CC BY
22
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
1D. Leight E.R., Sugden B. Establishment of an oriP Replicon Is Dependent upon an Infrequent, Epigenetic Event . Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 4149-61.
11. Yates J.L., Guan N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 1991; 65: 483-8.
12. Liao J., Wu Z., Wang Y. et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem tiPS] cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Res. 2008; 18: 600—3.
13. Evan G.I., Wyllie A.H., Gilbert C.S. et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell 1992; 69: 119—28.
14. Aasen T., Raya A., Barrero M.J. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1276-84.
15. Shi Y., Desponts C., Do J.T. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by 0ct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. Cell Stem Cell 2008; 3: 568-74.
Подготовила А.С. Гоигорян
По материалам: Yu J„ Hu КSmuga-Ott К. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector
and transgene sequences. Science 2009; 324 (5928): 797-801
Обнаружены стволовые клетки в яичниках у мышей
До недавнего времени считалось, что образование овогоний в яичниках млекопитающих прекращается до рождения [1—5], однако еще в 2004 г. было показано, что у новорожденных и взрослых мышей яичники способны к восстановлению численности овогоний после экстремальных воздействий [6]. Впоследствии появились предположения о том, что источником этой регенеративной способности могут быть клетки костного мозга и периферической крови, мигрирующие в яичник [7]. Но эти предположения были опровергнуты [8]. Исследователи до сих пор не утвердились во мнении относительно того, какие именно клетки ответственны за восстановление численности фолликулов, и существуют ли в яичниках камбиальные элементы, способные восстанавливать популяцию ОВОГОНИЙ [6, 8—11].
Научная группа К. Zou из Шанхайского Университета (Китай) провела исследование, подтвердившее, что в яичниках мышей, и, возможно, других млекопитающих, присутствуют стволовые клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в функциональные овоциты. С помощью иммуногистохимического анализа было показано, что в тканях яичников новорожденных и взрослых мышей присутствуют клетки, положительные по маркеру MVH (mouse vasa homologue), который экспрессируется исключительно в клетках зародышевого пути. По крайней мере, часть этих клеток постоянно и активно пролиферировала: через 1 час после введения пятидневным и взрослым животным маркера пролиферации 5’-бромдезоксиуридина (BrdU) из эпителия их яичников были выделены клетки, несущие двойную метку - BrdU и MVH.
Используя магнитную клеточную сепарацию (MACS), исследователи получили из яичников новорожденных и взрослых мышей MVH+ клетки (при этом количество таких клеток в яичнике новорожденной мыши составило от 200 до 300, а в яичнике взрослого животного — от 50 до 100 клеток). Это были крупные клетки со сферическим ядром диаметром от 12 до 20 мкм, содержащим большое количество нуклеоплазмы, морфологически напоминающие сперматогонии типа А [12]. Чтобы определить, содержит ли популяция MVH+ клеток in vitro делящиеся клетки, в среду их культивирования был добавлен BrdU. Оказалось, что BrdU-позитивные клетки действительно присутствуют. В течение 7 пассажей количество клеток в культуре существенно увеличивалось, при этом формировались компактные колонии.
Морфология клеток и их пролиферативный потенциал никак не изменились по прошествии 25 пассажей. Клетки культивировали на фидере из инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов в присутствии рекомбинантных факторов LIF, трансферрина, путрес-цина, EGF, GDNF и bFGF.
Анализ экспрессии генома, иммуногистохимический и ПЦР -анализ показали, что в выделенных клетках активно экспрессируются гены и продуцируются белки Dazl (специфический для первичных половых клеток РНК-связывающий белок [13]), 0ct4 (характерный для первичных половых клеток транскрипционный фактор [14]) и MVH, но в то же время в них не присутствуют транскрипты и продукты генов дифференцированных половых фолликулов, такие как ZP3 (ген белка блестящей оболочки яйцеклетки 3). Помимо этого, в клетках был высок уровень активности теломеразы, что характерно для стволовых клеток [15]. После культивирования в течение года у 65-80% из них был диплоидный кари-отип (какой кариотип имели остальные клетки, авторы не указывают). В описанных клетках была зарегистрирована активность щелочной фосфатазы — несколько меньшая, чем характерно для эмбриональных стволовых клеток.
Помимо подробной характеристики in vitro, авторы оценили функции данных клеток in vivo. Клетки, транс-фецированные геном флуоресцентного белка GFP, были трансплантированы в яичники самок мышей, предварительно стерилизованных с помощью химиотерапевтических препаратов бусульфана и циклофосфамида, вызывающих гибель клеток зародышевого пути, находящихся на премейотическом и постмейотическом этапах клеточного цикла [7, 16]. Два месяца спустя после трансплантации в яичниках животных с помощью гистологического анализа и анализа флуоресценции было показано присутствие овоцитов на разных стадиях развития, экспрессирующих GFP. У животных из группы контроля яичники после стерилизации не восстанавливались.
Трансплантация стволовых клеток яичников стерилизованным при помощи химиотерапии самкам мышей в 82% случаев в течение 75-110 сут. восстанавливала их фертильность. Потомство, полученное от этих мышей, как показали авторы, не имело никаких аномалий и также было фертильно. В геномной ДНК 29 из 108 новорожденных мышат первого поколения обнаруживался трансген GFP, что было продемонстрировано
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
21
ПЦР-анализом и Саузерн-блот гибридизацией. В ядерной ДНК мышей второго поколения тоже присутствовал трансген GFP, что доказывало их происхождение от трансплантированных стволовых клеток яичников.
Чтобы выяснить, являются ли описанные клетки плю-ри- или мультипотентными, и не способны ли они провоцировать онкогенез, исследователи инъецировали суспензию этих клеток под кожу иммунодефицитным мышам. В течение 8 недель наблюдения ни в одном случае не было замечено формирования опухолей.
Стволовые клетки яичника, по заключению авторов работы, имеют много общего со стволовыми спермато-гониальными клетками, находящимися в семенниках
мужских особей. Однако количество стволовых клеток в яичнике на порядки меньше, нежели количество спер-матогониальных клеток в семеннике, и они существенно медленнее пролиферируют.
Результаты этой работы могут найти клиническое применение для сохранения репродуктивной функции, например, для пациенток, которым показана химиотерапия. Есть высокая вероятность того, что у человека в яичниках также сохраняются стволовые клетки, которые возможно выделить перед проведением химиотерапии, культивировать in vitro, а затем трансплантировать после проведения курса химиотерапии, восстановив тем самым функцию органа.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Zuckerman S. The number of oocytes in the mature ovary. Recent Prog. Horm. Res. 1951; 6: 63-108.
2. Borum K. Oogenesis in the mouse. A study of meiotic prophase. Exp. Cell Res. 1961; 24: 495—507.
3. Peters H. Migration of gonocytes into the mammalian gonad and their differentiation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 1970; 259: 91-101.
4. McLaren A. Meiosis and differentiation of mouse germ cells. Symp. Soc. Exp. Biol. 1984; 38: 7-23.
5. Anderson L.D., Hirshfield A.N. An overview of follicular development in the ovary: from embryo to the fertilized ovum in vitro. Md. Med. J. 1992; 41: 614-20.
6. Johnson J., Canning J., Kaneko T. et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature 2004; 428: 145-50.
7. Johnson J.J. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood. Cell 2005; 122: 303-15.
8. Eggan K., Jurga S., Gosden R., Min I.M., Wagers A.J. Ovulated oocytes in adult mice derived from non-circulating germ cells. Nature 2006; 441: 1109-14.
9. Telfer E.E. On regenerating the ovary and generating controversy. Cell 2005; 122: 821-2.
10. Honda A. Isolation, characterization, and in vitro and in vivo differentiation of putative thecal stem cells. PNAS 2007; 101: 16489-94.
11. Gosden R. G. Germline stem cells in the postnatal ovary: is the ovary more like a testis? Hum. Reprod. Update 2004; 10: 193-5.
12. Feng L. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line. Science 2002; 297: 392-5.
13. Ruggiu M. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis. Nature 1997; 389: 73-7.
14. Scholer H.R., Ruppert S., Suzuki N. et al. New type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 1990; 344: 435-9.
28. Ravindranath N.. Dalai R., Solomon B. et al. Loss of. telomerase activity during male germ cell differentiation. Endocrinology 1997; 138: 4026-9.
29. Shiromizu K., Thorgeirsson S.S., Mattison D.R. Effect of cyclophosphamide on oocyte and follicle number in Sprague-Dawley rats, C57BL/6N and DBA/2N mice. Pediatr. Pharmacol. 1984; 4: 213-21.
Подготовила А.С. Гоигорян
По материалам: Zou К., Yuan Z„ Yang Z. et al. Production of offspring from a germline stem cell line derived
from neonatal ovaries. Nature Cell Biology. Published online April 2009
Разработан метод получения iPS-клеток с помощью рекомбинантных белков
В 2006 г. было показано, что у соматических клеток мыши может быть индуцировано плюрипотентное состояние с помощью ретровирусной трансдукции генов четырех факторов: 0й4, К1!4, Бох2 и 1Мапод [1]. Годом позже аналогичные результаты были получены для клеток человека [2, 3]. Это стало не только настоящим прорывом в области генной инженерии, но и открыло совершенно новые перспективы для клеточной терапии. Был разработан надежный и воспроизводимый метод для получения линий аутогенных плюрипотентных стволовых клеток, которые могут применяться для клеточной терапии разных заболеваний. В то же время, внесение в клетку чужеродного генетического материала ретровирусов может быть потенциально опасным, так как сопровождается высоким риском злокачественной трансформации при трансплантации производных таких плюрипотентных клеток в организм реципиента [4].
К настоящему времени разработано несколько стратегий получения ¡РБ-клеток, не требующих встраивания в их геном чужеродной ДНК. Это внесение в сомати-
ческую клетку необходимых генов в составе векторов на основе аденовирусов, не интегрирующихся в геном [5]; применение плазмид, которые спонтанно удаляются из клеток после их перепрограммирования и многократного деления [6]; применение в качестве носителя генов плюрипотентности транспозона PiggyBac, который также спонтанно удаляется из клеток после их перепрограммирования [7, 8]; внесение в клетку генов плюрипотентности в составе интегрирующихся в геном вирусов, которые затем удаляются из хромосом при помощи рекомбиназы Сге [9]; использование не интегрирующихся в геном плазмидных векторов на основе ядерного антигена-1 вируса Эпштейна — Барр [10]. Тем не менее, ни один из перечисленных методов не исключает необходимости внесения в клетку чужеродного генетического материала, пусть и не встраиваемого непосредственно в ядерную ДНК.
В апреле 2009 г. в журнале Cell Stem Cell появилось сообщение о работе научной группы Н. Zhou, которой был разработан новый подход к получению iPS-клеток.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009
