Научная статья на тему 'Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера'

Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
178
42
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Ключевые слова
АМИДНАЯ ФОРМА ПЕПТИДА HLDF-6 / БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА / НЕЙРОПРОТЕКТОРНАЯ И НООТРОПНАЯ АКТИВНОСТИ / ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ / ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ HLDF

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Бoгачук А.П., Сторожева З.И., Телегин Г.Б., Чернов А.С., Прошин А.Т.

Нейропротекторная и ноотропная активности амидной формы (АФ) пептида HLDF-6 (TGENНRNH2 ) изучены на трансгенных мышах линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo (Tg+) животной модели наследственной болезни Альцгеймера (БА). Исследования проведены на четырех группах мышей: группа 1 (экспериментальная) мыши Tg+, которым интраназально вводили пептид в дозе 250 мкг/кг; группа 2 (активный контроль) мыши Tg+, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 3 (контроль-1) мыши Tg-; группа 4 (контроль-2) мыши линии С57Bl/6. Когнитивные функции оценивали с использованием теста распознавания объекта, теста пассивного избегания и лабиринта Морриса. Показано, что фармацевтическая субстанция (ФС) на основе АФ пептида HLDF-6 в условиях интраназальной доставки в дозе 250 мкг/кг эффективно восстанавливает нарушенные когнитивные функции у трансгенных мышей Tg+. Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными на животных моделях болезни Альцгеймера, которым фрагмент (25-35) бета-амилоида (βА) вводили в базальное гигантоклеточное ядро Мейнерта, в гиппокамп вводили одновременно фрагмент βА и иботеновую кислоту, а также при ишемическом инсульте (хроническая окклюзия сонных артерий 2VO). Исходя из полученных результатов, для проведения доклинических исследований выбрали ФС на основе АФ пептида HLDF-6, и в качестве эффективной терапевтической дозы 250 мкг/кг ФС. Способ доставки интраназальное введение.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Бoгачук А.П., Сторожева З.И., Телегин Г.Б., Чернов А.С., Прошин А.Т.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.084.1

Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера

A. П. Богачук1*, З. И. Сторожева2, Г. Б. Телегин3, А. С. Чернов3, А. Т. Прошин4,

B. В. Шерстнев4, Ю. А. Золотарев5, В. М. Липкин1

1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

2Федеральный медицинский исследовательский центр наркологии и психиатрии им. В.П. Сербского Минздрава России, 119034, Москва, Кропоткинский пер., 23 3Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6 4Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАН, 123315, Москва, ул. Балтийская, 8

5Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова, 2 *E-mail: apbog@mx.ibch.ru Поступила в редакцию 04.07.2016 Принята к печати 24.05.2017

РЕФЕРАТ Нейропротекторная и ноотропная активности амидной формы (АФ) пептида HLDF-6 (TGENHR-NH2) изучены на трансгенных мышах линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo (Tg+) - животной модели наследственной болезни Альцгеймера (БА). Исследования проведены на четырех группах мышей: группа 1 (экспериментальная) - мыши Tg+, которым интраназально вводили пептид в дозе 250 мкг/кг; группа 2 (активный контроль) - мыши Tg+, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 3 (кон-троль-1) - мыши Tg-; группа 4 (контроль-2) - мыши линии С57В1/6. Когнитивные функции оценивали с использованием теста распознавания объекта, теста пассивного избегания и лабиринта Морриса. Показано, что фармацевтическая субстанция (ФС) на основе АФ пептида HLDF-6 в условиях интраназальной доставки в дозе 250 мкг/кг эффективно восстанавливает нарушенные когнитивные функции у трансгенных мышей Tg+. Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными на животных моделях болезни Альцгеймера, которым фрагмент (25-35) бета-амилоида (РА) вводили в базальное гигантоклеточное ядро Мейнерта, в гиппокамп вводили одновременно фрагмент РА и иботеновую кислоту, а также при ише-мическом инсульте (хроническая окклюзия сонных артерий - 2VO). Исходя из полученных результатов, для проведения доклинических исследований выбрали ФС на основе АФ пептида HLDF-6, и в качестве эффективной терапевтической дозы - 250 мкг/кг ФС. Способ доставки - интраназальное введение. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА амидная форма пептида HLDF-6, болезнь Альцгеймера, нейропротекторная и ноотропная активности, трансгенные мыши, фактор дифференцировки HLDF.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ HLDF - фактор дифференцировки лейкозных клеток человека (Human Leukemia Differentiation Factor); АФ - амидная форма; НФ - нативная форма; БА - болезнь Альцгеймера; ИИ - ише-мический инсульт; ФС - фармацевтическая субстанция; РА - бета-амилоид.

ВВЕДЕНИЕ

К числу важнейших медико-социальных проблем современности относятся цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания, являющиеся основной причиной смертности и инвалидизации населения России и зарубежных стран. К нейроде-

генеративным заболеваниям относится наиболее распространенная болезнь Альцгеймера (БА), диагностированная почти у 44 млн человек [1]. БА прогрессирует медленно, но неотвратимо и ведет к «отключению» важнейшего органа - головного мозга и расстройству ряда функций организма человека.

В последнее десятилетие болезнь Альцгеймера признана одной из четырех главных медико-социальных проблем современного общества.

Одним из серьезнейших цереброваскулярных заболеваний является ишемический инсульт (ИИ). Ежегодно в мире регистрируется более 15 млн случаев инсульта [2], в том числе более 450000 в России. К существенным недостаткам лекарственных средств, используемых при БА и ИИ и резко ограничивающих область их применения, относятся нежелательные побочные эффекты, а также привыкание либо недостаточная эффективность. Все это требует принятия неотложных мер для создания и внедрения в медицинскую практику новых эффективных препаратов для профилактики и лечения этих заболеваний.

Фактор дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) был обнаружен и выделен нами в 1994 году из среды культивирования клеток линии HL-60, обработанных ретиноевой кислотой [3]. При изучении фактора HLDF был идентифицирован его шестичленный фрагмент TGENHR (пептид HLDF-6), полностью воспроизводящий дифференцирующую активность полноразмерного фактора и обладающий широким спектром ноотропной и нейропротекторной активностей. На первичной культуре нейрональных клеток гиппокампа, мозжечка, а также иммунокомпетентных клеток получены прямые доказательства нейропротекторного эффекта пептида HLDF-6. Этот пептид проявляет антиапоптотическую активность, защищая клетки от действия пептида бета-амилоида (ßA), азида натрия, церамида, этанола, а также от холодового стресса и гипоксии. Пептид HLDF-6 повышает жизнеспособность ранних зародышей мышей в условиях in vitro [4-7].

Изучение действия пептида HLDF-6 на разных видах животных, проведенное с использованием различных экспериментальных моделей (водный лабиринт Морриса, модели пассивного избегания, отсроченного выбора положения, зоосоциального узнавания), показало, что центральное и системное введение пептида здоровым животным приводит к улучшению формирования и сохранения долговременной памяти. На экспериментальных моделях клинической патологии (БА и ИИ) показано, что пептид снижает выраженный когнитивный дефицит и способствует восстановлению нарушенной памяти [8, 9]. Введение HLDF-6 животным с хронической ишемией головного мозга обеспечивает достоверный ней-ропротекторный эффект, защищая нейроны мозга от гибели в условиях ишемии [10].

Изучение фармакокинетики пептида HLDF-6 показало, что пептид обладает чрезвычайно низкой

устоичивостью в организме животных - период полудеградации пептида в плазме крови крысы равен 2 мин. Гидролиз HLDF-6 происходит с С-конца, и основной вклад в него вносят дикарбоксипепти-дазы [11]. Для защиты пептида от дикарбоксипеп-тидаз использовали амидирование его С-концевой карбоксильной группы. Показано, что период полудеградации амидной формы (АФ) пептида HLDF-6 (TGENНR-NH2) в плазме крови крысы составляет 8 мин, что значительно выше, чем у нативной формы (НФ) пептида (TGENHR-ОH) [12].

С целью выбора наиболее эффективной формы пептида HLDF-6 для исследования ее в качестве фармацевтической субстанции (ФС) мы провели расширенное сравнительное изучение нейропротектор-ной и ноотропной активности образцов ФС на основе АФ и НФ пептида HLDF-6 на животных моделях БА и ИИ. На первом этапе мы выявили нейропро-текторную и ноотропную активность ФС на основе пептида HLDF-6 в моделях спорадической болезни Альцгеймера. Были использованы следующие модели: а) нарушение когнитивных функций при введении фрагмента (25-35) бета-амилоида в базальное гигантоклеточное ядро крыс Вистар; б) нарушение когнитивных функций при совместном введении фрагмента (25-35) бета-амилоида и иботеновой кислоты в гиппокамп крыс Вистар. Сравнительный анализ данных, полученных в обеих моделях БА, показал, что нейропротекторная эффективность АФ пептида HLDF-6, оцениваемая по степени восстановления нарушенных когнитивных функций, значимо превышает эффективность НФ пептида. При использовании АФ пептида HLDF-6 в дозе 250 мкг/кг (гораздо меньшей, чем доза препаратов сравнения) всегда наблюдалось практически полное восстановление функций [12].

В нашей работе представлены результаты изучения специфической активности ФС на основе АФ пептида HLDF-6 на трансгенной модели БА. Трансгенную модель использовали в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия [13].

Болезнь Альцгеймера - нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарушением когнитивной функции и деменцией. Существуют наследственная и спорадическая формы БА. Наследственная форма передается по аутосомно-доминантному типу. В 1991 году был идентифицирован первый ген, обусловливающий семейную манифестацию БА, - локализованный на хромосоме 21 мутантный ген белка АРР - предшественника РА [14]. Позднее были выявлены мутации других генов, повышающие риск развития БА. Наибольшим эф-

фектом из продуктов этих генов обладал пресени-лин-1 (ген которого расположен на хромосоме 14), ответственный за 70-80% случаев наследственной БА с ранним началом [15]. Создание трансгенных животных позволяет моделировать молекулярные процессы развития БА в течение всей жизни организма. Основное преимущество трансгенной модели состоит в том, что введение животным генов человека, отвечающих за развитие наследственной формы БА (генов АРР и пресенилина), приводит к развитию у них патогенетических процессов, сходных с проявлениями БА у человека (образование амилоидных бляшек, окислительный стресс, нарушение холинергической передачи, гибель нейронов). Это позволяет предположить, что процессы, проходящие в ЦНС модельных животных, сходны с процессами при развитии БА у человека. Для изучения потенциальных лекарственных препаратов наиболее подходят так называемые дабл-трансгенные мыши линии В6С3-Tg(APPswe,PSEN1de91)85Dbo [16]. Животные этой линии экспрессируют мутантный пресенилин человека и химерный амилоидный белок мышь/человек. Характерной особенностью этой линии является раннее (в возрасте 6-7 месяцев) развитие патологии альцгеймеровского типа, обусловленное ускоренным отложением в мозге бета-амилоидных образований, и нарушение когнитивных функций, оцениваемое в моделях пространственного обучения [17, 18].

Цель нашей работы состояла в изучении ней-ропротекторной и ноотропной активности АФ пептида HLDF-6 на трансгенных мышах В6С3-Tg(APPswe,PSEN1de91)85Dbo - животной модели наследственной БА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез АФ пептида HLDF-6

АФ пептида синтезировали по схеме, описанной

в [12].

Экспериментальные животные

В работе использовали здоровых мышей-самцов линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo мышей дикого типа В6С3 (Tg-) и мышей С57В1/6. Мышей весом 28-35 г в возрасте 8 месяцев получали из питомника лабораторных животных Филиала Института биоорганической химии РАН, Пущино. Питомник имеет международную аккредитацию AAALACi. Система управления качеством производства лабораторных животных в Питомнике сертифицирована на соответствие международным требованиям ИСО 9001:2008. Все исследования на животных выполняли согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства

здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н г. Москва «Об утверждении Правил лабораторной практики»), а также рекомендациям, изложенным в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [13]. Были сформированы четыре группы мышей (по 10 особей в каждой): группа 1 (экспериментальная) - мыши Tg+, которым интраназально вводили ФС в дозе 250 мкг/кг; группа 2 (активный контроль) - мыши Tg+, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 3 (контроль-1) - мыши Tg-, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 4 (контроль-2) - мыши линии С57В1/6, которым интраназально вводили физиологический раствор. Введение дополнительной контрольной группы обусловлено тем, что использовали несколько моделей когнитивных функций. Анализ опубликованных данных показывает, что особенности обучения и памяти у мышей B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo изучали преимущественно в моделях пространственного обучения, тогда как другие когнитивные модели были исследованы недостаточно [18, 19]. Данные, полученные с использованием пространственного обучения, свидетельствуют, что различия между линиями B6C3-Tg+ и B6C3-Tg- наиболее выражены в моделях с высоким уровнем стресса (например, в лабиринте Морриса, но не в лабиринте Барнс) [20]. В то же время различия между B6C3-Tg+ и В6С3-Tg- выявлены преимущественно в моделях с положительным, а не с отрицательным подкреплением [21]. Когнитивные способности мышей B6C3-Tg- также не охарактеризованы в достаточной мере. В связи с этим для оценки обоснованности экспериментальных протоколов мы сочли целесообразным ввести группу дополнительного контроля - мышей линии С57В1 с достаточно высоким уровнем ориентировочно-исследовательской активности и стрессоустой-чивости [22], и с уровнем когнитивных способностей, близким к среднестатистическому [23].

Мы не использовали препарат сравнения, поскольку действие клинически эффективных препаратов (мемантина, донепезила и др.) в этой модели находится на стадии пилотных исследований и не охарактеризовано в достаточной степени [24, 25].

Протокол введения ФС и тестирования когнитивных функций

Животным группы 1 в течение 30 дней через день (всего 15 инъекций) вводили АФ пептида в дозе 250 мкг/кг интраназально в объеме 10 мкл/кг поровну в обе ноздри, а животным групп 2-4 вводили физиологический раствор по такой же схеме. Когнитивные функции оценивали после окончания инъекций

по следующей схеме: 3-5 дни - тест распознавания объекта; 8-10 дни - тест пассивного избегания; 13-17 дни - тестирование в лабиринте Морриса.

Тест распознавания нового объекта

Тест распознавания нового объекта проводили при комнатном освещении в камере из серого пластика размером 35 х 35 х 40 см. Тест включал три пятиминутные сессии, разделенные интервалом 24 ч: 1 -без объектов, для адаптации к установке; 2 - с двумя одинаковыми объектами - металлическими цилиндрами диаметром 3 см и высотой 3 см; 3 - с заменой одного из цилиндров на пластиковый куб с длиной ребра 3 см. Поведение животных регистрировали с помощью цифровой видеокамеры и анализировали, используя компьютерную программу EthoVision XT (Noldus). Оценивали уровень ориентировочно-исследовательской активности при ознакомлении с предметами (сессия 2), а также время исследования «знакомого» и «нового» предметов в сессии 3. Индекс распознавания вычисляли по формуле: (Тн - Тз / Тн + Тз) х 100%, где Тн - время исследования «нового» объекта, а Тз - время исследования «знакомого» объекта во время третьей сессии [26-28].

Тест пассивного избегания

Тест пассивного избегания проводили в установке Columbus Instruments (США). Экспериментальная камера состояла из двух одинаковых отсеков размером 25 х 40 х 25 см с полом из металлических прутьев. Отсеки соединялись между собой отверстием в общей стенке (8 х 8 см), снабженным гильотинной дверью. Один из отсеков был освещен, другой затемнен. В ходе выработки пассивного избегания животное помещали в освещенный отсек и регистрировали время перехода в темную часть камеры (проявление норкового рефлекса). Сразу после того, как все четыре лапы животного оказывались в темной половине камеры, гильотинная дверь опускалась и мышь повергали электрокожному раздражению через прутья пола (0.6 мА, 3 с), после чего ее сразу вынимали из камеры и помещали в домашнюю клетку. Через 48 ч после выработки тестировали выработанный навык. Мышь вновь помещали в светлый отсек, и фиксировали время перехода в темную половину [29-31].

Лабиринт Морриса

Лабиринт Морриса представлял собой круглый бассейн серого цвета диаметром 165 см с высотой стенок 60 см, наполненный водой на высоту 40 см. В центре одного из секторов на 2 см ниже уровня воды располагалась круглая платформа из плексигласа диаметром 9 см. Бассейн находился в комнате с большим количеством обстановочных стимулов (постеры,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

шкафы и т.д.), ключевые стимулы над платформой отсутствовали. В ходе обучения животных опускали в воду с четырех разных точек и фиксировали время достижения платформы. После достижения платформы животное оставляли на ней на 15 с, а затем на 2 мин возвращали в домашнюю клетку. Обучение проводили в течение 5 дней [18].

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Обработку проводили при помощи программного пакета STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модель распознавания нового объекта

Исследование объектов в сеансе экспозиции (таблица) не выявило значимых отличий в уровне ориентировочно-исследовательской активности между контрольными группами Tg- и С57В1/6. В то же время у животных группы активного контроля (Tg+

Показатели ориентировочно-исследовательской активности мышей различных групп в модели распознавания объекта

Группа животных Суммарное время исследования объектов в сеансе экспозиции (2-й день теста), с Значения Z (стан-дартизи-рованный критерий и Манна-Уитни) и значимость различий между группами

Нижний квартиль Медиана Верхний квартиль

1. Tg+ с введением ФС 10.2 13.4 17.4 #Z = 0.22, р = 0.83 *Z = 1.55, р = 0.12

2. Tg+ с введением физ. раствора 7.7 12.3 14.1 *Z = 2.41, р = 0.0156

3. Tg- с введением физ. раствора 15.4 16.0 17.3 &Z = 1.06, р = 0.29

4. С57В1 с введением физ. раствора 10.1 16.6 20.2

# - Статистическая значимость отличий от группы 2.

* - Статистическая значимость отличий от группы 3. & - Статистическая значимость отличий от группы 4.

70

р г; С57В1/6 Ш.: Тд-Тд+

Ш Tg+/HLDF-6

Группы животных

Рис. 1. Показатели долговременной памяти в модели распознавания объекта у мышей различных групп. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. ** - р < 0.01 по сравнению с группой С57В1/6, # - р < 0.05 по сравнению с группой Тд-, $$ - р < 0.01 по сравнению с группой Тд+

а д

о х

е р

е п

I 5

1 " мо

ей

е и н а т с

а р

з о

ой

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

^ С57В1/6

Тд-■Щ Тд+

ГЙ Tg+/HLDF-6

Группы животных

Рис. 2. Показатели обучения в модели пассивного избегания у мышей различных групп. По оси ординат -возрастание времени перехода в темный отсек в сеансе обучения по сравнению с сеансом тестирования (с). Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. * - р < 0.05 по сравнению с группой С57В1/6, $ - р < 0.05 по сравнению с группой Тд+

$

с введением физиологического раствора) исследовательская активность была статистически значимо ниже, чем у мышей группы Tg-. Животные экспериментальной группы не отличались существенно ни от группы активного контроля, ни от мышей Tg-.

Выявлены достаточно высокие значения индекса распознавания объекта, характеризующего декларативную долговременную память, связанную с функциями периринальной коры (участка средней височной извилины), у мышей группы С57В1/6, сравнимые с опубликованными данными [32]. Обнаружено снижение индекса распознавания у животных контрольной группы Tg- по сравнению с мышами группы С57В1/6, а также у мышей из группы активного контроля по сравнению с контрольными мышами Tg-. Введение ФС пептида восстанавливало индекс распознавания до уровня, превышающего значения не только в активном контроле, но и в группе Tg-(рис. 1).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Модель пассивного избегания

Не выявлено статистически значимых межгрупповых различий в длительности латентного периода перехода в темный отсек в день обучения до подачи электрокожного раздражения.

В то же время обнаружены существенные межгрупповые различия по увеличению времени перехода в темный отсек в день тестирования, который характеризует долговременную память (рис. 2).

Сравнение показателей возрастания времени перехода в темный отсек в день тестирования (характеризующего долговременную память) не выявило статистически значимых различий между контрольными группами С57В1/6 и Tg-, а также между активным контролем и группой Tg-. Животные, получавшие ФС, существенно превосходили группу активного контроля и на уровне тенденции (р = 0.062) превосходили группу Tg-.

Пространственная память в лабиринте Морриса

Показателем долговременной памяти в данной модели служит среднее время достижения платформы на 2-5 дни обучения. Результаты представлены на рис. 3.

Тест Манна-Уитни не выявил статистически значимых различий между контрольными группами (С57В1/6 и Tg-) ни в один из дней обучения. Животные Tg+, получавшие физиологический раствор, имели существенный дефицит пространственной памяти в 4-й и 5-й дни обучения по сравнению с группой Tg-. Введение ФС приводило к частичному восстановлению пространственной памяти у мышей Tg+. На 4-й день обучения уровень выполнения навыка у животных этой группы занимал промежуточное положение между животными группы Tg+, получавшими физиологический раствор, и животными Tg-. В 5-й день обучения мыши Tg+, получавшие ФС, выполняли задачу существенно лучше, чем

72 | АСТА КАТиИАЕ | ТОМ 9 № 3 (34) 2017

и 60

12 3 4 5 6

Дни обучения

Рис. 3. Динамика обучения мышей в водном лабиринте Морриса. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. ** - р < 0.01 по сравнению с группой Тд-, $$ - р < 0.01 по сравнению с группой Тд+

группа Tg+ с введением физиологического раствора и не отличались значимо от контрольной группы Tg-.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что в условиях интраназальной доставки ФС на основе АФ пептида HLDF-6 в дозе 250 мкг/кг эффективно стимулирует выполнение когнитивных задач трансгенными мышами В6С3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo во всех использованных моделях. Следует отметить, что результаты, полученные в дополнительной контрольной группе мышей С57В1/6, подтверждают валидность использованных моделей когнитивных функций. При этом в модели обстановочного пространственного обучения (лабиринт Морриса) динамика обучения контрольной группы Tg- не отличалась от динамики у мышей С57В1/6. В группе активного контроля выявлено снижение динамики обучения по сравнению с Tg-, а введение ФС оказывало выраженный нейро-протекторный эффект с восстановлением показателей обучения до контрольного уровня.

В модели распознавания объекта отмечено существенное снижение показателей обучения в группе Tg- относительно С57В1/6 и (несколько менее выраженное) в группе активного контроля относительно Tg-; при этом введение ФС приводило к повышению показателя обучения до уровня, превосходящего Tg-.

В модели пассивного избегания также наблюдалось снижение показателей обучения в группе Tg-относительно С57В1/6. Однако, в отличие от других

тестов, не обнаружено ухудшения обучения животных группы активного контроля в сравнении с Tg-. Введение ФС так же, как и в других моделях, стимулировало долговременную память у трансгенных мышей до уровня, даже несколько превышающего контрольный.

Совокупность полученных данных свидетельствует, что ФС на основе АФ пептида HLDF-6 обладает не только нейропротекторными свойствами, но и но-отропным эффектом, т.е. стимулирует когнитивные функции вне зависимости от наличия нейродегене-ративного процесса.

Результаты нашей работы полностью согласуются с данными, полученными на животных моделях БА - фрагмент РА (25-35) вводили в базальное ги-гантоклеточное ядро Мейнерта, фрагмент РА и ибо-теновую кислоту совместно вводили в гиппокамп [12]. По совокупности полученных результатов в качестве объекта дальнейших доклинических исследований мы выбрали ФС на основе АФ пептида HLDF-6, за эффективную терапевтическую дозу приняли 250 мкг/кг и интраназальное введение в качестве способа доставки.

Ранее методом радиорецепторного анализа мы провели изучение участия серотониновых, ГАМК и NMDA-глутаматных рецепторов мозга в ноотроп-ном действии АФ пептида HLDF-6. Эти рецепторы участвуют в патогенезе различных неврологических расстройств и хронических нейродегенеративных заболеваний [33, 34]. Было изучено влияние АФ пептида HLDF-6 на характеристики связывания радиоактивно меченных лигандов с NMDA-рецепторами на мембранах гиппокампа, ГАМК-А и серотонино-выми 5НТ2А-рецепторами на мембранах префрон-тальной коры мышей BALB/c. Показано, что только в случае NMDA-глутаматных рецепторов субхроническое введение пептида в гиппокамп мышей приводит к возрастанию количества связавшегося лиганда ^-3Н МК-801) [11], что отражает плотность соответствующих рецепторов. Таким образом, под воздействием АФ пептида HLDF-6 происходит восстановление до нормы количества NMDA-рецепторов, что вызывает улучшение когнитивного поведения. Субхроническое 5-разовое введение АФ пептида HLDF-6 не влияло на плотность ГАМК-рецепторов и никотиновых холинорецепторов, но сопровождалось снижением плотности 5-НТ2-серотониновых рецепторов [35]. Сделан вывод, что механизм формирования нейропротекторной активности пептида Thr-Gly-Glu-Asn-ffis-Arg-NH2 может включать воздействие на глутамат- и серотонинергическую системы.

Пептид HLDF-6 является фрагментом природного фактора дифференцировки HLDF-6, присут-

ТОМ 9 № 3 (34) 2017 | АСТА ЫАТиИАЕ | 73

ствующего в крови и ЦНС млекопитающих и человека. Проведенные нами доклинические испытания лекарственного средства на основе АФ пептида HLDF-6 показали, что оно хорошо растворимо, легко метаболизируется, не обладает иммуногенностью и токсичностью, характеризуется высокой эффективностью специфической активности, безопасно в дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую. Результаты доклинических исследований позволяют надеяться на успешное проведение клинических исследований препарата. Можно рассчитывать,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Prince M., Albanese E., Guerchet M., Prina M. // World Alzheimer Report. 2014. Website www.alz.co.uk/worldreport.

2. Feigin V.L., Forouzanfar M.H., Krishnamurthi R., Men-sah G.A., Connor M., Bennett D.A., Moran A.E., Sacco R.L, Anderson L., Truelsen T., et al. // Lancet. 2010. V. 383. № 9913. P. 245-255.

3. Kostanyan I.A., Astapova M.V., Starovoytova E.V., Dranitsyna S.M., Lipkin V.M. // FEBS Lett. 1994. V. 356. № 2-3. P. 327-329.

4. Костанян И.А., Астапова М.В., Наволоцкая Е.В., Лепихова Т.Н., Драницина С.М., Телегин Г.Б., Родионов И.Л., Байдакова Л.К., Золотарев Ю.А., Молотковская И.М., Липкин В.М. // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. № 7. С. 505-511.

5. Сахарова Н.Ю., Костанян И.А., Лепихова Т.Н., Лепихов К.А., Наволоцкая Е.В., Малашенко А.М., Томбран-Тинк Дж., Липкин В.М., Чайлахян Л.М. // Докл. АН. 2000. Т. 372. № 2. С. 260-263.

6. Rzhevsky D.I., Zhokhov S.S., Babichenko I.I., Goleva A.V., Gon-charenko E.N., Baizhumanov A.A., Murashev A.N., Lipkin V.M., Kostanyan I.A. // Regul. Peptides. 2005. V. 127. № 1. P. 111-121.

7. Костанян И.А., Жохов С.С., Сторожева З.И., Прошин А.Т., Сурина Е.А., Бабиченко И.И., Шерстнев В.В., Липкин В.М. // Биоорган. химия. 2006. Т. 32. № 4. С. 399-407.

8. Sewell R.D., Gruden M.A., Pache D.M., Storozheva Z.I., Kostanyan I.A., Proshin A.T., Yurashev V.V., Sherstnev V.V. // J. Psychopharmacol. 2005. V. 19. № 6. P. 602-608.

9. Сторожева З.И., Прошин А.Т., Жохов С.С., Шерстнев В.В., Родионов И.Л., Липкин В.М., Костанян И.А. // Бюл. эксп. биол. мед. 2006. Т. 141. № 3. С. 292-296.

10. Костанян И.А., Сторожева З.И., Семенова Н.А., Липкин

B.М. // Докл. АН. 2009. Т. 428. № 4. С. 565-569.

11. Золотарев Ю.А., Ковалёв Г.И., Дадаян А.К., Козик В.С., Кондрахин Е.А., Васильева Е.В., Липкин В.М. // Нейродеге-неративные заболевания: от генома до целостного организма / Под ред. Угрюмова М.В. М.: Научный мир, 2014. Т. 2.

C. 763-777.

12. Bogachouk A.P., Storozheva Z.I., Solovjeva O.A., Sherstnev V.V., Zolotarev Yu.A., Azev V.N., Rodionov I.L., Surina E.A., Lipkin V.M. // J. Psychopharmacol. 2016. V. 30. № 1. P. 78-92.

13. Бунятян Н.Д., Миронов А.Н., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлева М.М., Лепахин В.К., Коробов Н.В., Меркулов В.А., Орехов С.Н., Сакаева И.В. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012. 942 с.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

14. Goate A., Chartier-Harlin M.C., Mullan M., Brown J., Crawford F., Fidani L., Giuffra L., Haynes A., Irving N., James L., et al. // Nature. 1991. V. 349. № 6311. P. 704-706.

15. Selkoe D.J. // Nature. 1999. V. 399. (6738 suppl.). P. A23-A31.

16. Jankowsky J.L., Slunt H.H., Ratovitski T., Jenkins N.A., Copeland N.G., Borchelt D.R. // Biomol. Eng. 2001. V. 17. № 6. P. 157-165.

что в этом случае препарат найдет широкое применение в терапии БА.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 14N08.11.0002) и программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП ИБХ, поддержанного Минобрнауки России, идентификатор соглашения RFMEFI62117X0018.

17. Su D., Zhao Y., Xu H., Wang B., Chen X., Chen J., Wang X. // PLoS One. 2012. V. 7. № 11. e50172.

18. McKenna J.T., Christie M.A., Jeffrey B.A., McCo J.G., Lee E., Connolly N.P., Ward C.P., Strecker R.E. // Arch. Ital. Biol. 2012. V. 150. № 1. P. 5-14.

19. Zhong Z., Yang L., Wu X., Huang W., Yan J., Liu S., Sun X., Liu K., Lin H., Kuang S., Tang X. // J. Mol. Neurosci. 2014. V. 53. № 3. Р. 370-376.

20. Bennett L., Kersaitis C., Macaulay S.L., Münch G., Niedermayer G., Nigro J., Payne M., Sheean P., Vallotton P., Zabaras D., Bird M. // PLoS One. 2013. V. 8. № 10. e76362.

21. Semina I.I., Baichurina A.Z., Makarova E.A., Leushina A.V., Kazakevich Zh.V., Gabdrakhmanova M.R., Mukhamed'yarov M.A., Zefirov A.L. // Bull. Exp. Biol. Med. 2015. V. 158. № 5.

Р. 621-623.

22. Ковалёв Г.И., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М. // Нейрохи-мия. 2013. Т. 30. № 2. C. 128-134.

23. Brooks S.P., Pask T., Jones L., Dunnett S.B. // Genes Brain Behav. 2005. V. 4. № 5. Р. 307-317.

24. Neumeister K.L., Riepe M.W. // J. Alzheimers Dis. 2012. V. 30. № 2. P. 245-251.

25. Nagakura A., Shitaka Y., Yarimizu J., Matsuoka N. // Eur. J. Pharmacol. 2013. V. 703. № 1-3. P. 53-61.

26. Rutten K., Reneerkens O.A., Hamers H., Sik A., McGregor I.S., Prickaerts J., Blokland A. // J. Neurosci. Meth. 2008. V. 171. № 1. P. 72-77.

27. Nimmrich V., Szabo R., Nyakas C., Granic I., Reymann K.G., Schröder U.H., Gross G., Schoemaker H., Wicke K., Möller

A., Luiten P. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008. V. 327. № 2. P. 343-352.

28. Zhang R., Xue G., Wang S., Zhang L., Shi C., Xie X. // J. Alzheimers Dis. 2012. V. 31. № 2. P. 801-812.

29. Harkany T., O'Mahony S., Kelly J.P., Soos K., Töro I., Penke

B., Luiten P.G., Nyakas C., Gulya K., Leonard B.E. // Behav. Brain Res. 1998. V. 90. № 2. P. 133-145.

30. Xu Z., Zheng H., Law S.L., Dong So D., Han Y., Xue H. // J. Pept. Sci. 2006. V. 12. № 1. P. 72-78.

31. Feng Z., Chang Y., Cheng Y., Zhang B.L., Qu Z.W., Qin C., Zhang J.T. // J. Pineal. Res. 2004. V. 37. № 2. P. 129-136.

32. Tucker K.R., Godbey S.J., Thiebaud N., Fadool D.A. // Physiol. Behav. 2012. V. 107. № 3. Р. 3424-3432.

33. Walker D.L., Davis M. // Pharmacol. Biochem. Behav. 2002. V. 71 № 3. P. 379-392.

34. Zhong Z., Yang L., Wu X., Yuang W., Yan J., Liu S., Sun X., Liu K, Lin H., Kuang S., Tang X. // J. Mol. Neurosci. 2014. V. 53. № 3. P. 370-376.

35. Zolotarev Yu.A., Kovalev G.I., Kost N.V., Voevodina M.E., Sokolov O.Y., Dadayan A.K., Kondrakhin E.A., Vasilev E.V., Bogachuk A.P., Azev V.N., et al. // J. Psychopharmacol. 2016. V. 30. № 9. P. 922-935.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.