CC BY
309
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616.98:578.828.6]=092:612.017.1.064]=078:577.21.08
Прасолова М.А.1'2'3, Иванов М.К.1'2 3, Гашникова Н.М.4, Нетёсова Е.С.2, Дымшиц Г.М.5
ОДНОПРОБИРОЧНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЭА РНК ГЕНЕТИЧЕСКИХ РАЭНОВИДНОСТЕЙ ВИЧ, ВКЛЮЧАЯ РЕДКИЕ НЕ-М ГРУППЫ ВИЧ-1 И ВИЧ-2, НА ОСНОВЕ ОТ-ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск; 2ЗАО «Вектор-Бест», 630559, п. Кольцово, Новосибирская область; 'Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск; 4ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», 630559, п. Кольцово, Новосибирская область; 5Институт химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск.
На основе метода ОТ-ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени разработан прототип диагностического набора, позволяющий надежно выявлять в сыворотке и плазме крови различные генетические варианты РНК ВИЧ-1 групп М,К,0,Р и РНК ВИЧ-2. Набор обладает высокой устойчивостью к нуклеотидным несоответствиям, широким линейным диапазоном измерения концентраций РНК ВИЧ, 100% аналитической специфичностью и хорошей аналитической чувствительностью: 42 МЕ/мл (ВИЧ-1 группы М), 45 копий/мл (ВИЧ-2), 92 копий/ мл (ВИЧ-1 группы 0), 90 копий/мл (ВИЧ-1 группы К). С помощью разработанного диагностического набора удалось успешно выявить и определить концентрацию РНК ВИЧ для всех образцов из международной референсной панели генотипов ВИЧ-1; результаты проведенных тестов коррелируют с данными, полученными с помощью коммерческих тестов. Ключевые слова: ВИЧ-1 группа O; ВИЧ-2; устойчивость к нуклеотидным несоответствиям; ОТ-ПЦР.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) продолжает оставаться одной из глобальных проблем здравоохранения: в мире количество людей, инфицированных ВИЧ-1, составляет 34 млн, в России - более 730 тыс. и продолжает расти [1]. Эффективность предотвращения дальнейшего распространения ВИЧ, как и лечения уже заразившихся, значительно зависит от точной, высокочувствительной и своевременной диагностики инфекции, в том числе выявления РНК ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2]. Тестирование препаратов донорской крови на РНК ВИЧ является обязательным во многих странах, в том числе и в России.
Особую проблему для диагностики ВИЧ-инфекции создает высокая генетическая изменчивость вируса. Выделены 4 генетические группы ВИЧ-1 (М, К, О и недавно описанная группа Р) [3]. Основной вклад в мировую эпидемию СПИДа вносят штаммы ВИЧ-1 группы М, которая в свою очередь делится на 9 субтипов и множество рекомбинантных форм [4]. Группы вирусов К, О и Р считаются редкими за пределами Африки, и в России пока официально не зарегистрировано ни одного случая заражения штаммами этих групп. Тем не менее уже описано много случаев инфицирования ВИЧ-1 группы О в разных странах Европы и США [5, 6]. Очевидно, что распространение редких групп N и Р также возможно. Ни один из отечественных и далеко не все импортные коммерческие тесты способны выявлять штаммы ВИЧ-1 не-М групп (причем эта проблема касается не только ПЦР, но и серологических методов [7]), что создает риск распространения таких недоступных для диагностики, но от этого не менее патогенных геновариантов вируса.
ВИЧ-2 также состоит из нескольких генетически удаленных друг от друга субтипов и их рекомбинан-
тов [8, 9]. Наиболее распространенными являются субтипы А и В. ВИЧ-2 встречается во всех частях света, хотя общее число инфицированных ВИЧ-2 гораздо ниже, чем ВИЧ-1. В силу генетической удаленности от ВИЧ-1 многие антиретровирусные препараты, в частности ненуклеозидные ингибиторы ревертазы, не эффективны при лечении пациентов с ВИЧ-2 [10]. Большинство современных серологических тестов выявляют антитела к вирусам обоих типов, однако к ПЦР-тестам такие требования до недавнего времени не предъявлялись, большинство коммерчески доступных диагностических наборов оптимизировано только для выявления РНК ВИЧ-1. Показано, что, как и в случае ВИЧ-1, вирусная нагрузка ВИЧ-2 в плазме крови коррелирует со стадией развития заболевания и ее измерение может использоваться в прогностических целях для мониторинга состояния пациента и назначения терапии [11]. Следовательно, определение РНК ВИЧ-2 актуально не только в качественном, но и в количественном варианте. Таким образом, существует объективная потребность в создании удобных для применения в клинических лабораториях доступных по цене высокочувствительных тестов для выявления и достоверной количественной оценки РНК ВИЧ-1 и ВИЧ-2, охватывающих все генетические группы и субтипы вируса.
Целью данной работы являлась разработка на основе метода ПЦР в реальном времени высокочувствительного теста для выявления РНК всех генетических групп ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в одной пробирке.
Материалы и методы
Биологический материал. Клинические образцы сыворотки или плазмы крови, содержащие РНК ВИЧ-1 группы М, а также образцы сыворотки крови здоровых доноров были предоставлены Новосибирским областным центром по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, лабораторией клинической иммунологии НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского г. Москвы.
Для определения предела чувствительности и границ динамического диапазона измерений концентраций использовали положительный контрольный образец (ПКО) РНК ВИЧ-1 субтипа А, охарактеризованный относительно международного стандарта РНК ВИЧ-1, полученной из Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC). Приготовление ПКО РНК ВИЧ-1 описано ранее [12].
Получение клинических образцов от пациентов, инфицированных ВИЧ-2 и ВИЧ-1 групп К,0,Р, было затруднительно из-за крайне малой распространенности этих вирусов в России. Основные этапы оптимизации теста проводили на искусственно синтезированных ДНК и РНК, соответствующих по нуклеотид-ным последовательностям имеющимся в базе данных фрагментам генома изолятов ВИЧ-1 групп О (8 геновариантов), групп N (2 геноварианта), группы Р, редких субтипов группы М (26 геновариантов) и ВИЧ-2 (субтипы А и В). Сборку двухцепочечных
матриц ДНК проводили путем полимеразного удлинения частично перекрывающихся олигонуклеотидов. В ДНК-матрицы, соответствующие референсным последовательностям субтипов и групп ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вводили дополнительно последовательность Т7-промотора для проведения транскрипции in vitro. Правильность сборки ДНК-матриц подтверждали секвенированием. Для очистки синтезированных ДНК-матриц применяли электрофорез в агарозном геле (агароза SeaKem® GTG™, «Lonza», Швейцария) с последующей пассивной элюцией. Концентрацию ДНК-матриц измеряли спектрофотометрически с использованием прибора Nanodrop2000. Разведения искусственных матриц ВИЧ-2 и ВИЧ-1 групп N и O, соответствующие концентрациям ДНК около 104 копий/мкл, аликвотировали, хранили при -40°С и использовали в качестве количественных стандартов для определения вирусной нагрузки и для исследования аналитических характеристик разработанного теста. Образцы искусственных РНК были получены путем транскрипции in vitro с помощью набора T7 transcription kit («Fermentas», Литва) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты реакции обрабатывали ДНКазой RQ1 («Promega», США). Полученную РНК осаждали этиловым спиртом, элюировали в воде, аликвотировали и хранили при -40°С.
Также в работе использовали лизат штамма ROD ВИЧ-2, полученный после культивирования вируса на чувствительных клетках. Путем секвенирования участка LTR размером 391 ну-клеотид и последующего филогенетического анализа подтвердили принадлежность данного образца к субтипу А. На основе лизата ВИЧ-2 был изготовлен ПКО РНК ВИЧ-2. Данный образец был разведен в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров ВИЧ, вирусных гепатитов В и С, разделен на аликвоты и лиофильно высушен. Концентрацию РНК ВИЧ-2 ПКО определяли посредством ПЦР-анализа с помощью разработанного теста, для построения калибровочной кривой использовали описанный выше количественный стандарт ВИЧ-2.
Проведение анализа. Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов РеалБест Экстракция 1000 или Реал-Бест Экстракция 100 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для амплификации использовали готовую лиофильно высушенную реакционную смесь РеалБест МастерМикс ОТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), содержащую все компоненты для проведения ОТ и ПЦР в одной пробирке, кроме специфичных олигонуклеотидов. В смесь добавляли праймеры, соответствующие ВИЧ-1 и ВИЧ-2, в концентрации по 12,5-25 пмоль и флюоресцентно меченые зонды по 6-12,5 пмоль. В анализе использовали приборы iQ5
Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации участка ЬТК ВИЧ-1 групп Ш,0,Р и результаты их проверки на предмет устойчивости к мисматчам
Название Нуклеотидная последовательность
матрицы праймера и замены в матрицах
Среднее отставание по Ct от контроля
Праймер F CTCTGGTATCTAGAGATCCCTCAGA
fN C -0,l6 -0,05
fOl C 0,09 0,0З
fO2 C G 0,0l 0,00
ЮЗ C A 0,00 0,00
fO4 C G 0,2З 0,07
fO5 -C-- ---G------A---------- l,67 0,50
fP ---- ----G----------------- -0,07 -0,02
Праймер R-OP CCTCTCGCCTCTTAGCAG
rOl G -0,0l 0,00
rO2 ---- ---------C---G- 0,44 0,1З
ЮЗ G G 0,l7 0,05
rP --- ---------C----- 0,04 0,0l
Праймер R-N CTCGCCTCTCGCTGTGTG
rN2 C 0,06 0,02
iCycler и CFX96 («Bio-Rad», США). Режим термоциклирования: 1 цикл - 30 мин, 45°С (ОТ), 1 цикл - 1 мин, 94°С, 50 циклов - 10 с 94°С, 20 с 60°С с регистрацией флюоресценции. Все олигону-клеотиды были синтезированы ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).
Результаты и обсуждение Дизайн олигонуклеотидов. Нуклеотидные последовательности геномов вариантов ВИЧ-2 и разных генетических групп ВИЧ-1 достаточно сильно отличаются друг от друга, и подобрать одну комбинацию праймеров и зонда, пригодную для выявления всех вариантов, невозможно. Было решено разбить систему детекции нуклеиновых кислот ВИЧ на три компонента: ВИЧ-1 группы М; ВИЧ-1 групп N,O и P; ВИЧ-2. Заболевания, вызываемые вирусами, относящимися к разным группам ВИЧ-1, не отличаются по клинической картине и соответственно не нуждаются в дифференциальной диагностике, поэтому детекцию РНК всех групп ВИЧ-1 проводили по одному каналу флуоресценции. Для определения ВИЧ-2 использовали другой флуорофор (HEX). Выявление всех вариантов ВИЧ происходило в одной пробирке.
Принципы дизайна олигонуклеотидов и аналитические характеристики для системы детекции РНК ВИЧ-1 группы М были описаны нами ранее [12]. Для выявления нуклеиновых кислот ВИЧ-1 использовали набор из 4 праймеров и специфичный зонд с флуоро-фором ROX, для внутреннего контроля - отдельная пара праймеров и зонд с флуорофором FAM.
Для детекции РНК ВИЧ-2 был выбран консервативный участок длинного концевого повтора (LTR) длиной 140 нуклеотидов. Мишенью для детекции генетического материала ВИЧ-1 групп N,O и P также был выбран фрагмент LTR длиной 139 нуклеотидов. При дизайне зонда выбрана последовательность, соответствующая участку с наименьшей изменчивостью и пригодная для выявления 3 групп ВИЧ-1. В имеющихся в международной Лос-Аламосской базе данных ВИЧ (http://hiv. lanl.gov) и базе Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) последовательностях геномов ВИЧ-1 групп N,O и P в сайте связывания зонда нуклеотидных замен нет. Прямой праймер для ПЦР выбран так, что он имеет по одному ну-клеотидному несоответствию с геномом ВИЧ-1 каждой из трех не-M групп, причем эти несоответствия примерно равнозначны по своему вкладу в изменение температуры отжига и не сильно искажают структуру дуплекса: вместо канонической комплементарной пары T-A образуется стабильная пара T-G ближе к 5'-концу праймера. В качестве обратных праймеров были выбраны два олигонуклеотида - один для выявления ВИЧ-1 группы N, другой - для ВИЧ-1 групп O и P (табл. 1).
Проверка устойчивости разработанного теста к нуклео-тидным заменам. Для каждого образца из панели искусственных ДНК- и РНК-матриц, соответствующих разным изолятам ви-
Таблица l
Погрешность в определении концентрации РНК, loglO
Таблица 2
Определение аналитической чувствительности набора по РНК ВИЧ-1 группы М, РНК ВИЧ-2 и
ДНК ВИЧ-1 групп О и N
Объект РНК копий/мл* ^10 копий/мл* Количество протестированных Количество выявленных Процент выявленных Аналитическая чувствительно сть (вероятность 95%)
ВИЧ-2 160 2,20 18 18 100 45 копий/мл
80 1,90 18 18 100
40 1,60 18 15 83
20 1,30 18 13 72
10 1,00 18 5 28
5 0,70 18 2 11
2,5 0,40 18 2 11
ВИЧ-1
(группа М субтип А) 160 2,20 24 24 100 42 МЕ/мл
80 1,90 24 24 100
40 1,60 24 20 83
20 1,30 24 16 67
10 1,00 24 11 46
5 0,70 24 6 25
2,5 0,40 24 3 13
ВИЧ-1
(группа О) 320 2,51 18 18 100 92 копий/мл
160 2,20 18 18 100
80 1,90 18 15 83
40 1,60 18 11 61
20 1,30 18 5 28
10 1,00 18 4 22
5 0,70 18 1 6
ВИЧ-1
группа N 320 2,51 18 18 100 90 копий/мл
160 2,20 18 18 100
80 1,90 18 16 89
40 1,60 18 10 56
20 1,30 18 6 33
10 1,00 18 2 11
5 0,70 18 1 6
Примечание. * для РНК ВИЧ-1 группы М концентрация приведена в МЕ/мл
руса, проводили тестирование с использованием двух разных реакционных смесей: в первой, контрольной, смеси использовали праймеры, полностью комплементарные мишени (для каждой матрицы свои); во второй - один для всех матриц набор праймеров, описанный выше. Каждый образец анализировали в трех разных концентрациях (примерно 103, 104 и 105 копий на пробирку) в трех повторах. Полученные для панели геновариантов не-М групп ВИЧ-1 средние смещения значений порогового цикла (С) при использовании подобранного набора олигонуклеотидов по сравнению с контролем представлены в табл. 1. Для прямого прай-мера на консенсусных матрицах К, О и Р, а также на матрицах, отличающихся от консенсусных на 1 замену нуклеотида (в таблице обозначены как ГО1-ГО4), наблюдали сдвиг С менее 0,3 циклов, что не превышает
погрешности метода определения С! Наиболее значительное смещение значения О наблюдали для матрицы ГО5, содержащей две нуклеотидные замены относительно референс-ной последовательности для О-группы (3 несоответствия прямому прай-меру из разработанного теста). Такое отклонение в пересчете на определяемую концентрацию РНК ВИЧ-1 выразится в занижении истинного значения на 0,5 ^10 копий/мл, что может рассматриваться как допустимая погрешность, так как при сравнении разных методик определения концентрации РНК ВИЧ-1 с использованием наборов разных производителей различия не более, чем на 0,5 ^10 копий/мл, не считаются значимыми. Для обратного праймера на некоторых ДНК-матрицах также наблюдали смещение О; в более позднюю сторону; на РНК-матрицах, соответствующих этим же геновариантам, сдвиг С; стал значительно меньше и не превысил статистической погрешности. Таким образом, можно сделать вывод, что разные генова-рианты РНК ВИЧ-1 групп К,0,Р, нуклеотидные последовательности которых имеются в базах данных, будут одинаково эффективно выявляться при использовании разработанного нами набора реагентов.
Аналогично проверено влияние на результаты анализа замен в участках связывания праймеров для ВИЧ-2, достоверных отличий значений С; от контроля не обнаружено. Последовательности сайтов гибридизации зонда для штаммов, описанных в базах данных, совпадают между собой либо имеют не более одного нуклеотидного несоответствия в 5'-концевой части зонда. Ранее нами на примере ВИЧ-1 показано, что подобные одиночные замены не вносят значимых искажений в результаты количественных измерений и не влияют на чувствительность анализа, хотя и могут приводить к небольшому понижению величины прироста флюоресценции в ходе реакции [12]. Для ВИЧ-2 отдельной подробной проверки влияния на результаты ПЦР разных нуклеотидных несоответствий в комплексе зонд-матрица не проводили.
Рис. 1. Графики накопления флюоресценции (а, в, д) и калибровочные кривые (б, г, е) при анализе серии разведений стандартных образцов РНК ВИЧ-1 группы М (а, б), РНК ВЙЧ-1 группы
О (в, г) и РНК ВИЧ-2 (д, е).
Определение характеристик мультиплексной системы детекции. Все олигонуклеотиды для ВИЧ-1 и ВИЧ-2 подбирали с учетом возможности их совместной работы в одной реакционной смеси с применением следующих требований: отсутствие стабильных удлиняемых гетеродимеров между двумя праймерами или праймером и зондом, отсутствие неспецифичных сайтов связывания праймера на нецелевой мишени, схожие температуры отжига для всех наборов оли-гонуклеотидов. Проводили сравнение вариантов реакционных смесей, содержащих отдельные наборы олигонуклеотидов для выявления ВИЧ-2 и разных
генетических групп ВИЧ-1, и мультиплексного варианта набора. В качестве контрольных образцов использовали ПКО РНК ВИЧ-1, ПКО РНК ВИЧ-2 и искусственные РНК-матрицы ВИЧ-1 групп К, О и Р. Каждый образец анализировали при 3 разных концентрациях РНК в 3 повторах. Достоверно значимых отклонений по эффективности амплификации, значений С и величине флюоресцентного сигнала между отдельными системами детекции и мультиплексным вариантом ни по одному из маркеров не наблюдали.
Линейность анализа. Из контрольных образцов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 были приготовлены серии разведений на отрицательной донорской сыворотке крови с концентрациями от 107 до 100 МЕ/мл для ВИЧ-1 группы М, от 108 до 10 копий/мл для ВИЧ-1 групп 1К,О,Р; от 3-107 до 30 копий/мл для ВИЧ-2. По результатам реакции строили зависимость С от исходной концентрации РНК в стандартах (рис.1). Линейность сохранялась для всех групп ВИЧ-1 и ВИЧ-2 во всем проанализированном диапазоне концентраций, эффективность амплификации каждой матрицы была близка к 100%.
Аналитическая чувствительность. Анализ двукратных разведений ПКО РНК ВИЧ-1 (группа М), ПКО РНК ВИЧ-2 и искусственных ДНК-матриц ВИЧ-1 групп N и О в ВИЧ-серонегативной сыворотке крови проводили в 3 независимых постановках в 6 повторах (для ВИЧ-1 группы М в 8 повторах). Результаты представлены в табл. 2. Определенная с помощью
Таблица 3
Результаты количественного анализа международной панели генотипов РНК ВИЧ-1
Генотип Данные литературы Разработанный тест
Monitor1 Nuclisens2 bDNA3 Abbott4 среднее значение повтор 1 повтор 2 среднее значение
A 3,38 3,55 3,06 3,57 3,39 3,62 3,36 3,49
B 3,15 3,53 3,2 3,4 3,32 3,33 3,62 3,47
C 3,43 3,59 3,07 3,44 3,38 3,40 3,24 3,32
D 3,5 3,81 3,49 3,71 3,63 3,77 3,37 3,57
F 3,67 2,33 3,47 3,53 3,25 3,63 3,61 3,62
G 3,76 - 3,25 3,34 3,45 3,43 3,55 3,49
AE 3,63 3,53 3,33 3,64 3,53 3,30 3,34 3,32
AG-GH 4,11 2,18 3,58 3,62 3,37 3,58 3,19 3,39
Группа O - - - 2,18 2,18 3,57 3,44 3,51
Группа N 3,61 - 2,62 2,48 2,90 3,75 3,56 3,65
Примечание. Значения приведены как log10 копий/мл.
'Roche Amplicor HIV-1 Monitor® Test, v1.5. 2Biomerieux NucliSens® HIV-1QT. 3VERSANT® HIV-1 RNA 3.0 assay. 4Abbott LCx® HIV-1 RNA quantitative assay.
пробит-анализа [13] аналитическая чувствительность выявления РНК ВИЧ-1 группы М составила 42 МЕ/мл (24 копии/мл), ВИЧ-1 группы O - 92 копий/мл, ВИЧ-1 группы N - 90 копий/мл, ВИЧ-2 - 45 копий/мл.
Аналитическая специфичность. Оценку специфичности проводили путем тестирования 100 образцов сыворотки крови здоровых доноров, отрицательных по ВИЧ по результатам серологических исследований. РНК ВИЧ-1 или ВИЧ-2 не обнаружена ни в одной из проб. Также проверяли отсутствие перекрестных лож-ноположительных сигналов при тестировании контрольной панели, включающей РНК и ДНК вирусов из других таксономических групп, которые могли присутствовать в сыворотке, анализируемой на присутствие ВИЧ (вирусы гепатитов A, В, С и D, вирус краснухи, парвовирус В19, вирусы простого герпеса 1-го и 2-го типов, вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус, вирусы герпеса человека 6-го и 8-го типов). Содержание нуклеиновых кислот указанных в панели вирусов в пересчете на пробу - не менее 106 копий на 1 мл. Каждую пробу анализировали в 3 повторах. Все результаты тестирования были отрицательны по РНК ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Для подтверждения отсутствия перекрестных реакций между ВИЧ-1 и ВИЧ-2 66 образцов сыворотки крови от пациентов с подтвержденной ВИЧ-1 инфекцией с концентрацией РНК ВИЧ-1 от 50 до 5*106 МЕ/мл было протестировано разработанным набором в двух повторах. Для всех проб получен отрицательный по РНК ВИЧ-2 результат. Из лизата культуры ВИЧ-2 готовили серию образцов с концентрациями РНК ВИЧ-2 от 100 до 2*107 копий/мл, разведенных на сыворотке крови здоровых доноров, серонегативных по ВИЧ. Всего было протестировано 8 проб в 6 повторах, ни в одной из них РНК ВИЧ-1 не выявлена. Таким образом, аналитическая специфичность набора составила 100%.
Тестирование международной стандартной панели генотипов ВИЧ-1. Каждый образец из панели генотипов ВИЧ-1 (Non WHO Reference Material NIBSC HIV-1 Genotype panel NIBSC code: 08/358) анализировали в 2 повторах, на выделение брали по 100 мкл образца. В качестве количественного стандарта при определении концентрации РНК ВИЧ в исследуемых пробах использовали ПКО РНК ВИЧ-1. Полученные в результате анализа концентрации РНК в пересчете на 1 мл исходной пробы приведены в табл. 3. Там же представлены литературные данные об исследовании этой панели в лабораториях разных стран с использованием диагностических наборов для количественного анализа РНК ВИЧ-1 разных производителей [14]. Видно, что данные по вирусной нагрузке, полученные с помощью нашего теста, значимо не отличаются для всех образцов группы M. Оба образца РНК редких групп N и O ВИЧ-1 в нашем исследовании показали положительный результат, измеренная концентрация была не меньше, чем значения, полученные с использованием других тестов.
Сравнение с коммерческим аналогом. С использованием разработанного нами набора и коммерческого аналога АмплиСенс HCV/HBV/HIV-FL проводили параллельное исследование 40 образцов сывороток крови от больных ВИЧ-инфекцией на различных стадиях заболевания, 20 образцов сывороток крови от здоровых доноров, а также 16 образцов, полученных путем разведения лизата ВИЧ-2 на ВИЧ-серонегативной сы-
воротке. Концентрация РНК ВИЧ-1 в исследованных пробах варьировала в пределах от 50 до 250 000 МЕ/мл, РНК ВИЧ-2 - от 30 до 106 копий/мл. Результаты качественного анализа на РНК ВИЧ-1 при использовании двух наборов полностью совпали. По ВИЧ-2 наблюдали расхождения результатов по одному образцу: положительный при использовании нашего набора и отрицательный при анализе набором АмплиСенс HCV/ HBV/HIV-FL. При повторном тестировании данной пробы РНК ВИЧ-2 была обнаружена в 5 из 6 пробирок при использовании нашего набора и в 3 из 5 - Ам-плиСенс HCV/HBV/HIV-FL. Теоретически ожидаемая концентрация вирусной РНК в этом образце с учетом разбавления составляла 30 копий/мл, что ниже заявленной аналитической чувствительности обоих наборов, соответственно, эти результаты можно не учитывать.
Разработанный прототип диагностического набора позволяет надежно выявлять в сыворотке (плазме) крови различные генетические варианты РНК ВИЧ-1 всех генетических групп и РНК ВИЧ-2, он обладает высокой аналитической чувствительностью. Результаты хорошо коррелируют в сравнении с коммерческим аналогом. Применение набора в клинической практике может помочь повысить эффективность диагностики ВИЧ-инфекции. Данный тест включен в состав коммерческого набора РеалБест ВГВ/ВГС/ ВИЧ ПЦР, предназначенного для высокочувствительного скринирования донорской крови на присутствие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Сведения об авторах:
Прасолова Мария Анатольевна (Prasolova Mariya Anatolyevna), мл. науч. сотр. ИЦИГ СО РАН, научн.сотр. ЗАО «Вектор-Бест», асс. каф. молекулярной биологии НГУ; e-mail: m.a.prasolova@gmail.com;
Иванов Михаил Константинович (Ivanov Mikhail Konstantinovich) - канд.биол.н., зав. лаб.ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», научн. сотр. ИЦИГ СО РАН, ст. преп.каф. молекулярной биологии НГУ; e-mail: imk@ngs.ru,
Гашникова Наталья Матвеевна (Gashnikova Natalya Matveevna) ngash@vector.nsc.ru, - к.б.н.; зав. отд. ретровирусов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; e-mail: ngash@ vector.nsc.ru,
Нетёсова Екатерина Сергеевна (Netesova Ekaterina Sergeevna), научный сотрудник ЗАО «Вектор-Бест»; e-mail: netesovae@vector-best.ru,
Дымшиц Григорий Моисеевич (Dymshits Grigorij Moiseevich), д.б.н., проф., проф. каф. молекулярной биологии НГУ, научн.сотр. ИХБФМ Со РАН. e-mail: dymshits@yandex.ru,
ЛИТЕ РАТ У РА / REFERENCES
1. Global report: UNAIDS report on the global AIDS epidemic. 2012.
2. Chamberland M.E., Lackritz E.M., Busch M.P. HIV screening of the blood supply in developed and developing countries. AIDS Rev. 2001; 3: 24-35.
3. Plantier J.C., Leoz M., Dickerson J.E., De Oliveira F., Cordonnier F., Lemee V. et al. A new human immunodeficiency virus derived from gorillas. Nat. Med. 2009; 15(8): 871-2.
4. McCutchan F.E. Global epidemiology of HIV. J. Med. Virol. 2006; 78: 7-12.
5. Gould K. Infection with HIV-1 group O. AIDS. 1997; 11(6): 399-405.
6. Henquell C., Jacomet C.,Antoniotti O., Chaib A., Regagnon C., Brunet S. et al. Difficulties in diagnosing group o human immunodeficiency virus type 1 acute primary infection. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(7): 2453-6.
7. Aghokeng A.F., Mpoudi-Ngole E., Dimodi H., Atem-Tambe1 A., Tongo M., Butel C. et al. Inaccurate diagnosis of HIV-1 group M and O is a key
challenge for ongoing universal access to antiretroviral treatment and HIV prevention in Cameroon. PLoS One. 2009; 4(11): 7702-7.
8. Damond F., Worobey M., Campa P., Farfara I., Colin G., Matheron S. et al. Identification of a highly divergent HIV type 2 and proposal for a change in HIV type 2 classification. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004; 20(6): 666-72.
9. Ibe S., Yokomaku Y., Shiino T., Tanaka R., Hattori J., Fujisaki S. et al. HIV-2 CRF01_AB: First Circulating Recombinant Form of HIV-2. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2010; 54(3): 241-7.
10. Peterson K., Jallow S., Rowland-Jones S.L., de Silva T.I. Antiretroviral therapy for HIV-2 infection: recommendations for management in low-resource settings. AIDS Res. Treat. 2011; 2011. Article ID 463704.
11. Matheron S., Pueyo S., Damond F., Simon F., Lepretre A., Campa P. et al. Factors associated with clinical progression in HIV-2 infected-patients: the French ANRS cohort. AIDS. 2003; 17(18): 2593-601.
12. Прасолова М.А., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Разработка высокочувствительного устойчивого к нуклеотидным несовпадениям ПЦР-теста для качественного и количественного определения РНК ВИЧ-1. Вопросы вирусологии. 2011; 56(1): 24-9. Prasolova M.A., Ivanov M.K., Dymshits G.M. The development of an ultrasensitive mismatch tolerant PCR assay for detection and quantitation of HIV-1 RNA. Voprosy virusologii. 2011; 56(1): 24-9 (in Russian).
13. Finney D.J. Probit analysis. 3-rd. Cambridge: University Press; 1980.
14. Holmes H., Davis C, Heath A. Development of the 1st International Reference Panel for HIV-1 RNA genotypes for use in nucleic acid-based techniques. J. Virol. Methods. 2008; 154: 86-91.
Поступила 18.11.13 Received 18.11.13
A SINGLE-TUBE REAL-TIME RT-PCR ASSAY FOR THE RNA DETECTION AND QUANTIFICATION OF GENETICALLY DIVERSE HIV INCLUDING RARE NON-M GROUP OF THE HIV-1 AND HIV-2
Prasolova M. A.1-2-3, Ivanov M. K. 1-2-3, Gashnikova N. M.4, Netesova E. S.2, Dymshits G. M.3-5
'Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2Vector-Best JSC, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 3Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia; 4State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 5Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia
The RT-PCR method with real-time fluorescence detection was used for development of $ prototype of diagnostic kit for reliable diagnosis of genetic variants of RNA of the HIV-1of groups M, N, O, P and RNA of the HIV-2 in blood plasma and serum. The kit is stable against nucleotide defects, provides broad linear range of concentration of the HIV RNA, 100% analytical specificity and adequate analytical sensitivity: 42 ME/ml (HIV-1 of group M), 45 copies/ml (HIV-2), 92 copies/ml (HIV -1 of group O), 90 copies/ml (HIV -1 of group N). The kit provided successful detection and measurement of HIV RNA concentration in the samples of the international reference panel of the HIV-1 genotype. The results of the test correlate with results of commercial tests.
Key words: HIV-1, group O, HIV-2, stability against nucleotide defects, RT-PCR
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.833.27:578.5].083.2
ЯшинаЛ.Н.1, Малышев Б.С.1, Нетесова Н.А.1, Волынкина А.С.2, ВасиленкоН.Ф.2
ВИРУС КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ, ЦИРКУЛИРОВАВШИЙ В СТАВРОПОЛЬСКОМ КРАЕ В 2011 г.
1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области; 2ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Ставрополь
Проведен генетический мониторинг вируса крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), циркулировавшего на территории Ставропольского края в 2011 г Методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием генотипированы 14 РНК изолятов вируса, выделенных от больных Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ). Анализ последовательностей фрагмента M-сегмента генома (позиции 2607-2932) вируса ККГЛ подтвердил циркуляцию на территории края европейского генетического типа Европа 1. В дополнение к ранее выявленному генетическому варианту STV/ROS данного генотипа, на территории Ставропольского края выявлен второй генетический вариант VLG/ROS. Ключевые слова: вирус крымской-конго геморрагической лихорадки; генотип; Ставропольский край.
Вирус крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), принадлежащий к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae, распространен на обширной территории Европы, Азии и Африки [2, 5]. На территории России природные очаги КГЛ зарегистрированы в Ставропольском крае, Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, республиках Калмыкия, Дагестан и Ингушетия. В течение последних 13 лет, с 1999 по 2011 гг., наибольшее число случаев КГЛ отмечено
Для корреспонденции: Яшина Людмила Николаевна (Yashina Li-udmila Nikolaevna), зав. лаб. разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», докт. биол. наук; e-mail: yashina@vector.nsc.ru,
For correspondence: Yashina Liudmila Nikolaevna; e-mail: yashina@ vector.nsc.ru
на территории Ставропольского края, где зарегистрировано 548 больных из общего числа 1501 учтенного случая [1]. Клиническая картина заболевания варьировала от легких форм лихорадки без геморрагического синдрома до тяжелых форм, которые в 4,5 % случаев приводили к летальным исходам.
На основании анализа вирусного генома, состоящего из трех сегментов РНК отрицательной полярности, выделяют 7 географически и генетически различающихся генетических типов вируса ККГЛ [2, 3]. На территории Европы циркулирует два генетических типа, один из которых, обозначаемый в разных работах как тип VI, Greece или Европа 2, выявлен в Греции и Турции. Второй генотип, обозначаемый как тип V, Europe/ Turkey или Европа 1, распространен вокруг Черного моря на территории Европы, включая южные регионы России, и в Турции. Исследования инфицированных клещей рода Hyalomma - переносчиков вируса и образцов крови больных ККГЛ, проведенные в 2000 г., показали, что на территории Ростовской, Волгоградской областей и Ставропольского края циркулируют 2 генетически различающихся варианта генотипа Европа 1 [6]. Генетический вариант Волгоград-Ростов (VLG/ROS) выявлен на территории Волгоградской и Ростовской областей вокруг Цимлянского водохранилища, РНК изоляты генетического варианта Ставрополь-Ростов (STV/ROS) обнаружены на территории Ставропольского края и юга Ростовской области.
