebel F, Bohm M, Staudt A, et al. Reduction of morbidity by immunoadsorbtion therapy in patients with dilated cardiomyopathy. Int J Cardiol 2004; 97(3): 517-20.
12. Felix SB, Staudt A, Dorffel WD, et al. Hemodynamic Effects of Immunoadsorbtion and Subsequent Immunoglobulin Substitution in Dilated Cardiomyopathy. Three-Month from a Randomized Study. JACC 2000; 35(6): 1590-8.
13. Wisdom G.V. Peptide Antigens. Oxford University Press Inc. Oxford New York Tokyo 1994; 252.
14. Fraser CM. Site-directed mutagenesis of P-adrenergic receptors. J Biol Chem 1989; 264: 9266-70.
15. Strader CD, Candelore MR, Hill WS, et al. Identification of two serine residues involved in agonist activation of the P-adrenergic receptor. J Biol Chem 1989; 264: 13572-80.
16. Tota MR, Candelore MR, Dixon RAF, Strader CD. Biophysical and genetic analysis of the ligand binding site of the beta-adreno-ceptor. Trends Pharmacol Sci 1991; 12: 4-6.
17. Naparstek Y, Plotz PH. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol 1993; 11: 79-104.
18. Kaplan D, Ferrari I, Bergami PL, et al. Antibodies to ribosomal P proteins of Tripanosoma cruzi in Chagas disease possess functional autoreactivity with heart tissue and differ from anti-P autoantibodies in lupus. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 10301-6.
Поступила 14/04-2006 Принята к печати 29/05-2006
