CC BY
69
УДК 616.982.27-039
Н.Н.Тетерятникова, И.Б.Захарова, М.В.Подшивалова, А.В.Романова, Я.А.Лопастейская,
Д.В.Викторов, В.В.Алексеев
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ИНТЕГРОНОВ КЛАССА 1 У BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI
ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»
Для детекции интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis использована ПЦР с праймерами, специфичными фланкирующим последовательностям области вставки генных кассет и 3’-консервативному сегменту интегронов. Последовательности З’-сегмента In1 обнаружены у половины исследованных штаммов B. pseudomallei. Размер области кассетной вставки интегронов у B. pseudomallei составил 2300 п.н. (1 штамм), 500 и 900 п.н. (1 штамм) и 120 п.н. (2 штамма). Секвенирование ампликонов З’-сегмента показало наличие генов qacEdelta1 и sul1 - детерминант устойчивости к четвертичным аммонийным соединениям и сульфонамидам соответственно.
Ключевые слова: Burkholderia pseudomallei, интегроны, антибиотикорезистентность.
N.N.Teteryatnikova, I.B.Zakharova, M.V.Podshivalova, A.V.Romanova, Ya.A.Lopasteiskaya, D.V.Viktorov, V.V.Alekseev
Molecular Detection of Class 1 Integrons in Burkholderia pseudomallei
Volgograd Anti-Plague Research Institute
PCR with primers specific to flanking sequences of gene cassette insertion region and 3’-conservative segment of integrons was used for class 1 integron detection in Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. The sequences of In1 3’-conservative segment were detected in the majority of investigated strains of B. pseudomallei. The length of integron cassette insertion region in B. pseudomallei was estimated as 2300 bp (1 strain), 500 and 900 bp (1 strain) and 120 bp (2 strains). The sequence analysis of 3’-segment amlicons showed the presence of qacEdelta1 and sul1 - the determinants of resistance to quaternary ammonium compounds and sulfonamides, respectively.
Key words: Burkholderia pseudomallei, integrons, antimicrobial resistance.
Аккумуляция единичных генов антибиотикоре-зистентности в интегронах - генетических элементах, способных включать в свой состав экзогенные кодирующие последовательности по механизму сайт-специфической рекомбинации и обеспечивать их экспрессию, является важнейшим молекулярногенетическим механизмом формирования множественной устойчивости к антибиотикам у ряда бактериальных патогенов [2, 5, 6].
Общими элементами структуры интегронов, охарактеризованных к сегодняшнему дню, являются наличие гена intI, кодирующего интегразу семейства тирозиновых рекомбиназ, сайта рекомбинации attI и промоторной последовательности Pc, обеспечивающей транскрипцию генных кассет в составе интегрона [5, 6]. Последовательности генных кассет содержат attC сайт (59-be, 59 base element) - несовершенный инвертированный повтор протяженностью 57-141 п.н. с консервативными краевыми участками, служащий сайтом узнавания интеграз [5, 6]. Существующая классификация интегронов основана на различиях в последовательностях генов intI; в соответствие с ней выделяют 7 классов данных генетических элементов. По характеру геномной локализации интегроны разделяют на «мобильные», входящие в состав IS-элементов, транспозонов, конъюгативных плазмид, и так называемые суперинтегроны - протяженные участки хромосом, содержащие генные
кассеты различных функциональных групп [5]. В процессы аккумуляции и горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам у бактерий вовлечены преимущественно «мобильные» интегроны
1-5-го классов [5, 6].
Важным биологическим свойством патогенных буркхольдерий (возбудители мелиоидоза и сапа -Burkholderia pseudomallei, B. mallei) является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений [3, 7]. Наличие этого свойства создает значительные трудности для успешного лечения вызываемых ими заболеваний. Необходимо отметить, что биологические основы полирезистентности патогенных Burkholderia на сегодняшний день являются малоизученными.
Исследования систем генетического обмена патогенных Burkholderia [1] доказывают принципиальную возможность горизонтального переноса и наследования этими микроорганизмами R-детерминант в составе мобильных генетических элементов. Очевидно. что детекция и структурно-функциональный анализ данных последовательностей является актуальным направлением исследований как в плане более полного понимания биологических основ устойчивости возбудителей мелиоидоза и сапа к антимикробным соединениям, так и в аспектах совершенствования схем лечения инфекций и создания систем геномного сканирования штаммов патогенных буркхольдерий с
Праймеры, использованные в работе
Праймер*
Последовательность 5’-3’
Мишень**
in-F
in-B
qacEd1
sul
GGCATCCAAGCAGCAAGC
AAGCAGACTTGACCTGAT
ATCGCAATAGTTGGCGAAGT
GCAAGGCGGAAACCCGCC
5’-консервативный сегмент интегронов In1 (accession no. U12338, 141б-1433)
З’-консервативный сегмент интегронов In1 (accession no. U12338, 4831-4814)
Ген устойчивости к четвертичным аммонийным соединениям qacEdelta1 З’-консервативного сегмента интегронов In1 (accession no. X15370, 211-230)
Ген устойчивости к сульфонамидам sul 3’- консервативного сегмента интегронов In1 (accession no. Х128б9, 13б0-1341)
* Праймеры синтезированы на базе НПК «Синтол» (Россия) по последовательностям, приведенным в работе L.Bass et al. [2].
** Указаної позиции праймеров на последовательностях интегронов 1п1, представленных в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
целью решения практических задач генодиагностики, молекулярно-эпидемиологического мониторинга и прогнозирования возможных эпидситуаций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами. Цель данной работы, таким образом, заключалась в выявлении последовательностей интегронов класса 1 в геномах штаммов исследуемых видов Burkholderia с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и их первичной структурной характеристике.
Материалы и методы
В работе использованы 11 штаммов B. pseudomallei, 3 штамма B. mallei, 3 штамма B. thailandensis из коллекции ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ. Культуры микроорганизмов выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24-48 ч при 37 °С. 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl (pH 7,2) плотностью
2-109 м.к./мл, инактивированной в соответствии с МУ 1.3.1794-03, смешивали с равным объемом лизи-рующего буфера (20 мМ трис-Hci, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг/мл желатина, 0,9 % Nonidet P-40, 0,9 % Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 65 °С 120 мин и прогревали при 96 °С 30 мин для инактивации фермента. Далее пробы центрифугировали (10000 об./мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР. Праймеры для ПЦР-детекции последовательностей In1 приведены в таблице.
ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технологии, Россия) с использованием стандартных реагентов фирмы «ИнтерЛабСервис» (Россия). Область кассетной вставки In1 амплифици-ровали с использованием праймеров inF-inB по программе: прогрев 95 °С 1 мин, 35 циклов (94 °С 30 с, 55 °С 30 с, 72 °С 45 с), финальная элонгация 72 °С 5 мин. Амплификацию участка 3’-консервативного сегмента In1 (праймеры qacEd1-sul) проводили по аналогичной программе, температура отжига праймеров составляла 58 °С. Продукты ПЦР анализировали в 1,5 % агарозном геле.
Продукты амплификации секвенировали на сек-венаторе ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), используя наборы BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
Результаты и обсуждение
Первичный ПЦР-скрининг интегронов 1 класса с использованием пары праймеров qacEd1-sul показал присутствие последовательностей 3’-консерва-тивного сегмента Ы1в геномах большинства исследуемых штаммов B. pseudomallei (рис. 1). Размер ам-пликонов qacEd1-sul составил порядка 800 п.н., что, в целом, соответствовало ранее полученным данным о структуре 3’-сегментов данных генетических элементов [2, 5, 6].
Последующий анализ области кассетной вставки интегронов в ПЦР с праймерами inF-inB продемонстрировал наличие ампликонов различного размера в геномах 4 штаммов возбудителя мелиоидоза (рис. 2). В штамме B. pseudomallei 56830 размер области кассетной вставки интегрона составил 2300 п.н., тогда как в штамме B. pseudomallei С141 области кассетной вставки In1 соответствовало 2 ампликона размером 500 и 900 п.н. Еще в двух исследованных штаммах B. pseudomallei размер амплифицируемого региона составил 120 п.н., что, вероятно, следует объяснять отсутствием внедренных генных кассет в структуре интегронов у данных изолятов.
Секвенирование ампликонов qacEd1-sul и последующий анализ сиквенсов на предмет наличия кодирующих участков (ORF, open reading frame) продемонстрировали 2 наиболее вероятных варианта ORF, ориентированных в направлении 5’ - 3’- ис-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Рис.1. Амплификация последовательности 3’-консервативного сегмента интегронов In1 в штаммах буркхольдерий с праймерами qacEd1-sul:
1 - ДНК-маркер, 2000, 1000, 900, 700, 450 п.н.; 2 - B. thailandensis E251; 3 - B. thailandensis E264; 4-B. thailandensis E299; 5 - B. mallei 10230; 6 - B.mallei B-120; 7 - B. mallei Ц-5; 8 - B. pseudomallei 56770;
9 - B. pseudomallei 57576; 10 - B. pseudomallei 56830; 11 - B. pseudomallei 111; 12 - B. pseudomallei 114; 13 - B. pseudomallei 135; 14 - B. pseudomallei 140; 15 - B. pseudomallei 107; 16 - B. pseudomallei 100
Рис. 2. Амплификация области кассетной вставки интегронов In1 в штаммах B. pseudomallei с праймерами inF-inB:
1 - B. pseudomallei С141; 2 - B. pseudomallei 111; 3 - B. pseudomallei 114; 4 - B. pseudomallei 135; 5 - B. pseudomallei 139; 6 - B. pseudomallei 140; 7 - B. pseudomallei 56830; 8 - GeneRuler Plus леддер (Fermentas), 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,
100 п.н.
следуемой последовательности. Дальнейший анализ обозначенных ORF с применением алгоритма BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov\blast\Blast.cgi\) показал их высокую гомологию консервативным структурным компонентам 3’-сегмента интегронов класса 1 - генам qacEdelta1 и sul1 - детерминантам устойчивости к четвертичным аммонийным соединениям и суль-фонамидам соответственно.
Таким образом, проведенное исследование показало, что в геномах штаммов возбудителя мелиоидоза имеются последовательности интегронов класса 1. Установленный в рамках данной работы факт присутствия интегронов In1 у B. pseudomallei свидетельствует о принципиальной осуществимости механизма аккумуляции и наследовании генных кассет антибиотикорезистентности в составе данных генетических элементов и формировании, таким образом, штаммов с фенотипом множественной антибио-тикоустойчивости. Отрицательный результат ПЦР с праймерами qacEd1-sul у ряда штаммов с детектированной областью кассетной вставки интегронов, возможно, опосредован вторичными рекомбинационными событиями на участках 3’-консервативного сегмента, нарушающими сайты связывания с праймерами. В частности, подобные модификации структуры 3’-консервативного сегмента In1 были описаны у Proteus mirabilis [8].
Вопрос о характере геномной локализации выявленных генетических элементов требует дальнейших исследований. Отметим, что на сегодняшний день у микроорганизмов рода Burkholderia интегро-ны класса 1 были выявлены в составе конъюгатив-ных плазмид отдельных эпидемических штаммов B. cepacia [4], а в исследованных нами штаммах возбудителя мелиоидоза ранее были отмечены криптиче-ские плазмиды различного размера [1]. Структурный анализ и генетическое картирование регионов кассетных вставок интегронов также являются задачами дальнейших исследований.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Меринова Л.К., Антонов В.А., Замараев В.С., Викторов Д.В. Мобилизация криптических плазмид возбудителя мелиоидоза в гетерологичные виды микроорганизмов. Мол. генет. ми-кробиол. вирусол. 2000; 2:37-40.
2. Bass L., Liebert C.A., Lee M.D., Summers A.O., White D.G. Incidence and characterization of integrons, genetic elements mediating multiple-drug resistance, in avian Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 1999; 43:2925-9.
3. Brett P.J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis. Acta Trap. 2000; 74:201-10.
4. Crowley D., Daly M., Lucey B., Shine P., Collins J., Cryan B. et al. Molecular epidemiology of cystic fibrosis-linked Burkholderia cepacia complex isolates from three national referral centres in Ireland. J. Appl. Microbiol. 2002; 92:992-1004.
5. FluitA.C., SchmitzF.J. Resistance integrons and super-inte-grons. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10:272-8.
6. Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution. Nature 2006; 4:608-20.
7. Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. Antimicrobial resistance in Burkholderia pseudomallei. Acta Trop. 2000; 74:139-44.
8. Zong Z., Partridge S., Iredell J. A blaVEB-1 variant, blaVEB-6, associated with repeated elements in a complex genetic structure. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53:1693-7.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Merinova L.K., Antonov V.A., Zamaraev VS., Viktorov D.V. [Mobilization of a cryptic plasmid from the melioidosis pathogen in heterologous species of microorganisms]. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2000; 2:37-40.
Authors:
Teteryatnikova N.N., Zakharova I.B., Podshivalova M.V., Romanova A.V., Lopasteiskaya Ya.A., ViktorovD.V., Alekseev V.V. Volgograd Research Anti-Plague Institute. Golubinskaya St., 7, Volgograd, 400131, Russia. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Об авторах:
Тетерятникова Н.Н., Захарова И.Б., ПодшиваловаМ.В., Романова А.В., Лопастейская ЯА., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Поступила 09.11.10.
