CC BY
10март -
ап рел ь 2012
УДК 615.099
Общетоксическое действие фрагмента фактора дифференцировки HLDF
Ржевский Д.И.1,3, Дьяченко И.А.1,3, Новикова Н.И.1, Скобцов Д.И.1,3, Скобцова Л.А.1,3, Кравченко И.Н.1, Хохлова О.Н.13, Понаморева Т.И.13, Кравченко Н.Н.1, Семушина С.Г.1, Пахомова И.А.1, Садовникова Е.С.1, Калабина Е.А.1, Дьяченко Е.В.1, Мурашев А.Н.1,3, Байдакова Л.К.2, Костанян И.А.2, Липкин В.М.2
1Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ), г. Пущино.
2Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ), г. Москва. 3Пущинский государственный университет (ПущГУ)
Проведены доклинические исследования острой и хронической токсичности гексапепти-да HLDF-6 из фактора дифференцировки человеческих лейкоцитов при его внутрибрю-шинном введении самцам и самкам мышей CD-1 и внутримышечном введении самцам и самкам крыс CD. Определен класс токсичности HLDF-6. Установлено, что многократное, на протяжении 14 дней, введение HLDF-6 внутримышечно в дозе 10 мг/кг является безопасным, побочные эффекты не наблюдаются.
Ключевые слова: HLDF—6, острая и хроническая токсичность.
Введение. Рост числа раковых заболеваний и нехватка эффективных способов их лечения делают чрезвычайно важными поиски эндогенных биорегуляторов, способных останавливать рост злокачественных клеток и метастазирование опухолей. Внимание многих исследователей сосредоточено сейчас на препаратах, вызывающих дифференцировку клеток, поскольку патогенез многих злокачественных опухолей связан с отклонениями в нормальной клеточной дифференцировке. Белковые факторы дифференцировки и их биологически активные пептидные фрагменты могут оказаться чрезвычайно перспективными в терапии опухолей в качестве независимых лекарственных средств, либо как дополнение к действию цитостатических препаратов, убивающих делящиеся клетки.
Одним из таких перспективных белков является HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), небольшой белок с молекулярной массой 8,2 кДа, выделенный в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН из культуральной среды клеток промиелоцитарно-го лейкоза человека HL-60, обработанных полностью-транс-ретиноевой кислотой, и индуцирующий дифференцировку исходных клеток по гранулоцитарному пути [1,2].
В С-концевом участке полипептидной цепи этого эндогенного фактора дифференцировки был идентифицирован шестичленный фрагмент (41 - 46) TGENHR с аминокислотной последовательностью Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, синтезированный аналог которого (HLDF-6) сохранял способность полноразмерного природного фактора индуцировать дифференцировку с сопутствующей остановкой клеточной пролиферации клеток HL-60. Показано, что эти свойства HLDF-6, не имеющего специфических рецепторов на поверхности клеток HL-60, определяются способностью пептида взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран, что сказывается на связывании цитокинов, задействованных в процессе пролиферации и дифференцировки, с клеточной поверхностью [3].
Принимая во внимание потенциальные возможности применения HLDF-6 в клинической практике, а также отсутствие данных о токсичности HLDF-6 необходимость оценки безопасности данного пептида представляется очевидной.
Целью данного исследования было изучение острой и хронической токсичности пептида HLDF-6 на грызунах.
Материалы и методы исследования. Исследования выполнялись на аутбредных крысах CD (Sprague-Dawley) и мышах CD-1. Животные были получены из НПП ФИБХ «Питомник лабораторных животных» и содержались в барьерных помещениях в стандартных условиях, рекомендуемых для содержания грызунов [4]. Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены биоэтической комиссией ФИБХ и соответствовали «Принципам надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р-53-434-2009).
Раствор HLDF-6 для введения готовили на физиологическом растворе (0,9 % NaCl). При изучении острой токсичности тестируемое вещество вводили животным внутрибрю-шинно в объеме 10 мл/кг, при изучении субхронической токсичности - внутримышечно в объеме 1 мл/кг. Животные контрольных групп получали физиологический раствор в том же объеме.
Изучение острой токсичности HLDF-6 с определением класса токсичности выполняли при однократном введении вещества самцам и самкам мышей. Для определения класса токсичности использовали рекомендации руководства 420 OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) [5]. Животным была введена доза 2000 мг/кг. После введения за всеми животными проводилось наблюдение в течение 14 дней, затем проведена их эвтаназия и некропсия с осмотром макроповреждений органов.
Исследование субхронической токсичности было выполнено на самцах и самках крыс при ежедневном введении HLDF-6 в дозе 10 мг/кг в течение 14 дней. Доза была подобрана с превышением биологически активной более чем в 10 раз. У животных оценивали прирост массы тела, потребление корма и внешние признаки интоксикации. По окончании сроков наблюдений животных подвергали эвтаназии в СО2-камере и некропсии. Были изучены гематологические показатели (количество эритроцитов, количество лейкоцитов, уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците), показатели гемостаза (протромбиновое время, АПТВ), биохимические параметры сыворотки крови (щелочная фосфатаза (ЩФ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), аланинаминотрансфераза (АлАТ), холестерин, мочевина, глюкоза, белок), выполнен гистологический анализ органов и тканей.
Для всех количественных данных были подсчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (m±SD). Нормальность распределения определялась методом Shapiro-Wilk. Для установления межгрупповых различий в показателях прироста массы тела и потребления корма применяли однофакторный ANOVA с тестом Newman-Keuls; для межгруппового сравнения показателей гематологии, биохимии и массы органов - t-критерий Стъюдента для независимых выборок или непараметрический U-критерий Манн-Уитни, в зависимости от типа распределения данных. Различия считали статистически значимыми при P<0,05. Статистический анализ проводили с помощью программы «Statistica for Windows 7.0».
Результаты и обсуждения. При однократном внутрибрюшинном введении пептида HLDF-6 мышам в дозе 2000 мг/кг отклонений в состоянии здоровья экспериментальных животных не наблюдалось. При некропсии никаких макроскопических повреждений внутренних органов обнаружено не было. Таким образом, по результатам исследования острой токсичности пептид HLDF-6 может быть отнесен к 5-му классу токсичности (ЛД50>2000 мг/кг) по системе классификации, принятой OECD [6].
В условиях субхронического эксперимента клинические признаки интоксикации жи-
16
вотных, как самцов, так и самок, получавших тестируемую дозу 10 мг/кг, также не проявлялись. Кроме того, достоверных отличий между контрольной и экспериментальной группой по приросту массы тела обнаружено не было. При этом, по сравнению с 1 днем исследования, в группе самцов, получавших HLDF-6, выявлено достоверное увеличение прироста массы тела на 7-й день и 14-й день, а также зарегистрирован прирост массы тела на 14 день исследования по сравнению с 7 днем. В группе самок, получавших HLDF-6, достоверных отличий между 1 днем и 7 не обнаружено, однако на 14 день эксперимента, обнаружено достоверное увеличение массы тела как относительно 1 дня, так и относительно 7 дня (табл. 1).
Анализ потребления корма не выявил достоверных отличий между контрольной и тестируемой группами, а также между данным показателем внутри группы на 7 и 14 дни эксперимента (табл. 2).
Статистически значимых отличий в значениях показателей гематологии и гемостаза между животными, получавшими HLDF-6, и контрольной группой выявлено не было (табл. 3).
У самцов крыс, получавших пептид HLDF-6, достоверных отличий в показателях биохимии сыворотки крови от контрольной группы не наблюдалось. У самок изменения биохимических параметров сыворотки крови выражались в статистически значимом, по сравнению с контрольной группой, увеличении уровня белка, однако, наблюдаемые колебания данного показателя находились в пределах физиологической нормы, и вероятно не являются признаком токсичности тестируемого вещества (табл. 4).
При некропсии самцов и самок животных, подвергнутых эвтаназии после окончания периода введения HLDF-6, изменений массы внутренних органов относительно животных контрольной группы зарегистрировано не было. Проведенный гистологический анализ также не выявил отклонений структуры органов от нормы.
Выводы. На основании проведенного исследования субхронической токсичности пептида HLDF-6 при его внутримышечном введении самцам и самкам крыс в дозе 10 мг/ кг можно сделать заключение, что HLDF-6 не обладает токсическим действием в исследуемой дозе у крыс CD.
Работа финансировалась Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 02.740.11.0773).
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
Таблица 1
Средние значения массы тела и ее прироста у крыс CD.
параметр самцы самки
0,9% №С1 HLDF-6 0,9% N30 HLDF-6
(п=5) (п=5) (п=5) (п=5)
1 день, г 222±30 221±12 178±7 177±6
7 день, г 251±29 251±13# 186±12 184±7
Прирост на 7 день, г 29±7 30±10 8±12 7±8
Прирост на 7 день, % 13±4 14±5 5±7 4±5
14 день, г 287±30# 290±11#& 195±27 202±14#&
Прирост на 14 день, г 65±10 69±7 17±29 25±15
Прирост на 14 день, % 30±7 31±4 10±16 14±9
Примечание. # - P<0.05 относительно 1 дня эксперимента (ANOVA с последующим тестом Newman-Keuls); & - P<0.05 относительно 7 дня эксперимента (ANOVA с последующим тестом Newman-Keuls).
17
март -
ап рел ь 2012
Таблица 2
Средние значения потребления корма у крыс CD
параметр самцы самки
0,9% NaCl HLDF-6 0,9% NaCl HLDF-6
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
Потребление корма (г/кг/сут) 7 день
80±14 71±12 97±16 93±14
14 день
79±17 76±3 85±12 89±11
Таблица 3
Средние значения показателей гематологии и гемостаза сыворотки крови крыс CD
самцы самки
параметр 0,9% NaCl HLDF-6 0,9% NaCl HLDF-6
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
Протромбиновое время, сек 29,0±1,7 32,1±0,3 30,2±1,0 34,2±3,9
АПТВ, сек 11,9±2,2 11,9±0,3 15,4±1,5 16,0±2,3
Гемоглобин, г/л 165,3±6,1 164,8±16,6 161,7±7,4 159,9±11,2
Количество эритроцитов, 106/мкл 7,9±1,7 8,6±0,9 7,2±0,4 8,0±0,7
Количество лейкоцитов, 103/мкл 11,7±2,1 10,7±1,4 10,4±0,8 11,1±2,5
МСН, га- 21,6±3,7 19,3±1,8 22,5±1,0 20,0±0,8
Таблица 4
Средние значения показателей биохимии сыворотки крови крыс CD
параметр самцы самки
0,9% NaCl HLDF-6 0,9% NaCl HLDF-6
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
Мочевина ммолль/л 6,6±0,5 6,6±1 7,8±2,2 6,7±1,1
Холестерин ммоль/л 2,6±0,4 2,4±0,2 2,2±0,7 2,6±0,4
АлАТ, мккат/л 51±8 57±14 40±11 40±7
АсАТ, мккат/л 117± 13 130±28 116±22 124±16
ЩФ Ед/л 281±51 206±115 150±12 132±25
Белок Ед/л 63±2,2 63±0,5 65±2 69±2 *
Примечание. * P<0.05 относительно животных соответствующего пола, получавших 0,9% NaCl (Student's t-test).
18
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Костанян И.А., Астапова М.И., Старовойтова Е.В., Драницына С.М., Липкин
B.М. / (1995) Биоорган. химия. Т. 21 С. 243-248.
2. Kostanyan IA, Astapova MV, Starovoytova EV, Dranitsina SM, Lipkin VM. / FEBS Lett. 1994. V. 356 (2-3). P. 327-329.
3. Костанян И.А., Астапова М.В., Наволоцкая Е.В., Лепихова Т.Н., Драницына
C.М., Телегин Г.Б., Родионов И.Л., Байдакова Л.К., Золотарев Ю.А., Молотковская И.М., Липкин В.М. / Биоорганич. химия. 2000. Т. 26. № 7. С. 505-511.
4. The Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Washington, D.C.: National Academy Press. 1996.
5. Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Guideline 420. / OECD 2001, Paris.
6. Harmonized Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. / OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO (2001) 6. Raris: OECD, 2001
Rzhevskiy D.I.1'3, Dyachenko I.A.1,3, Novikova N.I.1, Skobtsov D.I.1'3, Skobtsova Z.A.1,3, Kravchenko I.N.1, Khokhlova O.N.1,3, Ponamoryova T.I. u, Kravchenko N.N.1, Semushina S.G.1, Pakhomova I.A.1, Sadovnikova Ye.S.1,Kalabina Ye.A.1, Dyachenko Ye.V.1, Murashev A.N.1,3, Baydakova
L.K.2, Kostanyan I.A.2, Lipkin V.M.2
General toxic effect of the fragment of the human leukemia differentiation factor (HLDF)
1M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Branch of the Rusian Academy of Sciences, Settlement Pushchino, Moscow Region 2M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Rusian Academy of Sciences, Moscow 3Pushchino State University
Pre-clinic investigations were carried out into acute and chronic toxicity of hexapeptide HLDF-6 identified as a fragment of the differentiation factor of human leucocytes at its intra-abdominal administration to CD-1 mice males and females and at intramuscular injections to CD rats males and females. A toxicity class of HLDF-6 was determined. It was stated that a multiple over 14 days intramuscular injections of HLDF-6 at a dose of 10mg/kg is nonhazardous, side effects were not noted.
Материал поступил в редакцию 3.11.2011 г
19
