CC BY
24
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.982.27-039
Р.И.Акимов, И.Б.Захарова, Д.В.Викторов, О.А.Меринова
ОБНАРУЖЕНИЕ ЙНТЕГРОНОВ У ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BURKHOLDERIA
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Представлены результаты исследований,1 направленных на обнаружение в геноме патогенных и условно-патогенных буркхольдерий нового класса мобильных элементов - интегронов, несущих генные кассеты, кодирующие факторы устойчивости к антибактериальным препаратам. ПЦР-анализ с использованием праймеров, гомологичных консервативным сегментам интегронов, показал наличие последовательностей мобильных элементов данного типа в геномах всех исследованных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis и В. cepacia. Специфические фрагменты 197 и 627 п.о., содержащие ген интегразы 1-го класса intll, выявлены у штаммов В. thailandensis Е299 и В. cepacia 25416 соответственно.
Высокий уровень лекарственной резистентности микроорганизмов рода Burkholderia и низкая эффективность антибактериальной терапии 'вызываемых ими заболеваний обусловливают актуальность изучения генетических основ природной и приобретенной антибиотикоустойчивости данной группы патогенов [2, 6, 8].
Известно, что значительная часть генов устойчивости к антибиотикам, обнаруженных у грамот-рицательных бактерий, имеет кассетную организацию [1,5]. Генные кассеты принадлежат клас'су мобильных элементов, содержащих кодирующий регион и рекомбинационный сайт и способных интегрировать в специфические сайты интегронов [4]. Интегрон включает в себя ген intl, кодирующий ин-тегразу и прилегающий рекомбинационный сайт attl. Гены интеграз гомологичны у различных, видов микроорганизмов, обнаруживая тем не менее разницу в своих последовательностях, на основании чего все известные интегроны подразделяются на 9 классов [11]. Экспрессия интегрированных генных кассет обусловлена общим промотором интёгрона Рс (Pant), также относящимся к обязательным компонентам генетических элементов данного типа [11]. Собственно кассетные гены не являются облигат-ной структурной единицей интёгрона, однако) после интеграции становятся частью последнего, при этом количество кассет может варьировать, обусловливая полирезистентность микроба [7]. Наиболее изучены интегроны 1-го класса (Inl), содержащие детерминанты резистентности к аминогликозидам, сульфо-намидам и четвертичным аммонийным соедйнени-ям [1, 10, 11].
До настоящего времени интегроны не были описаны у В. mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis. Цель настоящей работы заключалась в определении наличия генетических структур данного типа у патогенных и условно-патогенных видов Burkholderia.
Материалы и методы
В работе были использованы штаммы В. pseudomallei - 10, В. mallei - 3, В. thailandensis - 2 и
В. cepacia - 2, выделенные из клинического материала и объектов внешней среды в различных географических регионах и хранящиеся в коллекционном центре ВолгНИПЧИ. Культуры штаммов выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24-48 ч при 37 °С. 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl рН7,2 плотностью 2-109м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-НС1, 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг/мл желатина, 0,9 % Nonidet Р-40, 0,9 % Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), осторожно перемешивали, инкубировали при 65 °С 120 мин и прогревали при 105 °С 30 мин для инактивации фермента. Пробы центрифугировали (10000 об/мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР.
ПЦР с праймерами 5'-CS (GGC АТС САА GCA GCA AG), З'-CS (AAG CAG ACT TGA ССТ GA), гомологичными консервативным сегментам интегронов различных классов, проводили по программе: начальный прогрев 95 °С, 5 мин; 7 реакционных циклов (94 °С, 30 с; 57 °С, 30 с; 72 °С, 60 с), 40 циклов (94 °С, 30 с; 55 °С, 30 с; 72 °С, 60 с), финальная элонгация 72 °С, 10 мин. В реакции использовали ПЦР буфер (Интерлабсервис, Россия), 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, 15пмоль каждого праймера, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы (Интерлабсервис, Россия). Для идентификации интегронов 1-го класса использовали реамплификацию продуктов ПЦР с праймерами intllf (ССТ ССС GCA CGA TGA ТС) и intllr (ТСС ACG CAT CGT CAG GC), гомологичными последовательностям гена интегразы 1-го класса intll, проводя реакцию по аналогичной программе. Ампликоны анализировали в 1,5 % агарозном геле и в денатурирующем 6 % полиакри-ламидном геле (ПААГ) с 7,0 М мочевины. Полиак-риламидные гели окрашивали серебром [3]. Элю-цию ДНК для реамплификации проводили следующим образом: из окрашенного серебром ПААГ вырезали зоны, содержащие интересующие ампликоны, помещали в микроцентрифужные пробирки, замораживали и тщательно измельчали стерильной стеклянной палочкой. К фрагментам геля добавляли
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 88, 2004
Ь^у 44щл шщ ■
W ЯНР :: ГТТ-----
х л ,, " #М»> ¿)т* / %/ ••,.•::•' ' ••..■.•• •:• •:'••.•.
1 . ■ 2 3 4 ' '5 II-:'
Рис. I. Результаты амплификации ДНК штаммов патогенных й условно-патогенных Burkholderia с праймерами 5'-CS - З'-CS.
Электрофорез в денатурирующем ПААГ :
. ' ' 1 - в:pseudomallei 140; 2 - В. thailandensis Е264; ■ ' 3 - В. thailandensis Е299; 4 - В. cepacia 25416; 5 - В. cepacia 3189
200 мкл бидистиллированной воды, инкубировали 18 ч при 37 °С и центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатант использовали в ПЦР.
Результаты и обсуждение
ПЦР с праймерами 5'CS - 3'CS и последующий анализ продуктов реакции показали, что в геноме всех изученных штаммов содержатся последовательности интегронов. Ампликоны размером 367 пар оснований (п.о.) были выявлены при проведении ПЦР с ДНК исследованных штаммов В. pseudo-mallei, В. mallei и В. thailandensis. В геноме штамма В. thailandensis Е299, наряду с последовательностью 367 п.о., был обнаружен более короткий фрагмент размером 197 п.о. (рис. 1). В штамме В. cepacia 3189 идентифицирован интегрон размером 307 п.о., а в штамме В. cepacia 25416 обнаружены последовательности интегронов 627, 450 и 324 п.о. (рис. 1).
Для подтверждения принадлежности обнаруженных последовательностей к интегронам и исключения образования вторичных. структур вследствие внутренней гомологии цепей была проведена реамплификация элюированных из ПААГ фрагментов ДНК с праймерами 5'CS - 3'CS. Во всех случаях реамплификация дала положительный результат - были воспроизведены фрагменты. ДНК аналогичных исходным размеров (рис. 2). Следует отметить, что ампликон 324 п.о., обнаруженный в штамме В. cepacia 25416, по-видимому, содержит внутренние участки частичной гомологии с праймерами 5'CS - 3'CS, поскольку при его реамплифика-ции был выявлен дополнительный минорный фрагмент размером 251 п.о. (рис. 2).
Возможную принадлежность выявленных последовательностей к интегронам 1-го класса исследовали в ПЦР с праймерами intllf и intllr. В качестве матрицы использовали все фрагменты ДНК,
?R45
Ml 23 45 6 7 8 М
Рис. 2. Реамплификация очищенной ДНК интегронов с праймерами 5'-CS - З'-CS.
Электрофорез в денатурирующем ПААГ:
Здесь и на рис. У. М - маркерная ДНК (pGEM DNA Marker, Promega);
I - В. pseudomallei 140; 2 - В. thailandensis E264;
3 - В. thailandensis E299 (фрагмент 197 п.о.); 4 - В. thailandensis Е299 (фрагмент 367 п.о.); 5 - В. cepacia 25416 (фрагмент 324 п.о.); 6 - В. cepacia 25416 (фрагмент 450 п.о.); 7 - В. cepacia 25416 (фрагмент 627 п.о.); 8 - В. cepacia 3189
адекватно реамплифицируемые с праймерами 5'CS - 3'CS и очищенные в ПААГ. Положительный результат ПЦР был отмечен для фрагмента 197 п.о. из штамма В. thailandensis Е299, а также для фрагмента 627 п.о. из штамма В. cepacia 25416. Последовательностей гена интегразы класса 1 в составе других выявленных интегронов не обнаружено (рис. 3).
Таким образом, в результате проведенных исследований в штаммах В. mallei, В. pseudomallei, В. thailandensis и В. cepacia идентифицированы последовательности мобильных генетических элементов - интегронов, до настоящего времени не описанных у патогенных видов Burkholderia. Полученные данные свидетельствуют о наличии у данных микроорганизмов специфического молекулярного механизма, который, наряду с ранее обнаруженным у отдельных видов буркхолдерий активным выбросом лекарственных соединений из клеток (multi-drug efflux) [9] и снижением проницаемости клеточной мембраны за счет изменения экспрессии поринов [12], может вносить существенный вклад в формирование множественной лекарственной резистентности. Определение нуклеотидных последовательностей обнаруженных интегронов и анализ их структуры является задачей дальнейших исследований.
МИКРОБИОЛОГИЯ
Ml 2 3 4 5 6 7 8 М '
Рис. 3. Реамплификация очищенной ДНК интегронов с праймерами intllf-intllr. ' ''
Электрофорез в денатурирующем ПААГ !'
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ильина Т.С. // Мол. генет., микробиол., вирусол. -2001. - № 3. - С. 3-12. ^ 2. Мелиоидоз / Под ред.
H.Г.Тихонова. - Волгоград. - 1995.-224 с.-3.Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. // Anal. Biochem. -1991. - Vol. 196. - P. 80. - 4. Bunny K.L., Hall R.M., Stokes H.W. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1995. -Vol. 39. - P. 686-693. - 5. Caratolli A. // Vet. Res. - 2001.-Vol. 20.-P. 243-259.- 6. Godfrey A. J., Wong S., Dance D. A. et al. II Antimicrob. Agents Chemother. - 1991. - Vol. 35. -P. 1635-1640. - 7. Hall R.M., Collins C.M. // Mol. Microbiol.- 1995. - Vol. 15. - P. 593-600, - 8. Kenny D., Russel P., Rogers D. // Antimicrob."Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 2773-2775. - 9. Moore A., DeShazer D., Reck-seidler S. el al. II Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 465^170. - 10. Recchia G. D., Hall R.M. // Microbiology. - 1995. - Vol. 141. - P. 3015-3027. - ll.Sabate M., Prats G. // Enferm. Infec. Microbiol. Clin. - 2002. - Vol. 20. -P. 341-345. - 12. Viktorov D., Merinova L., Zakharova
I., Seimova I/ // 'World Melioidosis Congress Proceeding.-Perth, 2001. -.P. 60.- 13. Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. // Acta Tropica^ - 2000. -Vol. 74.-P. 139-144.
R.l.Akimov, l.B.Zakharova, D.V.Viktorov, O.A.Merinova
Detection of Integrons in Pathogenic and Conventionally Pathogenic Representatives of Burkholderia Genus
Volgograd Anti-Plague Research Institute
Described in the work are the results of investigations aimed at detecting a new class of mobile elements, integrons, carrying gene cassettes that encode factors of resistance to antibacterial preparations, in the genomes of pathogenic and opportunistic burkholderia. PCR analysis using the primers homologous to the conservative segments of the integrons, demonstrated that all the strains studied, i.e., B. pseudomallei, B. mallei, B. thailan-densis and B. cepacia, were carrying mobile elements sequences of this type. Specific fragments 197 and 627 b.p. containing the 1st class integrase gene imll were found in B. thailandensis strain E299 and B. cepacia 2541, respectively.
Поступила 28.05.04
УДК 616.981.452
Л.П.Базанова, А.Я.Никитин, М.П.Маевский, Ю.М.Капустин
I1
ИЗМЕНЧИВОСТЬ И АГРЕГИРОВАННОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ КАК СПОСОБ ЕГО СОХРАНЕНИЯ В ОРГАНИЗМЕ С1ТЕИОРН1Ш5 ГЕБО^ОЯШ А^АЮиЭ {ЭтНОМАРТЕИА)
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
1.
Показано, что особенности физиологического состояния блох при подготовке насекомых к зимней диапаузе, длительном голодании и повышении температуры их содержания приводят к изменению морфологии чумного микроба и повышению его способности к агрегированию. В таком состоянии чумной микроб может переживать в организме блохи неблагоприятные условия существования, сохраняя при этом свою вирулентность.
Существование чумного микроба в блохе, особенно в межэпизоотическую фазу, обусловлено взаимоотношениями возбудителя и переносчика, и их изучение остается актуальной и сложной проблемой. Одним из основных звеньев в системе защиты микроорганизмов от неблагоприятных внешних воздействий является персистенция, т.е. определенное состояние микроба, обеспечивающее возможность его длительного пребывания в макроорганизме [14]. Морфологические и другие фенотипи-
ческие изменения чумного микроба возникают в организме блох при нарушении питания насекомых, холодовом оцепенении, повышении температуры, резком изменении интенсивности обменных процессов [4, 8]. Эти изменения обусловлены также режимом питания и пищеварения насекомых. Так, в период окончания пищеварения преобладающей формой в желудочно-кишечном тракте блохи являются мелкие коккобактерии, образующие плотные комки и сгустки [13].
