CC BY
16ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЁНКИ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К БИОЦИДАМ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА PSEUDOMONADACEAE
Н. Ирсимбетова
Южно-Казахстанская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Республики Казахстан, г. Шымкент, Казахстан
Резюме: Изучена in vitro активность биоцидов (этанол, хлоргексидин, йод и бензалконий) в отношении планктонных и образующих биоплёнки псевдомонад. Установлено, что псевдомонады оказываются защищены биоплёнкой от воздействия биоцидов, в том числе и от тех, к которым чувствительны планктонные штаммы тех же видов.
Ключевые слова: псевдомонада, дезинфектант, антисептик, биопленка.
Pseudomonadaceae туркумунун екулдерунун биоциддерге карата биоплёнкаларды пайда кылуусу жана резистеттуулугу.
Н. Ирсимбетова
Кыргыз мамлекеттик И.К. Ахунбаев атындагы медициналык академиясы, Бишкек ш., Кыргыз Республикасы Корутунду: Планктондук жана биоплёнкаларды пайда кылуучу псевдомонадка карата биоциддердин (этанол, хлоргексидин, йод жана бензалконий) invitro активдYYЛYГY изилденген. Псевдомонаддар биоциддердин таасиринен биоплёнкалар менен сакталат экен, анын ичинде планктондук штаммдары сезгич келген тYрлeрYнeн да сакталары аныкталды.
Негизги сездер: псевдомонада, дезинфектант, антисептик, биопленка.
Biofilm formation and resistence to biocides in representatives of Pseudomonadaceae
N. Irsimbetova
South-Kazakhstan State Pharmaceutical Academy of the Ministry of Health of the Republic of
Kazakhstan, c. Shymkent, Kazakhstan Abstract. In vitro activity of biocides (ethanol, chlorhexidin, iodine and benzalconium) concerning planktonic and forming biofilm pseudomonads was studied. It was established that pseudomonads are protected with a biofilm from the action of biocides including those, to which planktonic strains of the same species are sensitive. Key words: pseudomonad, disinfectant, antiseptics, biofilm.
Представители семейства Pseudomonadaceae широко распространены во внешней среде, как естественной, так и артифициальной, особенно в водных источниках. Ряд предствителей семейства (P. aeruginosa, P. cepacia, P. putida, P. stutzeri, X. maltophylia) с высокой частотой высеваются с предметов больничной обстановки и играют важную роль как возбудители нозокомиальных инфекций [1, 2]. Псевдомонады - грамотрицательные, не ферментирующие глюкозу, оксидазоположитель-ные бактерии, обусловливающие как внутриболь-ничные, так и экстрагоспитальные инфекции. Данная группа бактерий широко распространена на территории Казахстана, особенно в водной среде, в том числе на предметах больничной обстановки, в растворах лекарственных препаратов и даже дезинфектантов [1, 3]. Способность псевдомонад образовывать биоплёнки значительно повышает их резистентность к биоцидам и антибактериальным препаратам [3, 4, 5].
В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение способности к образованию биоплёнки у штаммов P. aeruginosa и P. cepacia и её влияние на чувствительность изолятов к биоцидам (дезинфектантам и антисептикам).
Материалы и методы Биоциды
Выбор дезинфектантов и антисептиков был обусловлен, прежде всего, практикой их применения для обеззараживания различных биотических и абиотических объектов в различных отделениях наблюдаемого стационара, Военного клинического госпиталя Министерства Обороны Республики Казахстан (ВКГ МО РК). В исследование были включены 70% этанол, 0,1% раствор хлоргекси-дина биглюконата, 5% спиртовой раствор йода (йодная настойка) и 0,1% раствор бензалкония хлорида (коммерческое название - «Рокал-10»), полученные из аптеки ВКГ МО РК. Штаммы псевдомонад В исследование были включены клинические изоляты, полученные от больных терапевтического и хирургического профиля, находившихся на стационарном лечении в ВКГ МО РК, всего 435 культур, в том числе 280 — представители вида P. cepacia (палочка гниения лука) и 155 — вида P. aeruginosa (синегнойная палочка).
Оценка выживаемости псевдомонад после воздействия биоцидов осуществлялась в суспензионном эксперименте. Тестируемый штамм
ежемесячный научно-практическии медицинским журнал
120
I 1 MIH
■ 3 мин 5 MIH
Эт»*оп
Хпоргексидим Иодная кастайга Г'клп'О
рис.1. Доля убитых планктонных микробных клеток P. cepacia при экспозиции с биоцидами
(суспензионный метод)
рис.2. Доля убитых микробных клеток P. cepacia, образующих биоплёнку, при экспозиции с биоцидами
(суспензионный метод)
100
40
IUI
13 м«
5 мин
Этанол
Хлоргаксидин Li ад на настойка Рокал-10
рис.3. Доля убитых планктонных микробных клеток P. aeruginosa при экспозиции с биоцидами
(суспензионный метод)
рис.4. Доля убитых микробных клеток P. aeruginosa, образующих биоплёнку, при экспозиции с
биоцидами (суспензионный метод)
выращивался при температуре +36eC в течение 24 часов, после чего приготовлялась бактериальная суспензия.
Тестируемые биоциды разливались в верхние лунки 96-луночных пластикового планшета, а в три последние разливалась питательная среда. В лунки к биоцидам добаляли 10 мкл / лунку бактериальной суспензии и через 1, 3 и 5 минут переносили по 10 мкл из каждой лунки в ряды планшета с интак-тной питательной средой, после чего инкубировали при температуре +36eC в течение 24 часов для подтверждения роста псевдомонад.
Количественно о росте псевдомонад в присутствии биоцидов судили по образованию колониеоб-разующих единиц (КОЕ) на твёрдой питательной среде.
КОЕ определяли, снимая материал со дна 10 лунок пластиковых планшетов, который объединяли в один пул и высевали на плотные питательные среды после двукратного разведения. Контролем служил интактный пул, получаемых из 10 лунок без добавления биоцидов.
результаты исследования и их обсуждение
Все взятые в разработку штаммы псевдомонад характеризовались продукцией фосфолипазы (эпидемиологический маркёр вирулентности штамма) и полиантибиотикорезистентностью.
В популяции P. cepacia 238 штаммов (85,00%) характеризовались наличием признака образования биоплёнки, оптическая плотность которой колебалась от 1,25 до 1,57 бел. В популяции преобладали штаммы с высокими и средними значениями оптической плотности биоплёнок: изолятов с оптической плотностью биоплёнок 1,57-1,40 бел было 141 (50,36%), а с плотностью 1,39-1,20 бел
— 97 (34,64%).
Средняя оптическая плотность биоплёнки для популяции P. cepacia составила 1,42±0,06 бел.
В популяции P. aeruginosa 132 штамма (85,16%) характеризовались наличием признака образования биоплёнки, оптическая плотность которой колебалась от 1,21 до 1,45 бел. В популяции преобладали штаммы со средними значениями оптической плотности биоплёнок: изолятов с оптической плотностью биоплёнок 1,45-1,40 бел было 34 (21,94%), а с плотностью 1,39-1,20 бел
— 98 (63,23%).
Средняя оптическая плотность биоплёнки для популяции P. aeruginosa составила 1,36±0,05 бел.
В целом можно заключить, что штаммы псевдомонад, выделенные с предметов внутрибольнич-ной обстановки обладают высокими адаптивными способностями, выражающимися, в частности, в высокой способности образовывать биоплёнки. Данная способность более выражена у представителей вида P. cepacia (палочки гниения лука), нежели у синегнойной палочки, P. aeruginosa (p <
0,001).
Результаты бактерицидного действия исследуемых биоцидов в отношении планктонных и образующих биоплёнку изолятов P. cepacia представлены на рисунках 1 и 2.
Результаты бактерицидного действия исследуемых биоцидов в отношении планктонных и образующих биоплёнку изолятов P. aeruginosa представлены на рисунках 3 и 4.
Все исследованные в суспензионном эксперименте биоциды показали достаточную активность в отношении планктонных штаммов псевдомонад: уже после 1-минутной экспозиции наблюдалась 100%-ная гибель как P. cepacia, так и P. aeruginosa.
Несмотря на различную выраженность способности к образованию биоплёнки у штаммов P. cepacia и P. aeruginosa, чувствительность последних к биоцидам не носила статистически значимых различий (p = 0,99; p = 0,49; p = 0,98; p = 0,57 для 70% этанола, 0,1% хлоргексидина, 5% йодной настойки и Рокала-10, соответственно).
Ни один из изученных биоцидов не приводил к 100%-ной гибели образующих биоплёнку штаммов P. cepacia даже после 5-минутной экспозиции.
Максимальный бактерицидный эффект в отношении обоих изученных видов пседомонад показали бензалкония хлорид (Рокал-10) и йодная настойка, а минимальный — этиловый спирт и хлоргексидин.
Как показали проведённые исследования, преобладающей формой существования псевдомонад — ведущей группы в развитии нозокомиальных инфекций — является образование конгломератов, объединённых биоплёнкой. Псевдомонады, конта-минирующие биотические и абиотические объекты внутрибольничной среды, оказываются защищены биоплёнкой от воздействия биоцидов, в том числе и от тех, к которым чувствительны планктонные штаммы тех же видов.
литература:
1. Китаров Б.А. Инфекционный контроль в профилактике нозокомиальных инфекций: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Алматы, 2003. - 28 с.
2. Yin X.-Y., Mikamo H., Tamaya T. Nosocomial infectious potency of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from obstetric and gynecologic infections // J. Infect. Chemother. - 2003. - Vol. 9. - P. 97-100.
3. Bacterial biofilms /Ed. Tony Romero. - Springer-Verlag: Berlin; Heidelberg, 2008. - 296p.
4. Moskowitz S.M., Foster J.M., Emerson J., Burns J.L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - P. 1915-1922.
5. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. - 1999. - Vol.284. - P.1318-1322.
