CC BY
17
УДК 616.982.27+616.982.27-039
А.В.Романова, И.Б.Захарова, В.С.Замараев, Д.В.Викторов
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ р-ЛАКТАМАЗ
ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ РОДА виГКНОШЕПА
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград
Сконструирован набор олигонуклеотидных праймеров для проведения экспресс-оценки наличия детерминант устойчивости к р-лактамам у изолятов патогенных буркхольдерий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным определением принадлежности выявленных р-лактамаз к определенному молекулярному классу. ПЦР с праймерами, специфичными последовательностям генов металло-Р-лактамаз (класс В р-лактамазы). и оксациллиназ семейства D-ala карбоксипептидаз (класс D р-лактамазы) позволяет дифференцировать между собой виды Burkholderia группы «рБеМотаИеЬ).
Ключевые слова: Burkholderia, р-лактамазы, молекулярное типирование, полимеразная цепная реакция.
A.V.Romanova, I.B.Zakharova, V.S.Zamaraev, D.V.Viktorov
Design of Primers for Detection and Typing of p-Lactamase Genes from Pathogenic Species of Burkholderia
Volgograd Anti-Plague Research Institute, Volgograd
The set of oligonucleotide primers was designed to identify P-lactam-resitance determinats in isolates of pathogenic Burkholderia using PCR. Simultaneously identified was certain molecular class of detected P-lactamases. PCR with primers specific to metallo-P-lactamase (class B) and oxacillinase of D-ala carboxypeptidase family (class D of P-lactamase) gene sequences allowed to differentiate among “pseudomallei” group of Burkholderia species.
Key words: Burkholderia, P-lactamases, molecular typing, polymerase chain reaction.
Возбудители особо опасных инфекций - сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia Р-подкласса протеобактерий семейства Burkholderiaceae. В настоящее время род Burkholderia включает более 50 видов микроорганизмов и представляет собой довольно гетерогенную таксономическую группу, объединяющую сапрофиты, фитопатогены и патогены теплокровных животных. Характерным биологическим свойством патогенных буркхольдерий и близких им микроорганизмов является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений, что создает значительные трудности для эффективного лечения соответствующих заболеваний.
В геномах патогенных буркхольдерий первично аннотированы многочисленные последовательности Р-лактамаз классов А, В и D [7, 8]. Очевидно, что исследование данных детерминант важно как в плане более полного понимания механизмов антибиотикоустойчи-вости буркхольдерий, так и в аспекте совершенствования схем лечения вызываемых ими инфекций, генодиагностики и молекулярно-эпидемиологического мониторинга штаммов возбудителей.
Материалы и методы
Дизайн праймеров осуществлен на основе кодирующих последовательностей геномов Burkholderia, гомологичных известным генам Р-лактамаз, представленных в общедоступных генетических базах данных.
Принадлежность генов Р-лактамаз буркхольде-
рии к различным молекулярным классам оценена с помощью базы данных InterProScan (www.ebi.ac.uk/ Tools/InterProScan). Определение консервативных и вариабельных фрагментов сиквенсов проведено с использованием процедуры множественного выравнивания по алгоритму W.Clustal [10]. Консервативные аминокислотные мотивы ß-лактамаз анализировали средствами сервера TMHMM v. 2.0 (www.cbs.dtu.dk/ servises/TMHMM).
Подбор праймеров, комплементарных консервативным фрагментам нуклеотидных последовательностей генов ß-лактамаз, проведен с использованием программы FastPCR v. 6.1.72 (PrimerDigital Ltd.). Предварительная верификация полученных вариантов праймеров проведена на геномных сиквенсах бактерий с использованием сервиса PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast).
Для выделения ДНК использовались штаммы B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia и ряда гетерологичных видов микроорганизмов из коллекции ФКУЗ Волгоградский НИПЧИ. Культуры микроорганизмов выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24-48 ч при 37 °С. Для выделения геномной ДНК 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl (pH 7,2) плотностью 2-109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг/мл желатина, 0,9 % Nonidet P-40, 0,9 % Твин 20, 150 мкг/мл проте-иназы К), инкубировали при 65 °C 120 мин, прогревали при 96 °С 30 мин для инактивации фермента, центрифугировали (10000 об./мин, 1 мин) и хранили до использования при -20 °С.
Амплификацию проводили на приборе С1000
Характеристика сконструированных олигонуклеотидных праймеров для детекции и типирования генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий
Праймер Последовательность, 5’ - 3’ Генетическая мишень Локализация Размер ампликона, п.н.
S S -о -о ttcccgcgatccgcctgatga cttgttgccgagcatccatgc Ген ß-лактамазы класса А Burkholderia mallei 10247 (Genbank access. CP000547 локус BMA10247 A1040) 41-61 нуклеотид 700-720 нуклеотид 680
bm1F2 bm14R2 acgttcctcggcgcgacggaaac ccggatgatgtttcgagtagccgtg Ген ß-лактамазы класса В Burkholderia mallei ATCC 23344 (Genbank access. CP000011 локус BMA A0168) 10-32 нуклеотид 337-361 нуклеотид 352
bps1F3 bps1R3 acggcaattcctccattgcga ctcgtcagggttgcgtccggagt Ген ß-лактамазы класса В Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 локус BURPS1106B_2313) 9-29 нуклеотид 713-735 нуклеотид 727
bps1F4 bps8R4 cgcattcgttttgctgggttgcat tctgcagcgacgagccgatcca Ген ß-лактамазы класса D Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 локус BURPS1106B_2455) 27-50 нуклеотид 445-466 нуклеотид 440
bps3F5 bps8R5 tctgtggctgctgcgcgacgagat gcacagccagttcgcgagtccga Ген ß-лактамазы класса В Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 локус BuRPS1106B_A3704) 132-155 нуклеотид 299-321 нуклеотид 190
(«BioRad», США). Программа амплификации для всех пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб при 94 °С 5 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94 °С 30 с, отжиг праймеров 59,9 °С 30 с, удлинение цепи 72 °С 45 с) и финальной элонгации 72 °С в течение 1 мин.
Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 25 мкл. В состав реакционной смеси входили праймеры в конечной концентрации 15 пМ, 1 ед. DiaTaq ДНК-полимеразы и 1-ПЦР-буфер с дНтФ и MgCl2 (ИнтерЛабСервис, Россия). Анализируемые препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 1 мкл. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием.
Результаты и обсуждение
Выбор кодирующих последовательностей геномов Burkholderia, гомологичных генам Р-лактамаз был проведен на основе анализа девяти первично аннотированных геномов B. pseudomallei, B. mallei и близкородственного непатогенного вида B. thai-landensis (Genbank access. CP000011, CP000545, CP000547, CP000525, CP000572, CP000124, CP000570, BX571965, CP000085), а также 12 частично аннотированных геномов штаммов данных видов микроорганизмов, представленных в GenBank NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov) и базе данных геномных проектов J. Craig Venter Institute (http://gsc.jcvi.org/projects).
В результате было выбрано 118 кодирующих последовательностей Р-лактамаз, формирующих 5 групп гомологии и относящихся к молекулярным классам А
(1 группа), В (3 группы) и D (1 группа). Далее было сгенерировано 42 пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным фрагментам генов Р-лактамаз, входящих в данные группы гомологии. Анализ специфичности всех предварительных вариантов олигонуклеотидов in silico в PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) позволил сформировать набор из 5 пар олигонуклеотидов, комплементарных фрагментам генов классов А, В и D буркхольдерий и имеющих практически идентичную температуру отжига (таблица).
Результаты ПЦР-детекции последовательностей Р-лактамаз различных молекулярных классов в препаратах геномной ДНК штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа, родственных видов буркхольде-рий и гетерологичных микроорганизмов приведены на рис. 1. Фрагмент гена penA размером 680 п.н. (праймеры bm1F1-bm4R1) обнаружен в геномах всех исследованных штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis и B. cepacia. Специфический участок гена металло-Р-лактамазы класса В (праймеры bm1F2-bm14R2) размером 352 п.н. обнаружен также только у видов буркхольдерий. Фрагмент гена металло-Р-лактамазы класса В (праймеры bps1F3-bps1R3) размером 727 п.н. отмечен только в штаммах B. pseudomallei и B. mallei. Вариант металло-Р-лактамазы (праймеры bps3F5-bps8R5, размер ампликона 190 п.н.) обнаруживается как у видов буркхольдерий, так и видов отдаленной гетерологии (V cholerae, P aeruginosa). Ген Р-лактамазы класса D (праймеры bps1F4-bps8R4, размер ампликона 440 п.н.) был детектирован в в исследуемых штаммах B. pseudomallei и B. thailandensis.
А В
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 М
С л D
-г-
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М
Рис. 1. Детекция генов ß-лактамаз классов А, B и D буркхольдерий в ПЦР с праймерами bm1F1-bm4R1 (Л), bm1F2-bm14R2 (B), bps1F3-bps1R3 (C) и bps1F4-bps8R4 (D):
Штаммы: 1 - B. pseudomallei 56830; 2 — B. pseudomallei 100;
3 - B. pseudomallei 114; 4 - B. pseudomallei 135;
5 - B. pseudomallei 139; 6 - B. pseudomallei C141;
7 - B. thailandensis E264; 8 - B. thailandensis E299;
9 - B. mallei Ц-54; 10 - B. cepacia 25416; 11 - P. aeruginosa 215; 12 - V. cholerae О139 Bengal; 13 - V cholerae О1 El Tor B-139; М - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100-1000 п.н.).
Рис. 2. Детекция генов р-лактамаз классов B и D в мультило-кусной ПЦР с праймерами bps1F3-bps1R3, bps1F4-bps8R4 и bm1F2-bm14R2:
A: 1 - B. pseudomallei 56830; 2 - B. thailandensis E264; 3 - B. mallei Ц-5; 4 - B. cepacia 25416; 5 - B. pseudomallei 139; 6 - B. thailandensis E299;
7 - B. mallei 10230; 8 - B. cepacia 3189.
B: 1 - B. cepacia 323; 2 - B. cepacia 506; 3 - B. cepacia 1934;
4 - B. cepacia 25416; 5 - B. cepacia 3189; 6 - B. cepacia 8235;
7 - B. cepacia 8237; 8 - B. cepacia 8240; 9 - B. pseudomallei CM1;
10 - V cholerae O139 Bengal; 11 - B. pseudomallei 56830;
12 - B. thailandensis E264; 13 - B. mallei Ц-5; 14 - B. cepacia 25416;
М - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100-1000 п.н.)
Учитывая то обстоятельство, что праймеры, специфичные генам металло-Р-лактамаз (bps1F3-bps1R3, bps1F4-bps8R4) и оксациллиназ (bm1F2-bm14R2), продемонстрировали возможность дифференциации между видами буркхольдерий, относящихся к группе «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei, B. thailand-ensis), представлялось перспективным использовать их в формате мультилокусной ПЦР. Для постановки ПЦР в мультилокусном варианте данные три пары праймеров были использованы в эквимолярном количестве (по 5 пМ).
Результаты ПЦР (рис. 2, A) продемонстрировали одновременную детекцию трех генетических ло-кусов с праймерами bps1F3-bps1R3, bps1F4-bps8R4 и bm1F2-bm14R2 в штаммах B. pseudomallei, двух ло-кусов с праймерами bps1F4-bps8R4 и bm1F2-bm14R2 в штаммах B. thailandensis, двух локусов с праймерами bps1F3-bps1R3 и bm1F2-bm14R2 в штаммах B. mallei и 1 генетического локуса с праймерами bm1F2-bm14R2 в штаммах B. cepacia. Постановка мультилокусной ПЦР на широком наборе штаммов
B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis и штаммов различных геномоваров cepacia-комплекса подтвердила возможность дифференциации между различными видами рода Burkholderia по набору генов Р-лактамаз классов B и D (рис. 2, B).
Антибиотики р-лактамной группы, в частности, цефалоспориновые и карбапенемовые соединения, стандартно используются в существующих схемах экстренной и пролонгированной терапии мелиоидоза и сапа. Опыт их применения в лечении больных мелиоидозом демонстрирует заметное число случаев развития резистентности возбудителя в ходе лечения и фатального исхода заболевания [2, 4, 5, 12]. Участие и роль собственных р-лактамаз мелиоидозного и сапного микробов в развитии устойчивости к антибиотикам р-лактамной группы чрезвычайно мало освещены в современной научной периодике. Сообщалось, что возрастание резистентности B. pseudomallei к Р-лактамам может быть обусловлена как расширением спектра ферментной инактивации, так и снижением чувствительности лактамаз микроба к ингибиторам, например клавулановой кислоте [3, 11].
Ранее были сконструированы праймеры, использованные для амплификации, последующего клонирования и функциональной характеристики
генов пенициллиназы (penA) и оксациллиназы (oxa) возбудителя мелиоидоза [3, 6, 9]. Предложенные авторами олигонуклеотиды фланкировали полную кодирующую последовательность соответствующих генов и использовались для их клонирования и оценки характера мутационных изменений при формировании резистентности к ампициллину, оксациллину и цефтазидиму. Единого набора олигонуклеотид-ных праймеров для детекции последовательностей Р-лактамаз классов А (пенициллиназы), В (металло-Р-лактамазы) и D (оксациллиназы, цефалоспорина-зы) у патогенных видов рода Burkholderia до настоящего времени не разработано.
Результаты, полученные в настоящей работе, демонстрируют перспективность использования сконструированного набора праймеров для исследования распространенности р-лактамаз молекулярных классов А, В и D в геномах штаммов B. pseudomallei,
B. mallei и родственных буркхольдерий, а также разработки систем генетической паспортизации штаммов возбудителей с целью решения практических задач генной диагностики и молекулярного типирования.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ambler R. The structure of B-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 1980; 289:321-31.
2. Chaowagul W. Recent advances in the treatment of severe melioidosis. Acta Trop. 2000; 74:133-7.
3. Cheung T., Ho P., Woo P., Yuen K., Chau P. Cloning and expression of class A P-lactamase gene blaABPS in Burkholderia pseudomallei. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46:1132 -5.
4. DanceD.A., Wuthiekanun V., Chaowagul W., Suputtamongkol Y., White N.J. Development of resistance to ceftazidime and co-amoxiclav in Pseudomonas pseudomallei. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28:321-4.
5. Dance D.A., Wuthiekanun V., Chaowagul W., White N.J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. Antimicrob. Chemother. 1989; 24:295-309.
6. Ho P., Cheung T., Yam W., Yuen K. Characterization of a laboratory-generated variant of BPS p-lactamase from Burkholderia pseudomallei that hydrolyses ceftazidime. Antimicrob. Chemother. 2002; 250:723-6.
7. Holden M.T., Titball R.W., Peacock S.J., Cerdeno-Tarraga A.M., Atkins T. et al. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei. Proc. Natl Acad. Sci USA. 2004; 101:14240-5.
8. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome. Proc. Natl Acad. Sci USA. 2004; 101:14246-51.
9. Niumsup P., Wuthiekanun V. Cloning of the class D P-lactamase gene from Burkholderia pseudomallei and studies on its expression in ceftazidime-susceptible and resistant strains. J. Antimicrob. Chemother. 2002; 50:445-55.
10. Thompson J., HigginsD., Gibson T. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994; 22:46/3-80.
11. Tribuddharat C., Moore R.A., Baker P., Woods D.E. Burkholderia pseudomallei class A beta-lactamase mutations that confer selective resistance against ceftazidime or clavulanic acid inhibition. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47:2082-7.
12. White N.J., Dance D.A., Chaowagul W., Wattanagoon Y., Wuthiekanun V., Pitakwatchara N. Halving of mortality of severe melioidosis by ceftazidime. Lancet. 1989; 2(8665):697-701.
Authors:
Romanova A.V., Zakharova I.B., Zamaraev V.S., Viktorov D.V. Volgograd Research Anti-Plague Institute. 7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131, Russia. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Об авторах:
Романова А.В., Захарова И.Б., Замараев В.С., Викторов Д.В. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Поступила 22.11.11.
