CC BY
39
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 7 (16), 2015 | ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
163
2. При длительности предпосевной обработки в течении 15 минут, также наблюдается увеличение средней длины ростков и корней, так же незначительно увеличилось количество корней
3. Было выяснено что КВЧ обработка может оказывать не только стимулирующее воздействие, но и угнетающее, было выявлено что при времени обработки семян свыше 45 минут приводит к угнетению роста ростков и корней данных семян.
■прирост длины ростков
Рис 3 - Длины ростков пророщенных семян, обработанных ЭМП КВЧ диапазона
Список литературы
1. Данько, С.Ф. Интенсификация процесса солодора-щения ячменя действием звука различной частоты. канд. тех. наук: ВАК РФ. - М., 2001.
2. Атрощенко, Е.Э. Действие ударно-волновой обработки семян на морфофизиологические особенности и продуктивность растений. канд. био. наук: ВАК 03.00.12. - М., 1997.
3. Ксенз, Н.В. Анализ электрических и магнитных воздействий на семена / Н.В. Ксенз, С.В. Качеи-швили // Механизация и электрификация сельского хозяйства. - 2000. - №5. - С. 10-l2.
4. Нещадим, Н.Н. Теоретическое изучение влияния обработки семян и посевов ростовыми веществами, магнитным полем, лазерным облучением на урожай и качество продукции, практические рекомендации; опыты с пшеницей, ячменём, арахисом и розой: автореф. дис.... д-р. с/х наук: Кубанский агрономический ун-т. - Краснодар, 1997.
5. Яруллин А.А. Исследование воздействия физических электромагнитных полей сверхвысокой и крайневысокой частоты диапазонов на зерновые культуры. Исслед. Работа 2014г.
6. ГОСТ 12038-84 Семена сельскохозяйственных культур . Методы определения всхожести
ОКИСЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ
ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ
Тихонов Борис Борисович
Кандидат химических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Тверской государственный технический университет», г. Тверь
Стадольникова Полина Юрьевна Студент, ФГБОУ ВПО «Тверской государственный технический университет», г. Тверь
Сидоров Александр Иванович
Кандидат химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Тверской государственный технический университет»,
г. Тверь
АННОТАЦИЯ
Целью исследования было создание и исследование физико-химических свойств и кинетических параметров эффективных катализаторов окисления о-дианизидина на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной на различных твердых носителях. В результате работы были синтезированы многослойные гетерогенные катализаторы на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной на ионообменную смолу КУ 2-8 и Sepabeads EC-HA403, оптимизирован компонентный состав катализаторов, определены кинетические параметры синтезированных катализаторов, выявлено, что наиболее эффективным из синтезированных катализаторов является система «катионит КУ 2-8-хитозан-глу-таровый альдегид-пероксидаза». Кроме того, выявлено, что остаточная активность иммобилизованной пероксидазы ниже активности нативного фермента, однако катализаторы стабильны в последовательных экспериментах, а иммобилизация делает фермент более удобным для применения в технологических процессах.
ABSTRACT
Creation and research ofphysical and chemical properties and kinetic parameters of effective catalysts of o-dianisidine oxidation on the basis of the Horseradish peroxidase immobilized on various firm carriers was a research objective. As a result of work multilayered heterogeneous catalysts on the basis of the Horseradish peroxidase immobilized on the ion-exchangers KU 2-8 and Sepabeads EC-HA403 were synthesized, the component structure of catalysts is optimized, kinetic parameters of the
164
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 7 (16), 2015 | ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
synthesized catalysts are determined, is revealed that the most effective of the synthesized catalysts is the system " KU 2-8-hitosan-glutaric dialdehyde-peroxidase". Besides, it is revealed that residual activity of the immobilized peroxidase is lower than activity of native enzyme, however catalysts are stable in consecutive experiments, and the immobilization does enzyme more convenient for application in technological processes.
Ключевые слова: о-дианизидин, окисление, катализаторы, оксидоредуктазы, пероксидаза хрена Keywords: o-dianisidine, oxidation, catalysts, oxidoreductases, horseradish peroxidase
Введение
Ароматические амины относятся к химическим соединениям, получаемым из ароматических углеводородов (бензола, толуола, нафталина, антрацена, дифенила и т.д) заменой, по крайней мере, одного атома водорода аминогруппой -NH2. Этот класс веществ относится к токсичным соединениям, широко используемым в различных отраслях промышленности. С точки зрения профессиональной вредности одним из наиболее важных ароматических аминов является о-дианизидин (другие названия - прочный синий B, 3,3'-диместоксибензидин). Это соединение применяется в промышленности для получения большого числа диазокрасителей для шерсти, шелка, хлопчатобумажных тканей и других материалов [1, с. 87; 2, с. 156]. о-дианизидин относится к сильнейшим канцерогенам, вызывающим рак мочевого пузыря и почек, а также раздражающе действует на кожу и слизистые оболочки [3, с. 362]. Все эти факты делают проблему его утилизации (в том числе, удаления его из промышленных стоков) достаточно острой и актуальной. Задача удаления органических загрязнителей из промышленных стоков в настоящее время полностью не решена [4, с. 6]. Перспективным направлением исследований утилизации органических контаминантов водных ресурсов является использование гетерогенных катализаторов на основе иммобилизованных ферментов, прежде всего - оксидоредуктаз, способных переводить производные фенола и бензола в менее опасные полимерные продукты, выпадающие в осадок, что делает возможным их удаление из реакционной среды простым фильтрованием [5, с. 145; 6, с. 3013; 7, с. 960]. Оксидоредуктазы (К.Ф. 1; в том числе - пероксидаза, ти-розиназа, лакказа, каталаза и т.д.) - наиболее распространенные и стабильные ферменты с высокой субстратной специфичностью, доказавшие свою эффективность в реакциях окисления широкого спектра субстратов органической и неорганической природы [8, с.261].
Ферменты используются в промышленности как в свободном, так и в связанном (иммобилизованном) состоянии. Их использование в промышленных процессах
очень выгодно как с экономической, так и с экологической точек зрения, поскольку ферментативные реакции проходят в мягких условиях без образования побочных продуктов. При этом иммобилизация во многих случаях является единственным способом повышения эффективности биокаталитических процессов. Активность иммобилизованного фермента обычно несколько ниже его активности в растворе, однако этот недостаток компенсируется возможностью многократного использования фермента. В то же время, не существует метода иммобилизации, который был бы универсален для всех ферментов и очень часто иммобилизация вносит дополнительные проблемы и в сам процесс, и в оценку его кинетических параметров. Для создания эффективных биокатализаторов целесообразно проводить их так называемый «рациональный дизайн» с учетом различных факторов: планируемой области применения, желаемых свойств поверхности носителя, стабильности к различным воздействиям [9, с.105]. В нескольких работах исследователями была доказана возможность ковалентной иммобилизации оксидоредуктаз на носителях различной природы [10, с. 189; 11, с. 1460]. Коллективом авторов статьи также ранее уже были получены данные об эффективности катализаторов на основе иммобилизованных оксидоредуктаз в окислении фенола и его производных [12, с. 80].
Целью данного исследования было создание и исследование физико-химических свойств и кинетических параметров эффективных катализаторов окисления о-диа-низидина на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной на различных твердых носителях.
Строение и механизм каталитического действия пе-роксидазы хрена
Пероксидаза хрена (HRP, молекулярный вес ~ 40 кДа, К.Ф. 1.11.1.7) представляет собой гликопротеид, состоящий из полипептидной цепи, формирующей двухдоменную глобулу, и гемовой простетической группы с атомом железа, располагающейся между доменами [13, с.199]. Механизм каталитического действия пероксидазы хрена хорошо изучен:
HRP + H2O2 ^ HRP-I (1)
HRP-I + RH2 ^ HRP-II + RH- (2)
HRP-II + RH2 ^ HRP + RH- (3)
В реакции (1) происходит окисление нативного фермента (HRP) перекисью водорода двумя электронами с получением соединения I (HRP-I), активной формы фермента, в котором Fe3+ окисляется до феррила (FeIV = O), а порфирин - до порфиринового радикала. В реакции (2) HRP-I принимает субстрат (RH2) в свой активный центр и выполняет его окисление. При восстановлении HRP-I образуется соединение II (HRP-II), содержащее оксоферри-лимидазол. В реакции (3) HRP-II окисляет вторую молекулу субстрата и восстанавливается до HRP, содержащего Fe3+. Продуктами реакции окисления являются свободные радикалы RH-, которые могут самопроизвольно взаимодействовать между собой с образованием олигомеров или полимеров, выпадающих в осадок. При этом взаимодействие HRP-I с донором происходит гораздо медленнее,
чем образование HRP-I, и соответственно, является лимитирующей стадией процесса [13, с. 204].
Методы и методики
Реактивы
В работе использовали следующие компоненты (в скобках - условное обозначение): источником ферментативной активности был препарат пероксидазы хрена (Fluka, 900 ед/мг); в качестве носителей использовались ионообменная смола КУ 2-8 и коммерческий носитель иммобилизации ферментов Sepabeads EC-HA403 (Resindion, Италия); модификатором являлся хитозан кислоторастворимый средней вязкости (Fluka); активирующий агент -глутаровый диальдегид (DC Pamrea^; субстраты для окисления - о-дианизидин (Д1, прочный синий В) (рисунок 1а) и о-дианизидин соль (Д2, прочный синий В соль) (рис.1б).
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 7 (16), 2015 | ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
165
а
Рисунок 1. Субстраты для окисления: а
о-дианизидин; б - о-дианизидин дигидрохлорид
Оборудование и приборы
Изучение кинетики окисления о-дианизидина в присутствии нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена осуществлялось в термостатируемом реакторе периодического действия с возвратно-поступательным качанием. Оптическая плотность реакционной смеси измерялась на Спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр»).
Синтез иммобилизованных биокатализаторов
Были синтезированы многослойные гетерогенные катализаторы, активный компонент которых - перокси-даза хрена - был присоединен к поверхности носителя (КУ 2-8 или Sepabeads EC-HA403). Иммобилизация пероксидазы хрена на КУ 2-8 проводилась по известной методике [12, c. 77]. Иммобилизация пероксидазы хрена на Sepabeads EC-HA403 проводилась в соответствии с сопроводительной документацией к данному носителю.
Иммобилизация проводилась в соответствии с выбранными схемами синтеза с промежуточной отмывкой дистиллированной водой от неспецифически связанных компонентов.
Методика проведения кинетических экспериментов
Для проведения кинетических экспериментов в каталитическом реакторе смешивались раствор исходного фермента (или катализатор, приготовленный из того же количества экстракта), раствор о-дианизидина (или о-диа-низидина соли) необходимой концентрации, фосфатный
буферный раствор (рН = 7,0) и раствор перекиси водорода (10 %-ный избыток относительно о-дианизидина) в соотношении 1:1:1:1 (об.). Первичные кинетические данные представляли собой зависимость от времени оптической плотности раствора при X = 460 нм, увеличивающейся в процессе окисления вследствие образования окрашенных продуктов. Начальная скорость реакции и другие кинетические параметры определялась методом двойных обратных координат после пересчета оптической плотности в концентрацию субстрата [14, с. 92].
Результаты и обсуждение
Определение оптимальных условий проведения процесса окисления
По результатам варьирования условий реакций окисления о-дианизидина и о-дианизидина соли при С0 = 20 ммоль/л были выявлены оптимальные условия: температура - 25°С, интенсивность перемешивания - 300 мин-1, и рН - 7,0, которые и использовались при изучении кинетики.
Сравнение эффективности биокатализаторов различного состава
В результате иммобилизации были получены гетерогенные катализаторы «КУ 2-8 - хитозан - глутаровый диальдегид - пероксидаза» (К1) и «Sepabeads EC-HA403 -хитозан - глутаровый диальдегид - пероксидаза» (К2), схемы которых представлены на рисунке 2.
а
б
Рисунок 2. Схема разработанных гетерогенных катализаторов: а) «КУ 2-8 - хитозан - глутаровый диальдегид - пе-роксидаза» б) «Sepabeads EC-HA403 - хитозан - глутаровый диальдегид - пероксидаза»; обозначения:
Н - носитель, М - хитозан, А - глутаровый диальдегид, Е - пероксидаза хрена
Для оптимизации состава биокатализаторы на основе ионообменных смол были испытаны в реакции окисления о-дианизидина при постоянных исходных концентрациях о-дианизидина и Н2О2, рН, температуре и концентрации катализатора. Эксперименты показали, что наибольшую активность в реакции окисления фенолов показали биокатализаторы, приготовленные с использованием 0,1%-ного раствора хитозана, 25%-ного раствора глутарового диальдегида.
Для наиболее эффективных катализаторов по результатам кинетических экспериментов при варьировании начальной концентрации субстратов при оптимальных условиях реакции были получены кинетические параметры, приведенные в таблице 1. Активность катализаторов исследовалась в реакции окисления о-дианизидина и о-дианизидина соли (С0 = 20 ммоль/л).
Таким образом, более эффективными в окислении о-дианизидина являются катализаторы на основе ионообменной смолы КУ 2-8. Активность иммобилизованных катализаторов несколько ниже активности нативного фермента, что связано с гетерогенизацией фермент и затруднением доступа молекул субстрата к активным центрам фермента. Однако синтезированные катализаторы достаточно стабильны (снижают свою активность на 1015% в последовательных экспериментах), а гетерогениза-ция делает фермент более удобной для применения в технологических процессах. Синтезированные биокатализаторы эффективно работают в диапазоне концентраций ароматических аминов, в котором они чаще всего встречаются в водных объектах - 1-30 ммоль/л.
166
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 7 (16), 2015 | ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Таблица 1
Сравнение кинетических параметров катализаторов различного состава
Параметр Субстрат Нативный фермент Иммобилизованный катализатор
К1 К2
Vm, ммоль/лс Д1 1.15 0.43 0.22
Д2 1.23 0.34 0.15
Кт, ммоль/л Д1 1,52 15,36 19.79
Д2 1,78 17,18 26,54
КсаЬ с-1 Д1 7.30 2,73 1.75
Д2 8.80 2,51 1.96
Активность биокатализатора, ед. ак. (при Со=20 ммоль/л) Д1 4,51 1,88 1,31
Д2 4,89 1,74 1,12
Выводы
Таким образом, получены следующие результаты:
• синтезированы многослойные гетерогенные катализаторы на основе пероксидазы хрена, иммобилизованных на ионообменную смолу КУ 2-8 и Sepabeads EC-HA403, оптимизирован компонентный состав катализаторов;
• определены кинетические параметры синтезированных катализаторов, выявлено, что наиболее эффективным из синтезированных биокатализаторов является система «катионит КУ 2-8-хитозан-глута-ровый альдегид-пероксидаза»;
• остаточная активность иммобилизованной перок-сидазы ниже активности нативного фермента, однако катализаторы стабильны в последовательных экспериментах, а иммобилизация делает фермент более удобным для применения в технологических процессах.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.
Список литературы
1. Гурвич Я.А., Кумок М. Химия и технология промежуточных продуктов и органических красителей. М.: Высшая школа, 1968. 360 с.
2. Венкатарман К. Химия синтетических красителей: В 2-х т.: т.1. Пер. с англ. Л.: ГНТИ Хим. лит., 1956. 804 с.
3. Быховская М.С., Гинзбург С.Л., Хализова О.Д. Методы определения вредных веществ в воздухе (Практическое руководство). М.: Медицина, 1966. 595 с.
4. Wilberg K.Q., Nunes D.G., Rubio J. Removal of phenol by enzymatic oxidation and flotation // Braz. J. of Chem. Eng. 2000. Vol. 17. P. 4-7.
5. Karam J. Nicell J.A. Potential applications of enzymes in waste treatment // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1997. Vol. 69. P. 141-153.
6. Caza N., Bewtra J.K., Biswas N., Taylor K.E. Removal of phenolic compounds from synthetic wastewater using soybean peroxidase // Wat. Res. 1999. Vol. 33. P. 3012-3018.
7. Cooper V.A., Nicell J.A. Removal of phenols from a foundry wastewater using horseradish peroxidase // Wat. Res. 1996. Vol. 30 (4). P. 954-964.
8. Schmid A., Hauer B., Kiender A., Wubbolts M., Witholt B. Industrial biocatalysis today and tomorrow // Nature. 2001. Vol. 409. P. 258-268.
9. Tischer W., Wedekind F. Immobilized enzymes: methods and applications // Top. Curr. Chem. 1999. Vol. 200. P. 95-126.
10. Ensuncho L., Alvarez-Cuenca M., Legge R.L. Removal of aqueous phenol using immobilized enzymes in a bench scale and pilot scale three-phase fluidized bed reactor // Bioprocess. Biosyst. Eng. 2005. Vol. 27. P. 185-191.
11. Bindhu L.V., Abraham Bindhu T. E. Immobilization of horseradish peroxidase on chitosan for use in nonaqueous media // J. Appl. Polym. Sci. 2003. Vol. 88. P. 1456-1464.
12. Сидоров А.И., Лакина Н.В., Сульман Э.М., Ожим-кова Е.В., Манаенков О.В., Тихонов Б.Б. Очистка сточных вод от фенолов с использованием иммобилизованных оксидоредуктаз растений и грибов // Вестник Тверского государственного университета. Серия «Биология и экология». Тверь: ТвГУ, Вып. 21(№2). 2011. С. 74-81.
13. Dunford H.B., Stillman J.S. On the function and mechanism of action of peroxidase // Coord. Chem. Rev. 1976. V.19. N 3. P.187-251.
14. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология [Текст]. М.: Academa, 2005. 472 с.
КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ НИКЕЛЯ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВЕЙШЕЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
Садомцева Ольга Сергеевна, к.х.н., доцент кафедры аналитической и физической химии, Шакирова Виктория Викторовна, к.х.н., доцент кафедры аналитической и физической химии,
Уранова Валерия Валерьевна, специалист по УМР II-й категории, Фадеева Мария Валерьевна, магистрант 1 года обучения, Кожина Александра Дмитриевна, Бакалавр 3 года обучения ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», г.Астрахань, РФ,
