ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД НА ОСНОВЕ ХИМЕРНОЙ МОЛЕКУЛЫ И ОЛИГОПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К β 1-АДРЕНОРЕЦЕПТОРУ У БОЛЬНЫХ ДИЛАТАЦИОННОЙ КАРДИОМИОПАТИЕЙ

Афанасьева Ольга Ильинична; Клесарева Е.А.; Ефремов Е.Е.; Сидорова М.В.; Беспалова Ж.Д.; Левашов П.А.; Ежов М.В.; Адамова И.Ю.; Поповский С.Н.

иммунология

О. И. Афанасьева, Е. А. Клесаpева, Е. Е. Ефpемов, м. В. Сидоpова, Ж. Д. Беспалова, П. А. Левашов, м. В. Ежов, И. Ю. Адамова, С. Н. Поповский

иммуноферментный метод на основе химерной молекулы и олигопептидных фрагментов для определения аутоантител к в^адренорецептору у больных дилатационной кардиомиопатией

Институт экспеpиментальной каpдиологии ФГБУ Pоссийский каpдиологический научно-пpоизводственный комплекс Mинздpавсоцpазвития Pоссии, москва

В работе описан метод ИФА для определения аутоантител к в-адренорецепторам (в¡-АР) с использованием смеси олигопепти-дов, представляющих собой фрагменты внеклеточных участков в -АР и химерной молекулы экстраклеточной части рецептора, который существенно превосходит описанные в литературе аналоги по чувствительности и корреляции с диагнозом.

Ключевые слова: дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), аутоантитела, иммуноферментный метод

O.I. Afanasyeva, Ye.A. Klesaryeva, Ye.Ye. Yefremov, M.V. Sidorova, J.D. Вг.ура1о\а, P.A. Levashov, M.V. Yejov, I.Yu. Adamova, S.N. Pokrovsky

THE IMMUNE-ENZYME ANALYSIS BASED ON CHIMERIC MOLECULE AND OLIGOPEPTIDE FRAGMENTATIONS TO DETECT AUTOANTIBODIES TO B-ADRENERGIC RECEPTOR IN PATIENTS WITH DILATION CARDIOMYOPATHY

The article deals with specification oftechnique of immune-enzyme analysis to detect autoantibodies to в-adrenergic receptors 01-AP) using coтретnd of oligopeptids representing the fragmentations of extracellular sites ei-AP and chimeric molecule of extracellular .section of receptor This technique significantly exceeds the analogues defined in publications by its sensitivity and correlation with diagnosis.

Key words: dilation cardiomyopathy, autoantibody, immune-enzyme analysis

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - заболевание сердечной мышцы (миокарда) неизвестной этиологии, приводящее к увеличению размеров, изменению толщины стенок, дилатации полостей, снижению фракции выброса, а также нарушению проводимости и ритма сердца. Прогноз заболевания плохой - смертность от ДКМП составляет 1 на 10 000 человек среди мужчин молодого и среднего возраста (от 35 до 55 лет) [3], 5-летняя выживаемость представителей европеоидной расы - 31,4% [4]. В крови больных ДКМП выявляются различные аутоантитела (аутоАт), которые представляют собой антитела к собственным антигенам, таким как миозин, адениннуклеотидный транслокатор, сарколеммальный ламинин, Р1-адренорецептор (Р^АР), белок мускаринового М2-рецептора, рибосомальные и митохондриальные белки, а также ряд других белков, что свидетельствует о возможном участии аутоиммунных нарушений в патогенезе заболевания [6]. Молекула Р1-АР относится к семейству G-белков, имеет 7 трансмембранных доменов и несколько экстраклеточных петель. Частота повышенного титра аутоАт к Р1-АР среди больных ДКМП варьирует в разных исследованиях в широком диапазоне, однако литературные данные свидетельствуют о том, что эти аутоАт, как и аутоАт к мускариновому М2-рецептору, наиболее часто встречаются именно у больных ДКМП [5, 8]. В связи со сложностью постановки диагноза и тяжестью за-

Для корреспонденции:

Афанасьева Ольга Ильинична, вед. науч. сотр. лаб. проблем атеросклероза

Адрес: 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а Телефон: (495) 414-67-32 E-mail: afanasieva@cardio.ru

болевания ДКМП определение уровня аутоАт к Р^АР является крайне актуальным для возможной дифференциальной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, в частности ДКМП.

Целью нашей работы явилось создание иммунологического метода, позволяющего с высокой чувствительностью определять аутоАт к Pj-AP.

Материалы и методы. Синтез пептидов и химерных молекул, представляющих собой две внеклеточные петли Pj-AP, связанные между собой дисульфидной связью, проводили согласно описанному ранее методу [1]. Последовательности пептидов, использованных в работе, приведены в табл. 1. Для получения образцов сыворотки кровь брали из локтевой вены натощак в вакутейнеры Vacutest® ("Vacutest KIMA Arzergrande", Италия). В качестве отрицательного контроля в работе использовали плазму обследованного здорового донора с доказанным отсутствием аутоАт к P1-AP, определенных независимым способом (Эли-Анкор-Тес, медицинский исследовательский центр (МИЦ) «Иммункулус»). Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) олигопептиды разводили в 0,1 М NaHC03-Na0H при рН 9,6, вносили на плашку фирмы "Costar" по 100 мкл и инкубировали при 37оС в течение 2 ч, затем для блокирования неспецифической сорбции вносили в лунки по 100 мкл буферного раствора 0,01 М NaH2P04-NaOH при рН 7,2, содержащего 0,15 М NaCl, 0,1% твина-20, 3% обезжиренное сухое молоко и бактериостатик катон CG 2 мл/л (ФСБМ-Т) и инкубировали при 37оС в течение 1 ч. Тот же буфер использовали для разведения образцов и контролей, а также отмывки плашек в каждой из стадий инкубации. Разведенные в 20 или 50 раз образцы исследуемых сывороток и контролей инкубировали при 4оС в течение 20 ч. В качестве вторых антител использовали конъюгат

Таблица 1

Олигопептиды и химерные пептидные молекулы, использованные в работе

№ пептида Пептид, последовательности аминокислот Аминокислотная последовательность Конформационное соответствие рецептору

1 Нонапептид, последовательности 125-133 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu Участок 1-й внеклеточной петли

2 Тридекапептид, последовательности 206-218 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe Участок 2-й внеклеточной петли

3 Гексакозапептид последовательности 197-222 His-Trp-Tф-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg 2-я внеклеточная петля с фрагментами трансмембранных доменов

4 Декапептид, последовательности 349-358 Phe-His-Arg-Glu-Leu-Val-Pro-Asp-Arg-Leu 3-я внеклеточная петля с фрагментами трансмембранных доменов

5 Химерная молекула 1: нонапептид 125-133 и тридекапептид 206-218 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu и Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe Комплекс 1-й и 2-й внеклеточных петель, соединенных дисульфидной связью

6 Химерная молекула 2: нона-пептид 125-133 и гексакоза-пептид 197-222 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu и His-Тф-Тф-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg Комплекс 1-й и 2-й внеклеточных петель, соединенных дисульфидной связью

Таблица 2

Результаты ИФА для определения аутоантител к Р^адренорецептору в различных группах больных и здоровых доноров

Разве- ДКМП (n = 43) ИБС (n = 16) Здоровые (n = 41)

сывороток пол. ответ отр. ответ по группе в целом пол. ответ отр. ответ по группе в целом пол. ответ отр. ответ по группе в целом

Количество ответов (%)

1/20 31 (72%) 12 (28%) 5 (31%) 11 (69%) 11 (27%) 30 (73%)

1/50 25 (58%) 18 (42%) 4 (25%) 12 (75%) 8 (20%) 33 (80%)

ОП, среднее ± стандартное отклонение (медиана)

1/20 0,462 ± 0,367 (0,319) 0,139 ± 0,035 (0,149) 0,372 ± 0,344 (0,269) 0,271 ± 0,053 (0,289) 0,097 ± 0,039 (0,086) 0,152 ± 0,093* (0,133) 0,350 ± 0,204 (0,260) 0,108±0,038 (0,097) 0,132+0,153** (0,118)

1/50 0,363 ± 0,254 (0,280) 0,115 ± 0,046 (0,101) 0,260 + 0,231 (0,174) 0,172 ± 0,020 (0,183) 0,070 ± 0,020 (0,067) 0,90 ± 0,046*** (0,068) 0,278 ± 0,261 (0,185) 0,083 ± 0,023 (0,077) 0,124+0,128*** (0,084)

% превышения над ОП крит., среднее±стандартное отклонение (медиана)

1/20 176±235 (73) -27 ± 16 (-27) 120± 219 (36) 47 ± 29 (57) -47 ± 21 (-53) -18±51** (-28) 82 ± 88 (50) -47 ± 20 (-46) -9±73*** (-28)

1/50 209 ± 222 (141) -35 ± 18 (-39) 106 ± 208 (15) 19 ± 14 (27) -51 ± 14 (-53) -37 ± 32 (-53) 84 ± 111 (35) -44 ± 17 (-43) -19±71 (-40)

Примечание. * - p < 0,001; ** - p < 0,0005; *** - p < 0,0001 в сравнении с группой больных ДКМП.

моноклональных антител к Ig человека с биотином. Затем в лунки вносили раствор стрептавидина, конъюгированный с пероксидазой, время инкубации при температуре 18-20оС составляло 60 и 30 мин соответственно. В качестве хромогена использовали тетраметилбензидин, реакцию останавливали добавлением 100 мкл 20% раствора серной кислоты. Поглощение регистрировали на планшетном анализаторе ПИКОН при длине волны 450 нм. Согласно литературным данным, считали, что образец содержит аутоАт к ßj-ÄP, если сигнал в исследуемом образце более чем в 2 раза превышает сигнал отрицательного контроля. При проведении статистического анализа использовали программу Med. Cale 9.3.1.0.

Результаты и обсуждение. Для разработки метода ИФА было исследовано взаимодействие сывороток с пептидами и химерными пептидными молекулами, моделирующими различные участки ß1-ÄP (см. табл. 1). В крови больных ДКМП могут содержаться аутоАт различной специфичности. Однако в исследованных нами сыворотках не были найдены аутоАт к 3-й внеклеточной петле (пептид № 4), поэтому данный пептид был исключен из дальнейших экспериментов. На основании результатов исследования, проведенного на выборке из 23 образцов сыворотки (14 больных ДКМП и 9 здоровых доноров) в качестве первого слоя была выбрана смесь олиго-

0,45 -i

0,4 -

ДКМП доноры ИБС без ДКМП

Медиана Среднее значение

Рис. 1. Показатели аналитического сигнала (медиана и среднее ± стандартная ошибка среднего) в различных группах обследованных больных. Линией указано пороговое значение поглощения при длине волны 450 нм (ОП крит), рассчитанное по двукратному превышению уровня сигнала здорового донора (отрицательный контроль). * -р < 0.05 относительно группы больных ДКМП.

Pna 2. Анализ ROC-кривых. а - разведение образцов 1:20; б - разведение образцов 1:50.

пептидов, представляющих собой нонапептид (125-133) 1-й петли, тридекапептид (206-218) 2-й петли последовательности Р1-АР и химерную молекулу, включающую нонапептид и тридекапептид, соединенные между собой дисульфидной связью. Данная комбинация позволяла с наибольшей специфичностью определять титр аутоАт у больных ДКМП. Сравнение двух различных способов иммобилизации олигопептидов и химерной молекулы на планшетах в равно-весовом (по 0,5 мкг пептид/лунка) и эквимолярном (4,5 нмоль/лунка) соотношениях продемонстрировало отсутствие достоверных различий. Коэффициенты корреляции оптических сигналов при проведении ИФА на плашках с каждым из индивидуальных олигопепти-дов и смесью варьировали от 0,92 до 0,99 (р < 0,0001). Также не были обнаружены достоверные различия при исследовании образцов плазмы, содержащей в качестве антикоагулянта цитрат натрия или гепарин, и сыворотки крови. Чувствительность и специфичность разработанного метода исследовали на выборке из 100 сывороток, из них 41 сыворотка здоровых доноров и 59 - пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. У 43 пациентов был поставлен диагноз ДКМП, у 16 - ише-мической болезни сердца (ИБС), верифицированная данными коронароангиографии, без инфаркта миокарда в анамнезе, что позволяло исключить постинфарктный кардиосклероз. Повышенный титр аутоАт к Р1-АР был определен у 72% больных ДМКМ, что в 7 раз больше, чем у здоровых доноров (ОШ 7,1 (95% ДИ 2,8-18,4), р < 0,05), тогда как у больных ИБС достоверные отличия от группы здоровых доноров не наблюдали (ОШ 1,2, 95% ДИ 0,4-4,4, р > 0,05) (табл. 2). Медиана и средняя величина аналитического сигнала в каждой из групп приведены на рис. 1.

Статистический анализ показал достоверное отличие величины сигналов в группе больных ДКМП от величины сигналов в группах здоровых доноров и больных ИБС. Отмечено также достоверное отличие уровня отрицательных сигналов, которые были выше в группе больных ДКМП, чем в двух других группах (см. табл. 2). Средний уровень аналитического сигнала положительных ответов достоверно не различался между тремя группами. В выборке здоровых доноров также были отдельные пациенты, содержащие аутоАт к Р1-АР, при этом количество таких ответов не превышало указанное в литературе ранее [7]. Анализ кривых операционных характеристик (ГОС-кривых) показал, что разработанный для определения аутоАт к Р1-АР метод ИФА имеет высокую чувствительность - 81,4% при разведении исходных сывороток в 20 раз, 72,1% при разведении в 50 раз, а также высокую специфичность - 70,2 и 78% соответственно. Поглощение для точки отсечения, согласно проведенному ЯОС-анализу, составило

свыше 0,163 о. е. для разведения 1:20 и свыше 0,118 о. е. для разведения 1:50. Полученные величины практически совпадали с принятыми нами в начале исследования пороговыми значениями, рассчитанными по двукратному превышению сигнала ОП отрицательного контроля: среднее значение 0,19 ± 0,03 для разведения 1:20 и среднее значение 0,16±0,04 для разведения 1:50. Качество модели, оцениваемое по критерию площади под ROC-кривой (AUC) составило 0,79 (95% ДИ 0,69-0,87) для каждого из двух разведений, что позволяет отнести данный анализ к модели хорошего качества (AUC 0,7-0,8) (рис. 2). Сравнение чувствительности ИФА с аналогичным параметром диагностической системы Эли-Анкор-Тест МИЦ «Иммункулус», проведенное на тех же образцах сыворотки 43 больных ДКМП показало, что разработанный метод ИФА позволяет с достоверно большей чувствительностью (74,4% положительных ответов) определять наличие аутоантител к Р1-АГ в плазме и сыворотке больных ДКМП по сравнению с Эли-Анкор-Тест (53,4% положительных ответов). В мировой практике разработка методика анализа кардиодепрессивных аутоАт, в частности аутоАт к Р1-АГ, ведется достаточно активно. На наш взгляд, метод ИФА благодаря своей простоте и способности к масштабированию имеет существенные преимущества перед методами с использованием клеточных моделей на культуре крысиных кардиомиоцитов для определения кардиодепрессивных антител, несмотря на высокую специфичность последнего [9]. Метод ИФА на основе синтетических олигопептидов является более простым, технологичным, воспроизводимым и перспективным для возможного последующего внедрения в клиническую диагностику. Описанные в литературе несколько методов ИФА с использованием олигопептида, соответствующего экстраклеточному участку 2-й петли Р1-адренорецептора [2, 5, 7], по своей чувствительности и специфичности уступают разработанному нами методу, что, очевидно, связано с наличием нескольких олигопептидов и химерной молекулы, наиболее полно воспроизводящей конформацию внеклеточного участка Р1-АГ, и позволяет выявлять аутоАт к более широкому спектру эпитопов Р1-АГ. Другой описанный способ ИФА дает возможность определять наличие аутоАт к Р1-АГ и мускариновому М2-рецептору с использованием олигопептидов, представляющих собой участок (169-192) 2-й внеклеточной петли мускаринового аце-тилхолинового рецептора-2 и участок (197-222) 2-й петли Р1-АГ. Частота получения положительных ответов в группе больных ДМКП и здоровых доноров, определенных таким методом ИФА, достоверно не отличалась и составила 5 (14%) из 36 больных и 4 (12%) из 36 здоровых доноров [4].

Заключение. Pазpаботанный нами метод ИФА с использованием смеси олигопептидов, представляющих собой фрагменты внеклеточных участков Р1-АГ и химерной молекулы экстраклеточной части рецептора, существенно превосходит описанные в литературе аналоги по чувстви-тельностьи и корреляции с диагнозом. Дальшейшее развитие данного направления может иметь большую практическую значимость для диагностики дилатационной кардиомиопатии и других сердечно-сосудистых заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. СидороваМ. В. и др. Синтез и свойства нового конформационного антигена, моделирующего внеклеточную часть Pj-адрено-рецептора. Биоорганическая химия. 2009; 2 (3): 1-12.

2. Табакьян Е. А. и др. Частота выявления аутоантител к Pj-адрено-рецепторам у больных с миокардитами и кардиомиопатиями. Кардиология. 2002; 6: 42-46.

3. Coughlin S. S. et al. Predictors of mortality from id^athic dilated

cardiomyopathy in 356,222 men screened for the Multiple Risk Factor Intervention Trial. Am. J. Epidemiol. 1994; 139: 166-172.

4. Coughlin S. S. et al. What explain black-white differences in survival in idiopathic dilated cardiomyopathy? Dilated Cardiomyopathy Study. J. Natl. Med. Assoc. 1997; 89: 277-282.

5. Fu L.-X. et al. Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic acetylcholine receptor-2 in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J. clin. Invest. 1993; 91: 1964-1968.

6. Lappe J. M. et al. Recent insights into the roie of autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. J. Card. Fail. 2008; 14: 521-530.

7. Magnusson Y. et al. Mapping of a functional autoimmune epitope

on the beta 1-adrenergic receptor in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J. Clin. Invest. 1990; 5: 1658-1663.

8. Magnusson Y. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 1994; 89 (6): 27602767.

9. Wallukat G., Wollenberger A. Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chronotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes. Biomed. Biochim. Acta. 1987; 8-9: 634-639.

Поступила 05.04.12

Л. м. масягутова, А. Б. Бакиров, И. Д. Рыбаков

специфическая сенсибилизация и местный иммунитет полости рта в условиях хронической аэрогенной нагрузки

Федеральное бюджетное учреждение науки Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека

Изучено содержание IgA, IgM, IgG, IgE, slgA, sICAM-1 в нестимулированной смешанной слюне работниц птицеводческой отрасли, которые подвергались аэрогенному воздействию комплекса производственных факторов. Проанализированы изменения показателей в зависимости от выраженности сенсибилизации. Показано, что наибольшие изменения уровня .sICAM-1 определяются преимущественно при грибковой сенсибилизации.

Ключевые слова: показатели местного иммунитета, уровень sICAM-1, специфическая сенсибилизация L.M. Masyagutova, A.B. Bakirov, I.D. Rybakov

THE SPECIFIC SENSITIZATION AND LOCAL IMMUNITY OF ORAL CAVITY IN CONDITIONS OF CHRONIC AEROGENIC LOAD

The article considers the results of analysis of concentration of IgA, IgM, IgG, IgE, sIgA, sICAM-1 in non-stimulated saliva of female workers ofpoultry sector who underwent aerogenic impact of complex of occupational factors. The changes in indicators are analyzed depending on intensity of sensitization. The study demonstrated that the greatest changes in concentration of sICAM-1are detected primarily in case of fungous infection.

Key words: indicator, local immunity, concentration of sICAM-1, specific sensitization

Слизистая оболочка верхних дыхательных путей представляет собой один из первых защитных барьеров организма человека при взаимодействии с разнообразными патогенными факторами окружающей среды. В ряде работ показано, что иммунитет слизистых оболочек не является простым отражением общего иммунитета, а обусловлен функцией самостоятельной системы, оказывающей важное воздействие на формирование общего иммунитета [2].

Как известно, развитие аллергического заболевания -это сложный каскад иммунных и неиммунных реакций, приводящий не только к развитию местных симптомов, но и к формированию системного аллергического воспалительного ответа [4]. Острая и хроническая фазы аллергического ответа и аллергические изменения в различных тканях опосредуются аллергическим каскадом

Для корреспонденции:

Масягутова Ляйля Марселевна, канд. мед. наук, зав. лаб. Адрес: 450106, Уфа, ул. Степана Кувыкина, 94 Телефон: (347)255-19-48 E-mail: kdl.ufa@rambler.ru

путем активации 1Ъ2-клеток, базофилов и эозинофилов под влиянием цитокинов и хемокинов. Эти реакции включают также повышение экспрессии молекул адгезии, в том числе молекул межклеточной адгезии 1-го типа (intracellular adhesion molecule 1 - ICAM-1). ICAM-1 относится к суперсемейству иммуноглобулинов, обнаруживается на эндотелиальных, эпителиальных клетках, активированных лейкоцитах, лимфоцитах, моноцитах, фибробластах. ICAM-1 участвует в контактных взаимодействиях клеток в иммунных реакциях: Т-лимфоцитов с моноцитами, цитотоксических Т-лимфоцитов с клетками-мишенями. Описано, что ICAM-1 передает внутриклеточные сигналы, приводящие к перестройке актинового цитоскелета эндотелиальных клеток и способствует миграции лейкоцитов [9]. Связывание ICAM-1 индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов и способствует поддержанию воспаления [7]. sICAM-1 (сокр. от англ. soluble - растворимый) представляет собой экстрацеллюлярную часть клеточно-связанной ICAM-1. Секреция sICAM-1 осуществляется моноцитами, эпителиальными клетками, гладкомышечными клетками сосудов, клетками ге-