CC BY
183
УДК 577.114.083 (047.31)
А.В. Фролов, В.Н. Беляев, Н.В. Бычин
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО СВОЙСТВ
Одним из приоритетных направлений развития современной фармакологии является получение сложных лекарственных композиций, содержащих биологически активные вещества, в том числе изготовленные на основе технологии иммобилизации. Под иммобилизацией понимается химическое связывание, включая конъюгирование, биологически активного вещества со вспомогательными компонентами, например, полимерным носителем или органическим соединением. В результате конюгирования лекарственного препарата с природным биологически значимым полимером возникают такие эффекты как увеличение активности, повышение избирательности и про-лонгированности действия, снижение токсичности и минимизация побочных эффектов. Совокупный результат выражается в повышении эффективности и безопасности лечения.
Одним из биологически значимых полимеров является декстран - полисахарид микробного происхождения, растворы которого составляют основу современных кровезаменителей. Декстран и большинство его производных не токсичны, не антигенны и способны к биодеградации. Иммобилизация лекарственных субстанций на производных декстрана позволяет конструировать пролекарства пролонгированного действия с необходимым балансом липофильно-гидрофильных свойств.
Разработкой активных производных декстра-нов и исследованием процессов их применения в биотехнологиях проводилось рядом ведущих научных центров России. Способность декстранов изменять свойства лекарственных веществ изучалась в научном центре клинической и экспериментальной медицины, под руководством Шкуру-пия В.А. Полученный конъюгат противотуберкулезного препарата - изониазида с декстраном обладает способностью селективно восстанавливать инфицированные Micobacterium tuberculosis фагоциты. Для придания изониазиду селективной фа-готропности его конъюгируют с полисахаридной матрицей - декстраном. Проведенные исследования данного конъюгата in vitro и in vivo показали не только его высокую антимикобактериальную активность, но и значительное снижение токсичности, относительно исходного изониазида.
Для обеспечения эффективного связывания физиологически активных веществ с декстранами необходимо перевести этот полисахарид в химически активную альдегидную форму [1]. Исследования показали, что альдегидные группы способны в мягких условиях образовывать азометино-
вую связь с первичными аминогруппами большинства биологически активных веществ [2], что делает их перспективными в технологиях иммобилизации.
Получение диальдегидной (СбН8О5) - химически активной формы декстрана (СбНюО5) возможно при его селективном окислении. Объектом окислительного воздействия становятся концевые редуцирующие группы декстрана. Поскольку реакции окисления полисахаридов, как правило, протекают в кислой среде, то они могут сопровождаться частичной гидролитической деструкцией полимера. Если проводить процесс окисления декстрана в жестких условиях, вначале на образуется смесь альдегидные, кетонных и карбоксильных групп в структуре полимерной цепи. В последующем произойдет деструкция пираноз-ных звеньев с разрывом в цикле кислородной или С-С связей и образованием так называемых уро-новых кислот - глюкуроновой или альдоновых.
Для получения диальдегиддекстранов окисление проводят в разбавленных растворах с применением в качестве окислителей пероксида водорода в условиях радиационно-химического активирования окислительной реакции, а также солей йодной кислоты или перманганате калия.
Соединения йода не полностью удаляются из окисленных декстранов, что делает его токсичным и снижает потенциал использования. Радиационно-химический способ окисления декстрана обладает преимуществами перед периодатным - он технологичен, не использует токсичных компонентов, однако окисленные декстраны, полученные данным способом нестабильны при хранении. В этой связи актуальна разработка промышленного способа окисления декстрана, в результате реализации которого будет выпускаться продукт, отличающийся высокой биосовместимостью и низкой цитотоксичностью.
В настоящее время в ОАО «ФНПЦ «Алтай» в рамках государственного контракта № 16.522.12.2001 министерства образования и науки РФ ведутся работы по созданию опытнопромышленного производства окисленных декс-транов. При отработке промышленного способа получения, возникает задача постоянного контроля показателей качества получаемого продукта. С этой целью необходимо выявить основные физико-химические свойства диальдегиддекстра-на и методы их определения.
Исследование термических свойств диальде-гиддекстрана (ДАД) и исходного сырья - реопо-лиглюкина и декстрана-40 проведены на термо-
Таблица 1. Термические свойства декстранов и диальдегиддектранов
Образец Потеря массы, % В интервале температур
25-140 оС 140-240 оС 240-400 оС
Декстран 40 8,4 0 70,2
Декстран 70 6,7 0 75,5
Реополиглюкин 9,1 0 68,3
ДАД-ОР-1 11,3 0 63,6
ДАД-ОР-2 10,0 0 62,9
ДАД-ОР-3 8,9 0 62,0
ДАД-ОР-4 7,4 0 60,1
ДАД-ОД-40-і 7,5 0 66,5
Рис.1. Характерные кривые для образца Декстрана-40
TGA
DTA
UV
0.00
-5.00
-10.00
100.00
200.00 Temp [С]
300.00
400.00
гравиметрическом анализаторе БТв-бО. При отработке методики анализа были подобраны условия оптимальные для получения воспроизводимых результатов.
Исследовались: сырье - Декстран 40, Декстран 70 (производство КНР), Реополиглюкин (сухой остаток, выделенный из раствора) и 5 образцов ДАД, полученные при отработке режимов технологического процесса на реополиглюкине (маркировка ДАД-ОР) и декстране-40 (ДАД-ОД, соответственно). Образцы отличались технологическими режимами синтеза.
Термограммы (БТЛ- и БТв- кривые) декс-трана и диальдегиддекстрана представлены на рисунках 1,2. БТв-кривые свидетельствуют об идентичности термограмм декстрана и диальде-гиддекстрана. Проведенный анализ кривых показал, что существует три интервала температур, характерные для терморазложения декстрансо-держащих материалов (табл. 1).
В низкотемпературной области в интервале 20
до 140ОС происходит эндотермический процесс разложения и удаления легколетучих компонентов - воды и продуктов окисления.
В интервале температур 140 - 2400С не наблюдается видимых изменений массы и тепловых эффектов, что свидетельствует от термостойкости структуры материалов - это интервал термостабильности декстранов и их производных.
Начиная с 2400С и до 4000С наблюдается резкое уменьшение массы образцов, сопровождаемое поглощением тепла. В зависимости от структуры образца на кривой БТЛ фиксируется один или серия (от двух до четырёх) эндотермических пиков. Особенностью процесса разложения декстра-на и его производных является образование вспененной, пористой углеродной капли в качестве промежуточного продукта. Поэтому кривая тепловых эффектов отражает наложение двух процессов, протекающих параллельно-
последовательно - это плавление биополимера и его терморазложение. Разложение пористой кап-
Рис. 2. Характерные кривые для образца Диальдегиддекстрана Таблица 2. Составы зольных остатков экспериментальных образцов
Образец/элемент* S Ca K Fe Mn
Декстран 40 36 37 18 0,5 8
ДАД - ОД- 40-1 48 49 0,2 0 7,5
*- интегральная интенсивность проявления
ли происходит с образованием газообразных продуктов и зольного остатка коричнево-желтого цвета.
Элементный анализ зольного остатка образцов Декстрана-40 и ДАД - ОД-40-1 (таблица 2) показал наличие серы, кальция, калия, железа и марганца.
Для проведения исследований биологических свойств экспериментальных образцов использовались тест-штаммы IV группы патогенности Bacillus cereus ATCC 10702 - пищевой токсико-инфекции, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P -пищевой токсикоинфекции, септицемии, пневмонии. Исследованию процессов развития патогенных микроорганизмов подвергались декстраны исходные и прошедшие окисление в лабораторных условиях.
Отбор навесок и приготовления исходного разведения проводили согласно ГОСТ 26669. Навеску вещества 1г растворяли в 9 см3 физиологического раствора, приготовленного по ГОСТ 10444.1. 1г (см3). Полученный раствор смешивали с расплавленной питательной средой № 1 ГРМ (для выращивания бактерий), приготовленную по ГОСТ 10444.1. На скошенную поверхность среды в 24 параллельные пробирки бактериологической петлей высеивали тест-штаммы Bacillus cereus ATCC 10702, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P. Культивирование микроорганизмов вели по ГОСТ 26670. Посевы инкубировали 24 часа при темпе-
ратурах - 240С, 300С, 370С, 440С. По завершению инкубирования на агаризованных средах отслеживали рост характерных колоний.
Для доказательства анаэробной ферментации глюкозы культуры со скошенного агара, высеяли уколом в питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой, приготовленную по ГОСТ 10444.8. Посевы инкубировали при температуре 300С в течение 24 час.
Для определения способности В. сегеш ферментировать манит, культуры со скошенного агара пересеяли на питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом, приготовленную по ГОСТ 10444.8. Посевы термостати-ровали при температуре 300С в течение 24 час.
В результате исследований биологических свойств было определено, что исходные декстра-ны, как и продукт их окисления - диальдегид-декстран обладают антимикробной активностью, что подтверждается примененной последовательностью стандартных методов испытаний данных образцов, согласно ГОСТ 10444.2 и ГОСТ 10444.8.
Таким образом, в результате проведенной работы можно сделать следующие выводы:
1) термогравиметрический метод анализа декстранов и их производных полезен в качестве экспресс - метода характеризации сырья при его входном контроле и метода аттестации готового диальдегиддекстрана;
2) оценка на соответствие материалов требованиям паспорта качества и технологического регламента может производиться по следующим показателям:
- температуре разложения материала, которая зависит от молекулярной массы декстрана и доли в нем зольных примесей;
- потере образцом массы в интервале температур 20 - 1400С, что характеризует долю летучих компонентов и воды в его составе - эти данные необходимы для корректировки массы навески исходного материала в технологическом процессе получения диальдегиддекстрана. Учет доли летучих при расчете материальных потоков технологического процесса обеспечит повышение техно-
логического выхода целевого продукта;
3) при увеличении температуры эксперимента до 6000С можно осуществлять экспресс- контроль доли зольных примесей в исходных материалах;
4) биологические исследования свойств диальдегиддектрана показали сохранение антимикробной активности продукта после окисления перманганатом калия;
5) биологически активная матрица диальде-гиддекстрана в перспективе может обеспечить получение широкой серии отечественных препаратов нового поколения, обладающих мембрано-тропными свойствами и пролонгированным действием.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Козинер, В.Б., Механизм действия полиглюкина./ В.Б. Козинер, Н.А. Федоров. - М.: Изд. «Медицина», 1974. - 192 с.
2. Влияние типа химической связи между производными декстрана и антибиотиком на бактериоста-тическую активность полимерного соединения / Снежко В. А. [и др.] //Антибиотики.- 1972.- Т. 17.- №1.-С.48-52.
□ Авторы статьи:
Фролов
Александр Валерьевич, канд.техн.наук., старший научный сотрудник (ОАО «ФНПЦ «Алтай»). Тел. (3854)305861
Беляев
Вячеслав Николаевич, канд.техн.наук, доцент, начальник лаборатории ((ОАО «ФНПЦ «Алтай») Тел. (3854)305861
Бычин
Николай Валерьевич, руководитель группы (ОАО «ФНПЦ «Алтай»).
Email:
lab.nanodiamond@rambler. ru.
