ОБНАРУЖЕНИЕ НОВОГО АДДУКТА RVX С БЕЛКАМИ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ТАНДЕМНЫМ МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ В РЕЖИМЕ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.544.5.068.7+543.51:547.1:615.099

ОБНАРУЖЕНИЕ НОВОГО АДДУКТА RVX С БЕЛКАМИ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ТАНДЕМНЫМ МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ

ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ В РЕЖИМЕ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Д.С. Прокофьева, Н.В. Криворотова, Н.В. Гончаров

ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профттаяогии

и экологии человека.» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п Кузьмоловский

В статье описаны современные представления о превращениях ФОВ V-типа in vitro и in vivo. В опытах in vitro выявлен новый ковалентный аддукт RVX с белками плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием в режиме высокого разрешения. Получены данные для оценки вклада альбумина в процесс детоксикации RVX.

Ключевые слова: RVX, альбумин, плазма, связывание, аддукт.

Введение. Фосфорорганические отравляющие вещества V-ти-па являются наиболее токсичными веществами нервно-паралитического действия. Гидролиз агентов V-типа в водных растворах изучен достаточно подробно [1,2]. В отличие от агентов G-типа он идет по двум направлениям. В растворе при значении рН от 6 до 10 гидролиз российского VX (RVX) проходит преимущественно путем разрыва связи между кислородом и фосфором с образованием изобутилового спирта и S-(2-диэтиламиноэ-тил)метилтиофосфоната, который является гомологом EA-2192, токсичного производного VX. При сильнощелочных или сильнокислых значениях рН раствора гидролиз идет путем разрыва связи между фосфором и серой. Продуктами реакции в этом случае являются К,Ы-диэтиламиноэтантиол и изобутилметил-фосфоновая кислота (иБМФК), которая в свою очередь медленно гидролизуется с образованием изобутилового спирта и ме-тилфосфоновой кислоты. До недавнего времени исследованию деградации агентов V-типа в организме или в опытах in vitro, максимально приближенных к условиям in vivo, препятствовало отсутствие аналитического оборудования, обладающего достаточной чувствительностью для оценки и количественного анализа метаболических превращений этих ФОВ в сложных белковых смесях. Известна только одна публикация [3], посвященная идентификации метаболитов VX в сыворотке крови пострадавшего, в которой были обозначены метаболические пути превращения VX. Проведенный анализ позволил выявить в сыворотке

крови этилметилфосфоновую кислоту (ЭМФК), а также метил-тиоэфир 2-(диизопропиламино)этантиола, в отличие от самого тиола, который не был обнаружен ввиду его высокой реакционной способности. Известно, что тиолы в организме человека быстро метилируются при участии тиольной S-метилтрансферазы [4], поэтому авторы исследования [3] заключили, что в организме пострадавшего VX гидролизовался с образованием ЭМФК и тиола, который был метилирован вышеупомянутым ферментом. Однако значение рН большинства биологических жидкостей организма составляет 7,2-7,4. Следовательно, можно предположить, что гидролиз агентов V-типа должен осуществляться не только путем разрыва P-S связи, но и путем разрыва P-O связи. В 2011 году впервые было показано образование EA-2192 в опытах in vivo и in vitro [5].

Попадая в организм животных или человека, ФОВ начинают быстро гидролизоваться, поэтому проведение анализа проб крови на присутствие в них интактного агента возможно только в случае отбора пробы сразу после отравления высокими дозами ФОВ. Более полезным оказался анализ биопроб на присутствие в них алкилметилфосфоновых кислот (АМФК), являющихся одними из основных продуктов гидролиза ФОВ [6,7]. Помимо АМ-ФК, долгоживущими (био)химическими маркерами считаются ковалентные аддукты, которые образуют ФОВ с белками крови [6]. Время полужизни маркера в этом случае зависит не только от количества поступившего в организм ФОВ, но и от метаболиче-

Прокофьева Дарья Станиславовна (Prokofieva Daria Stanislavovna), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, Ленинградская область, Всеволожский район, гп. Кузьмоловский, darija-p1@yandex.m

Криворотова Надежда Викторовна (Krivorotova Nadezhda Viktorovna), научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, Ленинградская область, Всеволожский район, гп. Кузьмоловский, nadezhdak@yandex.ru;

Гончаров Николай Васильевич (GoncharovNikolay Vasilievich), доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, Ленинградская область, Всеволожский район, гп. Кузьмоловский, nvgoncharov@mail.ru.

ской стабильности аддукта и времени жизни белка в организме [7]. Все обнаруживаемые на сегодняшний день аддукты ФОВ с белками представляют собой производные соответствующей ал-килметилфосфоновой кислоты и сериновых и/или тирозиновых аминокислот белка [8,9]. В случае большинства агентов G-типа такие аддукты являются единственно возможными. В отличие от них, ФОВ V-типа распадаются с образованием двух близких по молекулярной массе частей, в частности тиола и АМФК. Следовательно, в случае отравления RVX необходимо искать не только аддукты изоБМФК с сериновыми и тирозиновыми остатками, но и аддукт тиола с цистеиновыми остатками. Как диагностический показатель, аддукт тиола с цистеином по специфичности будет уступать аддуктам изоБМФК с тирозиновым остатком альбумина или сериновым остатком холинэстераз, однако по чувствительности он должен значительно превосходить эти аддукты ввиду большой реакционной способности тиола по сравнению с RVX.

Самым распространенным белком плазмы (и организма в целом) является альбумин. Его молекула содержит несколько дис-ульфидных связей, а также один восстановленный цистеиновый остаток - Cys34. Известно, что Cys34 альбумина составляет большую часть тиольного пула плазмы [10-12]. Оценка связывания RVX и продуктов его деструкции c цистеиновым остатком альбумина поможет выяснению роли альбумина в процессах транспорта и детоксикации RVX, а также может повысить чувствительность и специфичность диагностики.

Материалы и методы исследования. Если не указано иное, использовали реактивы фирмы «Sigma».

Получение ковалентных аддуктов аминокислот с RVX in vitro. В качестве рабочих растворов аминокислот использовали: 30 и 300 мкМ растворы L-серина и L-цистеина в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБ, рН 7,4, Биолот). К 1мл рабочих растворов аминокислот добавляли раствор RVX (ГСО 8249 2004, со -держание целевого продукта не менее 90%) в ФБ в объемном соотношении 1:100. Конечная концентрация RVX в пробах составила 10-1 мг/мл (374 мкМ). Пробы инкубировали 24 часа при 37°С. Поскольку L-тирозин плохо растворяется в воде, в работе были использованы подкисленные и подщелоченные рабочие растворы 30 и 300 мкМ. Аддукт RVX с L-тирозином получали так же, как и с другими аминокислотами.

Получение ковалентных аддуктов белков с RVX in vitro. В качестве объектов исследования использовали: 10 мг/мл раствора альбумина быка в ФБ, 50 мг/мл раствора альбумина (человека, крысы) в ФБ, сыворотка и плазма крови крысы и человека. К объекту исследования добавляли рабочие растворы RVX в ФБ в объемном соотношении 1:50. Рабочие растворы готовили не более чем за 2 часа до начала эксперимента. Конечные концентрации RVX пробах составляли: 10-5 (37 нМ), 10-4 (0,37 мкМ), 10-3 (3,7 мкМ), 10-2 мг/мл (37 мкМ). Пробы инкубировали в течение 24 часов при 37°С. По завершении инкубирования пробы подвергали ферментативному гидролизу в присутствии проназы. В качестве холостых проб при проведении анализа использовали растворы RVX.

Ферментативный гидролиз проб осуществляли согласно Read с сотр. [9]. К растворам белка или пробам плазмы добавляли 3-кратный объем 50 мМ водного раствора аммония бикарбоната и однократный объем раствора проназы в водном растворе 50 мМ аммония бикарбоната. Концентрация раствора проназы со-

ставляла 2,5 мг/мл для гидролиза 10 мг/мл раствора альбумина, 7,5 мг/мл для 50 мг/мл раствора альбумина и 15 мг/мл для гидролиза плазмы или сыворотки. Раствор проназы готовили непосредственно перед использованием, поскольку фермент после разморозки теряет свою активность. Полученную смесь инкубировали в течение 24 часов при 37°С. Перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ - МС/МС) пробы пропускали через фильтры Amicon Ultra 3кДа.

ВЭЖХ-МС/МС анализ RVX и аддуктов RVX с белками и аминокислотами был выполнен с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-селективным детектированием в режиме высокого разрешения, который был реализован на жидкостном хроматографе Accela 1250 (Thermo scientific), оснащенным автодозатором с масс-селективным детектором Orbitrap LTQ Velos. Сбор и обработку данных проводили с помощью компьютерной системы Xcalibur (Thermo scientific). Жидкостно-хроматографическое разделение образцов проводили на колонке Hypersil Gold С18, 150 мм х 4,6 мм х1,8 мкм, скорость потока 400 мкл/мин, подвижная фаза (ПФ): А - 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ), Б - ацетонитрил + 0,05% ТФУ. Режим элюирования - градиент: 5% Б (0-1,5 мин.), от 5 до 90% Б (1,5-10,0 мин.), 90% Б (10-30 мин.), 5% Б (30,01-35,0 мин). Условия работы масс-се-лективного детектора Orbitrap LTQ Velos: электроспрей в режиме положительной ионизации HESI - II: температура распылителя 300°С, температура капилляра 370°С, скорость потока защитного газа 50 psi, скорость потока вспомогательного газа 17 у.ед., напряжение на капилляре +3000В; МС/МС эксперимент проводился в режиме мониторинга выбранных реакций с инициированием фрагментации методом диссоциации, активированной соударениями (ДАС) при разрешающей способности прибора 30 000. Время удерживания аддукта 4,4 мин. Для количественного определения RVX в пробах была построена градуировочная зависимость в широком диапазоне концентраций RVX в ФБ (от 0,1 до 100 нг/мл).

Результаты и обсуждение. Основной проблемой обнаружения белковых аддуктов является их малое количество и чрезвычайная многокомпонентность раствора, в котором находится анализируемое соединение. До сих пор остается актуальной задача разработки новых методов, которые бы позволяли обнаружить аддукты ФОВ с белками плазмы крови. Первоначально ад-дукт тиол-цистеин был определен как результат взаимодействия RVX и L-цистеина в ФБ. Время удерживания аддукта составляет 4,4 мин. Аналогичная попытка провести реакцию RVX с L-ти-розином и L-серином к появлению детектируемых аддуктов не привела. В дальнейшем отсутствие стандартов тирозинового и серинового аддукта не позволило нам определить их в сложных матрицах. Анализ реакционной смеси RVX и L-цистеина в ФБ, проведенный с помощью ВЭЖХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС/МС в режиме высокого разрешения, полностью подтвердил структуру образовавшегося аддукта тиол-цистеин. Достоверность идентификации аддукта в исследованных модельных образцах подтверждается характерным распадом родительского иона в условиях МС3 тандемной масс-спектрометрии. Эксперимент проводили при выборе протонированной молекулы аддукта с m/z 253,10161 (теоретическая масса 253,10389) в качестве иона-предшественника и ионов (С2Н5)2ЖН2СН^+ c m/z 132,08307 (теоре-

зз

тическая масса 132,08469) в качестве первичного иона-продукта (рис. 1), а иона [(C2H5)2NCH2]+ c m/z 86,09697 (теоретическая масса 86,096974) в качестве вторичного иона-продукта (рис. 2).

Поскольку сложная матрица может служить препятствием для детектирования искомых соединений с помощью ВЭЖХ МС/ МС, следующим по сложности объектом исследования был выбран раствор альбумина. Было показано наличие аддукта ти-ол-цистеин в пробах, полученных после совместной инкубации в течение 24 часов 10 мг/мл раствора альбумина быка и RVX (10-2 мг/мл) с последующим проназным гидролизом. Для оценки вклада альбумина в процесс детоксикации RVX были исследованы растворы альбумина крысы и человека (ЧСА, КСА) в ФБ в физиологической концентрации (50 мг/мл). Данные, отражающие способность альбумина разных видов связывать RVX, представлены на рисунке 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность ЧСА и КСА образовывать аддукты с RVX одинакова. Кроме того, на примере ЧСА (в разное время было проанализировано 2 образца, №1 и №2) прослеживается хорошая воспроизводимость полученных результатов.

На рисунке 4 представлены данные по наличию свободного (не связавшегося с белками) RVX в растворах альбумина. Наблюдается прямая зависимость между начальной концентрацией RVX в пробах и количеством не связавшегося RVX. Можно вновь отметить хорошую воспроизводимость полученных результатов. Однако то, что зависимости на рисунках 3 и 4, полученные для растворов альбумина, носят строго линейный характер, несколько удивительно с точки зрения кинетики обратимой реакции второго порядка, прохождение которой в нашем эксперименте можно было бы предположить.

На рисунке 5 представлены данные по образованию аддукта тиола с цистеиновыми остатками белков плазмы и сыворотки крови после их взаимодействия с различным количеством RVX. Наблюдается прямая зависимость между начальной концентрацией RVX в пробах и количеством образовавшегося аддукта ти-ол-цистеин. В отличие от растворов альбумина, для сыворотки наблюдается больший разброс полученных значений для различных концентраций RVX. Отмечена значительная вариабельность в способности сыворотки, полученной от разных животных, образовывать аддукты с тиолом (сыворотка крыс №1 и №2 на рис. 5). Данные, полученные с использованием сыворотки крови двух разных крыс, различаются почти на порядок в относительных единицах площади пика, принадлежащего аддукту тиола с цистеином, что может быть связано с различием в окислительно-восстановительном статусе сыворотки крови животных.

Помимо определения аддукта в пробах плазмы/сыворотки, проводили измерение количества свободного RVX (рис. 3). Поскольку связывающая способность плазмы и сыворотки оказалась выше связывающей способности растворов альбумина по отношению к небольшому количеству RVX, часть данных на рисунке 3 представляет собой точки, а не кривые. Наблюдается прямая зависимость между начальной концентрацией RVX в пробах и количеством несвязавшегося RVX. Как и следовало ожидать, пробы, которые характеризуются наибольшим количеством ад-дукта (рис. 5), содержат меньше свободного RVX, и наоборот. Оказалось, что свободный RVX в пробах сыворотки можно обнаружить, начиная с исходной концентрации RVX 3,7 мкМ (10-3 мг/ мл), а в пробе плазмы - 0,37 мкМ (10-4 мг/мл). Это свидетельствует о низкой реакционной способности RVX по отношению к бел-

кам плазмы/сыворотки крови, учитывая высокую стабильность водных растворов RVX [13], которая также была продемонстрирована в наших экспериментах.

Мы исследовали процесс спонтанного гидролиза RVX в ФБ при 37°С в диапазоне начальных концентраций от 1 до 100 нг/мл, для того чтобы учесть этот процесс при определении количества несвязавшегося с белками RVX. Для всех исследованных начальных концентраций RVX вид зависимости концентрации RVX от времени с момента приготовления раствора имеет одинаковый профиль и хорошо экстраполируется уравнением вида:

^Х]^^^^],,-^]^ )*e(-Kt) (1)

Для экстраполяции полученных данных использовали программу GraphPad Prism 5.0. Параметры экстраполированных кривых представлены в таблице. Количество RVX в растворе ФБ с течением времени снижается до 60% от начального значения и после этого существенно не меняется для всех трех начальных концентраций RVX в течение 2 дней, что соответствует времени проведения экспериментов с растворами белков и плазмой/сывороткой in vitro. Можно предположить, что в системе устанавливается состояние, близкое к равновесному. Для более точного описания процесса необходимо проведение длительных экспериментов.

Как и следовало ожидать, связывающая способность сыворотки/плазмы оказалась выше связывающей способности раствора альбумина. Об этом свидетельствуют данные, представленные на рисунке 4, отражающие количество свободного RVX в растворе после его 48-часового инкубирования с пробами. Нужно отметить, что при максимальной начальной концентрации RVX (37 мкМ) связывающая способность сыворотки/плазмы и растворов альбумина совпадают. Однако с уменьшением начальной концентрации RVX резко увеличивается различие между связывающими способностями сыворотки/плазмы и растворов альбумина. При снижении начальной концентрации RVX до 37 нМ мы не обнаружили свободного RVX в пробах сыворотки и плазмы, в то время как в пробах, содержащих раствор альбумина, количество свободного RVX обнаруживается вплоть до его концентрации 3,7 нМ (10-6 мг/мл). Данная концентрация является токсикологически релевантной, поскольку соответствует острому отравлению нелетальной дозой RVX. На основании представленных на рисунке 4 данных можно было бы заключить, что альбумин играет незначительную роль в процессе детоксикации RVX. Однако такому выводу противоречат данные по образованию аддукта тио-ла с цистеином (рис. 6).

Наблюдается некоторое несоответствие между связывающей способностью сыворотки/плазмы и растворов альбумина, с одной стороны, и количеством не связавшегося RVX, с другой стороны (рис. 4 и 6). Количество определяемого аддук-та для исследуемых образцов почти одинаково, в то время как количество свободного RVX в пробах сыворотки существенно (на несколько порядков для низких концентраций RVX) меньше по сравнению с пробами альбумина. Как было указано во введении, при используемом в работе значении рН = 7,2-7,4 гидролиз RVX может идти по двум путям одновременно; в одной из недавних работ [5] показано наличие токсичной кислоты в сыворотке крови в опытах in vivo. Следовательно, можно предположить, что некоторые компоненты сыворотки могут увеличивать константу скорости второго пути гидролиза, в ходе которого аддукты тиола с цистеином образовываться не будут, а

Рис. 1. МС/МС-спектр аддукта тиол-цистеин.

очя;

F ГО6-i E3FJn*! ЭЦОйШНП IVO^oBSQDp«»^«!

Рис. 2. МС3-спектр аддукта таол-цистеин.

к

Si-

»i

м»

г

и -он

к

iiMOCI

в

н^с-

Л. У

ш i;«>

«9041П

—г но

iwciiiJ тока*

1—I—г

г

L4

-1-Г

1-1

№

141 Mil*

tWifctt ц$» ;»¡яи л*л ns

1«

1Л'

т

SB

-r

Т"

мо

концентрация RVX будет уменьшаться. Кроме того, известно, что протонированный третичный азот, который присутствует в молекуле RVX, способствует связыванию веществ с альфа-1 кислым гликопротеином [14,15]. Наконец, негидролизованный RVX взаимодействует с холинэстеразами крови. Каково соотношение вышеназванных путей взаимодействия RVX с белками крови, с одной стороны, и его деструкции, с другой стороны, предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.

Заключение. В результате проделанной работы установлен предел обнаружения для метода определения аддукта тиола с цистеиновыми остатками белков in vitro, который составляет 37 нМ в пересчете на начальную концентрацию RVX в пробе. Возможно дальнейшее увеличение чувствительности метода за счет проведения твердофазной микроэкстракции, которая позволит сконцентрировать пробу перед проведением ВЭЖХ-МС/МС анализа. Также необходимо отметить, что определе-

ние аддукта тиола с цистеином в ходе взаимодействия RVX с белками проведено впервые.

100000000

.10000000

9

и

£ 1000000 я и еа

2 100000

з

о

10000 1000

Рис. 3. Зависимость количества образовавшегося аддукта тиол-цистеин от количества RVX, внесенного в раствор альбумина. Логарифмические координаты.

-КСА

□ ЧСА №1

—О—ЧСА №2

10 100 1000 10000 [ИУХ], нМ

100000

Таблица

Параметры кривой спонтанного гидролиза

Параметры Начальная концентрация RVX в растворе, нг/мл

1 10 100

Плато, нг/мл 0,66 5,340 59,58

Плато, ошибка среднего 0,04 0,650 8,73

К 0,110 0,070 0,058

К, ошибка среднего 0,049 0,029 0,028

100000

10000

100000

—•—КСА

• □ ЧСА №1

—О—ЧСА №2

♦ сыв. крысы №1

■ Ж сыв. крысы №2 А плазма

человека Ш сыв. человека

Исходная концентрация КУХ в растворе, нМ

Рис. 4. Количество свободного RVX в растворе после 48-часовой инкубации проб с различным начальным количеством RVX. Логарифмические координаты.

100000000

.10000000

в н о

й в в

1000000

100000

а

о

в 10000

1000 410

■ч-

100

1000

10000

100000

-сыв. крысы №1

■ Ж сыв. крысы №2

-плазма человека

-сыв. человека

Рис. 5. Зависимость количества образовавшегося аддукта от количества внесенного в сыворотку/плазму RVX. Логарифмические координаты.

[ИУХ], нМ

100000000

5

8

н е

.10000000

= 1000000

в

о

ч

100000

10000

1000 -I-10

■ч-

—•—КСА

• □ ЧСА№1 —О—ЧСА №2

♦ сыв. крысы №1

• Ж сыв. крысы №2

А плазма человека

Рис. 6. Зависимость количества образовавшегося аддукта тиола с цистеином от количества внесенного в пробы RVX.

100

1000

[КУХ], нМ

10000 100000 -"-сыв.

человека

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ/REFERENCES:

1. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F., Hauschild V The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products. Environ. Health Perspect. 1999; 107 (12): 933-974.

2. СавельеваЕ.И., Зенкевич И.Г., Кузнецова Т.А., Радилов АС., Пшеничная Г.В. Исследование продуктов превращений фосфорорганических отравляющих веществ методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. общества им. Д.И. Менделеева). 2002; XLVI (6): 82-91./ Salel'eva E.I., Zenkevich I.G., Kuznetsova T.A., Radilov A.S., Pshenichnaya G.V Investigation of products of transformation of phosphororganic toxic substances with gas chromatography - mass spectrometry. Rus. Khim. Zh. (Rus.). 2002; XLVI (6):82-91.

3. Tsuchihashi H., Katagi M., NishikawaM, Tatsuno M. Identification of metabolites of nerve agent VX in serum collected from a victim. J. Anal. Toxicol. 1998; 22 (5): 383-388.

4. Weisinger R.A., Jakoby W.B. S-Methylation: thiol S-methyltransferase. In: Enzymatic Basis of Detoxication, V II, - New York, Academic Press. 1980: 131-140.

5. Reiter G., Mikler J., Hill I., Weatherby K, Thiermann H., Worek F.J. Simultaneous quantification of VX and its toxic metabolite in blood and plasma samples and its application for in vivo and in vitro toxicological studies. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2011; 879 (26): 2704-2713.

6. Riches J., Morton I., Read R.W., Black R.M The trace analysis of alkyl alkylphosphonic acids in urine using gas chromatography-ion trap negative ion tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2005; 816 (1-2): 251-258.

7. Noort D., Benschop H.P., Black R.M, Biomonitoring of exposure to chemical warfare agents: a review. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2002; 184 (2): 116-126.

8. Bao Y., Liu Q., Chen J., Lin Y., Wu B., Xie J. Quantification of nerve agent adducts with albumin in rat plasma using liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2012; 1229: 164-171.

9. Read R.W., Riches J.R., Stevens J.A., Stubbs S.J., Black R.M Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy. Arch. Toxicol. 2010; 84 (1): 25-36.

10. Fabisiak J.P., Sedlov A., Kagan VE. Quantification of oxidative/nitrosative modification of Cys34 in human serum albumin using a fluorescence-based SDS-PAGE assay. Antioxid. Redox Signal. 2002; 4: 855-865.

11. Ogasawara Y., Mukai Y., Togawa T, Suzuki T, Tanabe S, Ishii K Determination of plasma thiol bound to albumin using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection: ratio of cysteinyl albumin as a possible biomarker of oxidative stress. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007; 845 (1): 157-163.

12. Oettl K., Stauber R.E. Physiological and pathological changes in the redox state of human serum albumin

critically influence its binding properties. Br. J. Pharmacol. 2007; 151: 580-590.

13. Bonierbale E., Debordes L., Coppet L. Application of capillary gas chromatography to the study of hydrolysis of the nerve agent VX in rat plasma. J. Chromatogr. B. Biomed Sci. Appl. 1997; 688 (2): 255--264.

14. Pike E, SkuterudB., Kierulf P., Fremstad D, Abdel Stayed SM, Lunde P.K Binding and displacement of basic, acidic and neutral drugs in normal and orosomucoid-deficient plasma. Clin. Pharmacokinet. 1981; 6 (5): 367-374.

15. Israili Z.H., Dayton P.G. Human alpha-1-glycoprotein and its interactions with drugs. Drug Metab. Rev. 2001; 33 (2): 161-235.

D.S. Prokofieva, N.V Krivorotova, N.V Goncharov

IDENTIFICATION OF NEW RVX ADDUCT WITH BLOOD PLASMA PROTEINS BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY COUPLED WITH TANDEM MASS-SELECTIVE DETECTION IN HIGH RESOLUTION MODE

Federal State Unitary Enterprise «Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology», Federal Medical Biological Agency of Russia, 188663, g/p Kuzmolovsky, Vsevolozhsk District, Leningrad Region, Russian Federation

Present-day ideas about in vitro and in vivo transformation of V-type oraganophosphorus chemical agent are described. In vitro experiments, a new covalent RVX adduct with blood plasma proteins was identified using HPLC with tandem mass-selective detection in high resolution mode. Data were obtained to evaluate albumin input into RVX detoxification process.

Key words: adduct, albumin, binding, plasma, RVX.

Переработанный материал поступил в редакцию 20.12.2013 г