CC BY
86
ционными данными (4,8±1,2 см) по данным трансторакального ЭхоКГ исследования.
Таким образом, отсутствие фибрилляции предсердий через 1 год после торакоскопической радиочастотной аблации устьев легочных вен составила 80%, возврат фибрилляции предсердий составил 20%.
Литература
1. Бокерия, Л.А. Здоровье населения в РФ и хирургические болезней сердца и сосудов в 2010 г. / Л.А. Бокерия, Р.Г. Гудкова. - М.: Изд-во НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2010. - 113 с
2. Наш опыт хирургического лечения фибрилляции предсердий в сочетании с коррекцией порока митрального клапана./ Л.А. Бокерия [и др.]// Грудная и сердечно-сосудистая хирургия.-2003.- №6.- С. 12-18.
3. Бокерия, Л.А. Хирургическое лечение фибрилляции предсердий: опыт и перспективы развития / Л.А. Бокерия, А.Ш. Ревишвили, М.С. Ольшанский // Грудная и сердечнососудистая хирургия.- 1998.- № 1.- С. 7-14
4. Бокерия, Л.А. Современные подходы к нефармакологическому лечению фибрилляции предсердий / Л.А. Бокерия, А.Ш. Ревишвили // Вестник аритмиологии.- 2006.- 45.- С. 5-16.
5. Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии. Современное состояние проблемы / Л.А. Бокерия [и др] // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия.- 2002.- № 1.- С. 22-26.
6. Результаты хирургического лечения хронической фибрилляции предсердий у больных с пороками митрального клапана / Л.А. Бокерия// Анналы аритмологии.- 2004.- № 1.- С. 64-70.
7. Cardiac rhythm and conduction disturbances in patients undergoing mitral valve surgery / G.K. Brodel [et al.]//. Cleve Clin J Med.- 1991.-58.- P. 397-399.
8. Connolly, S.J. Preventing stroke in patients with atrial fibri tion: current treatments and new concepts / S. J. Connolly, J. Amer. Heart.- 2003.- Vol 145.- P. 418-423.
9. Cox, J.L. Current status of the maze proedure for the treatment of atrial fibrillation / J.L. Cox // Seminars in Thoracic and Car-diovasc Surg 2000; 12:15-19.
10. Cox, J.L. The surgical treatment of atrial fibrillation: summary of the current concepts of mec hanisms of atrial flutter and atrial fibrillation / J.L. Cox, R.B. Schuessler, J.P. Boineau // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.- 1991.- Vol. 101.- P. 402-405.
11. Five-year experience with the maze procedure for atrial fibrillation / J.L. Cox [et al.]// Ann. Thorac. Surg.- 1994.- Vol. 56.- P. 814-824.
THORACOSCOPIC RADIO-FREQUENCY ABLATION OF LUNG VIEN
ORIFICES AT TREATING PATIENTS WITH ATRIAL FIBRILLATION
A.N. LISHCHUK, A.N. KOLTUNOV, A.N. KORNIENKO 3rd Central Military Clinical Hospital after A.A. Vishnevsky
Thoracoscopic surgical ablation is an effective method of treating atrial fibrillation at patients with isolated arrhythmia. At patients with isolated fibrillation of auricles it is expedient to carry out thora-coscopic radio-frequency ablation, as this method of treatment is of low invasiveness and highly effective. Researches in this direction proceed.
Key words: thoracoscopic surgical ablation, atrial fibrillation, low-invasive method in cardiosurgery.
УДК 615.074
МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ФЛУОРЕСЦЕИНОМ ДЕКСТРАНОВ И ПОЛИАЛЬДЕГИД ДЕКСТРАНОВ
B.C. МЕДВЕДЕВ, А.В. ТРОИЦКИЙ, Е.П. ГУЛЯЕВА, Н.С. ЗАЙЦЕВА, В.А. ШКУРУПИИ, В.Н. БЕЛЯЕВ*
Предложен метод мечения флуоресцеином конъюгатов полисахаридов - декстранов и полиальдегид декстранов для визуализации их захвата в клетках мишенях. Полученные меченные флуоресцеином конъюгаты декстранов и полиальдегид декстранов не содержали свободного флуоресцеина, что подтверждено методами капиллярного электрофореза и ультрафиолетовой спектрофотомерии.
Ключевые слова: декстран, полиальдегиддекстран, флуоресцентно меченный, визуализация клеточного захвата.
В фармацевтических исследованиях конъюгатов полисахаридов всё чаще применяют их флуоресцентно меченные производные. Применение флуоресцентной метки, при доклинических испытаниях препаратов позволяет визуализировать процессы их захвата в клетках. Метод получения меченого флуоресцеином декстрана основан на непосредственном взаимодействии декст-рана с флуоресцеин изотиоционатом (FITC). Для включения флуоресцентной метки в состав полиальдегид декстранов (ПАД) необходимо проводить многостадийный процесс, включающий в себя этап защиты альдегидных групп, с последующим введением FITC и снятием защиты [1]. Исследования в нашей лаборатории связанны с биологическими эффектами полисахаридов и их производных - декстранов и ПАД. Установлено, что ПАД обладают высокой биосовместимостью и могут быть использованы в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ, в том числе, известных фармацевтических субстанций, с целью, в том числе, обеспечения их адресной доставки в различные клетки-мишени и их компартменты [2,3].
В основу разработки методики включения флуоресцентной метки в ПАД нами были использованны ранее известные методики активации декстрана и получения его коньюгатов [4,5], с использованием 1,1’-карбонилдиимидазола.
Цель исследования - разработать универсальный и простой метод получения биосовместимых меченных флуоресцеином декстранов и ПАД для обеспечения визуализации их доставки в клетки мишени.
Материалы и методы исследования. Использовали полисахариды - декстраны (Mr=35000, 60000 Да), 1,1’-
карбонилдиимидазол (Sigma), флуоресцеин свободный (Fluka). ПАД получали по ранее разработанной методике [6], в качестве окислителя использовали перманганат калия. Степень чистоты ПАД определяли спектрофотометрически на приборе СФ-2000.
Получение меченного флуоресцеином декстрана или ПАД. Навеску сухого декстрана или ПАД, из расчета для приготовления 10 % водного раствора, растворяли в 25 ммолярном боратном буфере с рН=9,0. К приготовленному раствору декстрана или ПАД прибавляли флуоресцеин, из расчета 0,0177 г. (5*10-5 моль) на 1 г. декстрана (или ПАД). После растворения флуоресцеина в раствор вносили навеску 1,1’- карбонилдиимдазола из расчета
0,047 г. (3*104 моль) на 1 г. декстрана или ПАД, перемешивали 10 минут и оставляли реакционную массу при комнатной температуре, в защищенное от света место, на 18-20 часов.
Очистка меченного флуоресцеином декстрана или ПАД от непрореагировавщего флуоресцеина. Растворы меченных флуоресцеином декстранов или ПАД фильтровали через бумажный фильтр Enderol filter № 3, Binzer. Очистку реакционной массы от непрореагировавшего флуоресцеина и низкомолекулярных побочных продуктов проводили методом ультрофильтрации на мембранных модулях Vivaflow 200 с параметром сепарации 10 кДа, для декстрана и ПАД с Mr = 60 кДа, и 5 кДа для декстрана и ПАД с Mr = 35 кДа. Поток концентрата 8-10 мл/мин. Процесс очистки включал в себя 27 циклов полного концентрирования. Степень очистки реакционной массы контролировали спектрофотометрически, в режиме получения УФ-спектра, в области 300 -600 нм. На рисунке 1 приведен пакет УФ-спектров соответствующий 13, 18, 22 и 27 циклам концентрирования для декстрана с Mr = 60 кДа меченного флуоресцеином. На рисунке 2 приведен пакет УФ-спектров соответствующий 6, 12 и 18 циклам концентрирования для декстрана с Mr = 35 кДа меченного флуоресцеином. Буквами «К» отмечены концентрируемые растворы, содержащие меченные флуоресцеинеом ПАД, и буквами «Ф» растворы фильтратов, содержащие не прореагировавший флуоресцеин и низкомолекулярные продукты.
Проверку степени чистоты конечного продукта проводили методом капиллярного электрофореза на системе капиллярного электрофореза «Капель 105М». Все электрофореграммы были записаны в одинаковых условиях - 25 ммолярный боратный буфер, pH 9,5; напряжение 20 кВ, ввод пробы 10 мбар х 15 сек, ^=202 нм, положительная полярность. Для анализа степени чистоты полученных конъюгатов были взяты концентраты реакционной массы содержащие флуоресцеин и ПАД с Mr = 60 кДа, а так же раствор содержащий смесь флуоресцеина, карбонилими-дата флуоресцеина и ПАД с Mr = 60 кДа.
* Государственное Учреждение Научный Центр Клинической и Экспериментальной Медицины, г. Новосибирск; ОАО Федеральный научнопроизводственный центр "Алтай"
Рис. 1. УФ-спектры концентратов и фильтратов - результатов процесса очистки ПАД, меченных флуоресцеином с Мг = 60 кДа.
----------т--------1---------1---------1---------т---------1
300 400 500 600
Длина волны,?, (пт)
Рис.2. УФ-спектры концентратов и фильтратов - результатов процесса очистки ПАД меченных флуоресцеином с Mr = 35 кДа.
Нрсмя иихола. т (сск)
Рис 3. Электрофореграммы растворов: 1) флуоресцеина, 2) флуоресцеина и карбонилимидата флуоресцеина, 3) фильтрат реакционной массы с ПАД Мг = 60 кДа меченным флуоресцеином на 12 цикле ультрафильтрации,
4) фильтрат реакционной массы с ПАД Мг = 60 кДа меченным флуоресцеином на 21 цикле ультрафильтрации, 5) фильтрат реакционной массы с ПАД Мг = 35 кДа меченным флуоресцеином на 12 цикле ультрафильтрации, 6) фильтрат реакционной массы с ПАД Мг = 35 кДа меченным флуоресцеином на 18 цикле ультрафильтрации.
Рис. 4. ПАД меченный флуоресцеином в перитонеальном макрофаге мыши
Результаты и их обсуждение. Проведённые физикохимические исследования образцов меченных флуоресцеином декстранов и ПАД подтверждают наличие в их структуре молекул флуоресцеина и их чистоту.
Так, на приведённых выше рисунках 1 и 2 интенсивность
максимумов в спектрах К13 - К27 и К6 - К18 соответственно, в области 491 - 498 нм снижается, что свидетельствует о значительной скорости процесса очистки реакционной массы от не прореагировавшего флуоресцеина. Малое значения максимумов для спектров Ф27 на первом рисунке и Ф18 на втором, показывают почти полное отсутствие флуоресцеина в фильтратах и свидетельствуют о возможности окончании процесса отмывки.
Для точного определения степени чистоты полученных ПАД меченных флуоресцеином, методом капиллярного электрофореза были проанализированы концентраты: меченных флуоресцеином ПАД К12 (электрофареграмма № 3) и К21 (электрофа-реграмма № 4), а так же ПАД с Mr = 60 кДа, К12 (электрофареграмма № 5) и К18 (электрофареграмма № 6) для ПАД с Mr = 35 кДа, 0,24 ммолярный раствор сравнения флуоресцеина в 0,25 ммолярном боратном буфере (электрофареграмма № 1). Электрофореграммы перечисленных растворов представлены на рисунке 3. Как видно из электрофореграммы №1, в данных условиях, пик принадлежащий флуоресцеину появляется на 19 минуте (отмечен буквой «а»). На второй электрофореграмме представлена смесь 0,15 ммоль карбонилимидата флуоресцеина (отмечен буквой «b») и 0,09 ммоль флуоресцеина в боратном буфере, определявшиеся, соответственно, на 6,5 и 19 минутах. Отсутвие пика в области 19 минуты на электрофореграммах №4 и №6 соответствующих концентратам ПАД с Mr = 60 кДа и Mr = 35 кДа меченных флуоресцеином после отчистки методом ультрафильтрации, указывает на отсутствие не связанного с ПАД флуоресцеина в конечном продукте.
В современных исследованиях препаратов на основе производных полисахаридов, значительную роль уделяют визуализации их локализации в клетках in vitro. Применение 1.1’-карбонилдиимидазола для связывания ПАД с флуоресцеином позволило проводить процесс получения меченных флуоресцеином полисахаридов в одну стадию без выделения побочных продуктов и использования дорогостоящих реактивов, с получением конечных продуктов, не содержащих цитотоксичные компоненты в своем составе.
Полученные по разработанной нами методике декстраны и ПАД меченные флуоресцеином были применены для визуализации процессов их захвата макрофагами с применением флуоресцентной микроскопии, что позволяет более точно и наглядно определять механизмы их транспорта. Топографию распределения меченных ПАД в клетке исследовали на флуоресцентном микроскопе AxioObserver D.1. На рис. 4 представлена фотография перитонеального макрофага мыши захватившего ПАД меченные флуоресцеином. Отчетливо видны меченные флуоресцеином ПАД находящиеся в пинолизосомах макрофага (указанны на снимке стрелками).
Выводы. Разработан простой и универсальный метод получения декстранов и ПАД, меченных флуоресцеином исключающий необходимость стадии защиты альдегидных групп. Таким образом, весь многостадийный процесс получения флуоресцентномеченого ПАД из соответствующего декстрана можно проводить без извлечения промежуточных продуктов (one pot reaction).
Литература
1. Usov, D. Dextran coating for aggregation control of layer-by-layer assembled polyelectrolyte microcapsules / D. Usov, G.B. Sukhorukov// Langmuir Art.- 2010.- Vol. 26.- Iss. 15.- P. 1257512584.
2. Эффекты молекулярно-наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты, на перитонеальные макрофаги in vitro /В.А. Шкурупий [и др.] // 2008.- № 11.- С. 563-567.
3. Фагоцитоз макрофагами молекулярно-наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты / В.А. Шкурупий [и др.] // 2009.- № 12.- С. 633-636.
4. Liebert, T. Nanoparticles on the basis of highly functiona-lized dextrans / T. Liebert, S. Hornig, S. Hesse, T. Heinze// J. Am. Chem.- Soc. 2005.- Vol. 127.- P. 10484-10485.
5. Liebert, T. F. Tailored cellulose Esters: syntesys and structure determenatio / T.F. Liebert, T. Heinze // Biomacromolecules.-2005.- Vol. 6.- P. 333-340.
6. Патент №011718, ЕПВ, «Способ получения диальде-гиддекстрана», 28.04.2009
THE METHOD OF PRODUCING DEXTRANS LABELLED WITH FLUORESCEIN AND POLYALDEHYDE DEXTRANS
V.S. MEDVEDEV, A.V. TROITSKY, YE.P. GULYAEVA,
N.S. ZAITSEVA, V.A. SHKURUPIY, V.N. BELYAEV
Research Center of Clinical and Experimental Medicine, Siberian Division of the Russian Academy of Medical Sciences
The method for fluorescein labelling with polysaccharide conjugates such as dextrans and dextran polyaldehyde (DPA) to visualize their capture in target cells is offered. The obtained labelled with fluorescein dextran conjugates and DPA did not contain free fluorescein, which was proved by methods of capillary electrophoresis and ultra-violet spectrometry.
Key words: dextran, dextran polyaldehyde, fluorescein labeled, visualization of cell capture.
УДК 616.5-001.17-06:616-001.36]616.1-018.74-07(045)
МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ПРИ ОЖОГОВОМ ШОКЕ
А.Ю.БОЖЕДОМОВ*, В.В.МОРРИСОН*, Н.Б.ЗАХАРОВА*,
Н.В. ОСТРОВСКИЙ**
В статье представлены результаты исследования уровней маркеров повреждения эндотелия сосудов (фактор роста эндотелия сосудов, моноцитарный хемоаттрактантный протеин, циркулирующие эндотелиальные клетки, эндотелии) у больных в состоянии ожогового шока различной тяжести. Выявлено существенное повышение концентрации данных факторов, зависящее от тяжести ожогового шока. Установлено, что они являются ранними и значимыми биомаркерами повреждения эндотелия, и имеют большое значение для определения прогноза у этой категории больных.
Ключевые слова: ожоговый шок, эндотелий, синдром системного воспалительного ответа.
Ожоговый шок является одним из наиболее опасных периодов ожоговой болезни. Нарушения микроциркуляции при ожоговом шоке являются основой формирования полиорганной недостаточности и сепсиса. При термической травме централизация кровообращения в первую очередь приводит к ишемическому поражению эндотелиальной выстилки сосудов на периферии, что впоследствии ведет к нарушению кислородного и энергетического обмена в органах и тканях и является фактором риска для развития в последующем синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [2,8].
В связи с этим изучение факторов, характеризующих повреждение эндотелия в период ожогового шока, может помочь в выделении больных c риском развития синдрома полиорганной недостаточности.
В последнее время для оценки поражения эндотелия при различных патологических состояниях используют определение различных биологических маркеров, характеризующих функциональное состояния эндотелиальной выстилки сосудов.
Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) является одним из самых высокочувствительных маркеров гипоксического поражения эндотелия при СПОН и сепсисе. Основным механизмом запуска синтеза ФРЭС является снятие кислородного блока экспрессии фактора-1, индуцируемого при гипоксии (HIF-1). Моноцитарный хемоаттрактантный протеин (МСР-1) также является важным фактором поражения эндотелия. Он вырабатывается в клетках ретикулоэндотелиальной системы при различных состояниях, сопровождающихся повышением содержания провос-палительных цитокинов в крови. Повышенный уровень ФРЭС и МСР-1 коррелирует с тяжестью синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) и свидетельствует о нарушении функции эндотелия [9,11].
Прямым маркером повреждения эндотелия является повышение в крови числа десквамированных циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК). Их количество растет при многих состояниях, сопровождающихся поражением сосудистого эндотелия (сердечно-сосудистая патология, заболевания органов дыхания, суставов, хирургическая патология органов брюшной полости). Этот
ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразви-тия РФ, 410012, г.Саратов, ул. Большая Казачья,112, тел. 8-8452-51-16-14, e-mail: morrison@sgmu.ru
Саратовский центр термических поражений (МУЗ «Городская клиническая больница №7), 410005, г.Саратов, ул. Соколовая, 306, тел. 8-8452-3912-63, e-mail: gb7@list.ru.
показатель - один из самых объективных показателей поражения сосудистого эндотелия, он свидетельствует об активации апоптоза или развитии некротических процессов в нем [4,6,7].
Уровень высокочувствительного С-реактивного белка отражает токсичность плазмы крови, обусловленную как эндотоксинами бактерий, так и эндогенными токсическими продуктами. Его концентрация коррелирует со степенью токсического воздействия на сосудистый эндотелий [5].
Одним из маркеров развития эндотелиальной дисфункции является уровень в крови эндотелина, обладающего выраженным вазоконстрикторным эффектом, являясь главным антагонистом оксида азота [10].
Цель исследования - изучение факторов, характеризующих повреждение эндотелия в период ожогового шока, может помочь в выделении больных с риском развития синдрома полиорганной недостаточности.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе Саратовского центра термических поражений. Проведён анализ результатов комплексного обследования и лечения 77 больных с термической травмой, поступивших на лечение с 2008 по 2010 гг. в возрасте 16-60 лет с общей площадью поражения (8) >15% и индексом Франка >45.
Критериями исключения пациентов были: термоингаляционная травма и сопутствующая патология внутренних органов, существенно влияющая на течение ожоговой болезни.
Среди пациентов было 49 мужчин, 28 женщин. Средний возраст больных составил 39,3±1,3 лет. Общая летальность составила 26 пациентов (33,7%), из них 25 больных (89,2%) умерли от развившегося у них впоследствии синдрома полиорганной недостаточности. Больные были разделены на 3 группы. 1 группу составили 17 пациентов с лёгким ожоговым шоком (общая площадь поражения менее 21 % поверхности тела), 2 группу -48 пациентов с тяжелым ожоговым шоком (общая площадь поражения от 21 до 60% поверхности тела), в 3 группу были включены 13 больных с крайне тяжелым ожоговым шоком (общая площадь поражения более 60% поверхности тела). Характеристика групп больных приведена в табл. 1.
Таблица 1
Характеристика больных, включенных в исследование
Группа. Мужчины/ женщины Возраст, лет Индекс Франка, баллы Летальность, абс., (%)
1 группа(n=17) 10/7 51,0±1,7 54,8±4,3 5(29,4%)
2 группа(n=48) 31/17 37,7±1,3 75,6±4,5 13 (27,0%)
3 группа(n=13) 9/4 31,9±4,2 150,1±15,3 8 (61,5%)
32 пациентам, помимо общеклинического, биохимического, коагулометрического анализов крови в указанные выше сроки производилось определение в плазме крови уровня ФРЭС с помощью наборов для иммуноферментного анализа фирмы Bender MedSystems (Австрия), МСР-1 - наборов для иммуноферментного анализа фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск) на анализаторе Stat Fax 2100. Число циркулирующих десквамированных эндотелиальных клеток в крови (ЦЭК) подсчитывали по методике J. Hladovec (1978) в модификации Н.Н. Петрищева и соавт. (2001) c применением фазово-контрастной микроскопии [4].
В качестве критериев, характеризующих течение ССВО, использовали показатели в соответствии с классификацией ACCP/SCCM Consensus Conference, Chicago,1991. Содержание С-реактивного белка (СРБ), относящегося к группе белков острой фазы, определяли с помощью CRP U-hs универсального/высокочувствительного теста с использованием наборов фирмы DiaSys Diagnostics Systems GmbH.
Данные исследования проводили в период ожогового шока (1-2 сутки с момента получения травмы). Сравнение производили между группами, упомянутыми выше, а также с контролем, которым служили образцы крови 19 здоровых доноров. Результаты выражали в виде M±m, где М - среднее арифметическое значение, m - ошибка среднего. Статистический анализ проводился с использованием параметрических (критерий Стьюдента) для выборок с нормальным распределением и непараметрических методов (U-критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Пирсона) для выборок с распределением, отличающимся от нормального на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). Критический уровень значимости при проверке статиста-
