CC BY
12DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-31-31-41 УДК 581.1
С. В. Суховеева, Е. М. Кабачевская, И. Д. Волотовский
О СОПРЯЖЕНИИ ЭКСПРЕССИИ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ФОСФОЛИПИДНОГО, УГЛЕВОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА И ТРАНСМЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА РАСТЕНИЙ ТОМАТА С ИХ РЕАКЦИЕЙ ГРАВИТРОПИЗМА
Государственное научное учреждение «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: suhoveevalmbc@mail.ru
Исследовали влияние гравистимуляции на изменение экспрессии некоторых генов, ассоциированных с фос-фолипидным и углеводным метаболизмом, а также с трансмембранным транспортом, в клетках листьев томата на ранних (15 мин-3 ч) и поздних (более 3 ч-24 ч) этапах гравитропического ответа. С использованием ОТ-ПЦР в режиме реального времени показана чувствительность к гравистимуляции экспрессии генов PLC, PLDs, EXP,ß-Gluc, a-Gluc, H-ATPase, Flipp. Предварительная обработка растений перед началом гравистимуляции этефоном (источником экзогенного этилена) и брассиностероидом эпином приводила к изменению характера экспрессии изученных генов в ответ на гравистимул.
Ключевые слова: томат (Lycopersicum esculentum L.), гравитропизм, экспрессия генов, фитогормоны, этилен, брассиностероиды, этефон, эпин.
Введение
Гравитропизм — способность органов высших и низших растений расти в определенном направлении относительно вектора гравитационного поля.
Молекулярные и клеточные основы формирования гравитропического ответа растений до сих пор недостаточно изучены. Большинство работ проведено на примере таких органов растений, как корни и стебель. Реализация гравитропического сигнала в любом органе начинается с восприятия физического гравитационного стимула особыми внутриклеточными структурами, статолитами, в роли которых обычно выступают амилопласты, содержащие два или несколько крупных крахмальных зерна [1]. В случае отклонения органа растения от свойственного ему естественного направления роста относительно вектора гравитации, ста-толиты, под действием силы тяжести, располагаются в нижней части клетки и оказывают давление на клеточную мембрану, что приводит к ее механическому раздражению и инициации цепи биофизических, биохимических, молекулярных и физиологических изменений, позволяющих растению восстановить свое
первоначальное положение в пространстве. Имеется информация о том, что в гравистиму-лированном органе растения в течение первых 5 мин гравистимуляции инициируется процесс асимметричного перераспределения в радиальном направлении потоков фитогормона ауксина, в результате чего его содержание, а также концентрация цитоплазматического Ca2+ возрастают преимущественно на нижней стороне гравистимулированного органа [2]. Увеличение концентрации Ca2+ при передаче различных сигналов в значительной степени определяется действием на кальциевые депо клетки вторичного мессенджера инозитид-3-фосфата, продукта катализа фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C (PLC) [3]. Другой продукт катализа PLC, диацилгли-церин, превращается в важный вторичный мессенджер фосфатидную кислоту, которая образуется также благодаря каталитической активности разнообразных изоформ фосфолипазы D (PLD) [4]. Фосфатидная кислота и инозитид-3-фосфат могут влиять на активность различных белков, в том числе важного фермента контроля работы транспортеров ауксина, протеинкиназы PINOID, напрямую
связываясь с ее доменами [4].
Происходящие изменения способствуют активации АТФаз [1], в том числе Н+-АТФазы плазмалеммы, что приводит к быстрому под-кислению матрикса клеточной стенки, расщеплению ее полисахаридных структурных элементов, активации процессов роста клеток растяжением. Благодаря этим процессам возникает ассиметричный рост органа растения, приводящий к восстановлению его пространственной ориентации [5]. Гидролиз полиса-харидных структурных элементов клеточной стенки при росте клеток растяжением может происходить с участием белков экспансинов [6], альфа-глюкозидаз [7], бета-глюкозидаз [8].
Несмотря на то, что ауксин является ключевым гормональным регулятором гравитропи-ческих реакций растений, фитогормональная регуляция роста клеток растяжением может быть опосредована и другими фитогормонами, такими как гиббереллины [9], брассиностеро-иды (БС) и этилен [10]. Роль гиббереллинов в развитии тропических ростовых реакций надземных органов растений во многом связывают с их способностью усиливать реакцию изгиба, вызываемую ауксином [11]. Биологические эффекты этилена [12] и эпина [13] зачастую двойственные — оба фитогормона могут как активировать, так и ингибировать гравитропизм, они могут выступать как антагонисты ауксина, так что их влияние представляет особый интерес.
Механизмы передачи гравитропического сигнала продолжают активно изучаться, так как имеющаяся информация в основном получена на клеточном и биохимическом уровне. Молекулярно-генетические механизмы грави-тропического ответа остаются менее понятными. В том числе практически отсутствуют работы по оценке изменений уровня экспрессии генов при восприятии гравитропического сигнала в клетках таких органов растений как листья.
Целью данного исследования стала оценка уровня экспрессии в клетках листьев растений томата генов фосфоинозитид-зависимой фос-фолипазы C (PLC) и фосфолипазы De (PLDe), образующих ключевые сигнальные молекулы растительной клетки [2]. Гены Н+-АТФазы (H-ATPase), флиппазы (Flipp), экспансина A5 (EXP), бета-глюкозидазы (ß-Gluc), альфа-
глюкозидазы (a-Gluc) были выбраны как гены-кандидаты восприятия клетками листьев растений томата гравитационного сигнала, поскольку кодируемые ими белки могут участвовать в инициировании и собственно метаболизме элементов клеточной стенки, важном для обеспечения роста клеток растяжением. Экспрессию вышеперечисленных генов исследовали на фоне действия различных временных интервалов одиночного гравистиму-ла, гравистимула и синтетического БС эпина, гравистимула и этефона (предшественника этилена) для того, чтобы оценить возможную роль этих фитогормонов в регуляции гравитро-пического ответа листьев растений.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали молодые верхушечные листья 50-дневных растений томата (Lycopersicum esculentum L.). Растения выращивали при 16-часовом световом дне (освещение полихроматическим белым светом, 40 Вт, 150 мкмоль м-2с-1) при температуре 24 °С. Гравистимуляция проводилась путем поворота растений на 90 °С относительно гравитационного вектора Земли. Растения выдерживались в горизонтальном положении в течение различных промежутков времени (от 15 мин до 24 ч). Для исключения побочного эффекта условий освещенности и возможного развития дополнительной фототропической реакции после поворота растений горизонтально, гравистимуляцию проводили в темноте, предварительно поместив растения контрольных и экспериментальных групп в темноту на 24 ч для адаптации [14]. Часть опытных растений обрабатывалась (до переноса растений в темноту и до грависти-муляции) либо раствором этефона («Sigma», Germany) в концентрации 100 мг/л, либо раствором (200 мкл/л) эпина (производства ИБОХ НАНБ, ОАО «Белреахим») по одному разу в день в течение 8 дней.
Отбор растительной ткани контрольных и экспериментальных групп растений проводился на неактивном для фоторецепторов растений тусклом зеленом свету (лампа накаливания 15 Вт, стеклянный светофильтр с максимумом пропускания 470-605 нм, 0,45 мкмоль м-2с-1). Фрагменты листовой ткани (общая масса навески — 50-100 мг) гомогенизи-
ровали в фарфоровой ступке с жидким азотом с помощью фарфорового пестика. Затем из замороженных образцов выделяли общую РНК с использованием «TRI-reagent» («Sigma», Germany) согласно протоколу производителя. Содержание РНК в полученных препаратах оценивали на спектрофотометре «Nanodrop 2000c» (Thermo Scientific) бескюветным способом путем измерения поглощения раствора при 260 нм. О качестве полученных препаратов судили по показателю А260/280, который для чистых образцов обычно составляет 2,0-2,2.
ПЦР проводили в термоциклере «CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System» (Био-Рад, США) с использованием набора
водили с использованием компьютерной программы оценки относительной экспрессии генов REST-MCS (Relative Expression Software Tool, Multiple Condition Solver (version 2)). В качестве гена-нормализатора использовали ген 18S rRNA.
Представлены результаты экспериментов из 3-6 биологических повторностей. Статистиче-
«Luna® Universal qPCR Master Mix» (New England BioLabs Inc., США). Для оценки экспрессии генов PLC, PLDs, H-ATPase, Flipp, EXP, ß-Gluc, a-Gluc в клетках верхушечных листьев растений томата использовали пары праймеров, представленные в таблице 1. Для поиска нуклеотидных последовательностей исследуемых генов использовалась база данных NCBI GenBank. Конструирование ген-специфических пар праймеров осуществлялось с помощью программы Primer-BLAST NCBI. Синтез праймеров проводили в Институте биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси с использованием ДНК-синтезатора MerMade-4 (BioAutomation Corp., США).
Расчет и анализ полученных данных про-
ски достоверными признавались данные при величине Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Оценка уровня относительной экспрессии изучаемых генов в клетках верхушечных листьев томата проводилась в трех вариантах воздействия: гравистимуляция, гравистимуля-
Таблица 1
Ген-специфические ДНК-праймеры, сконструированные для исследования генов-кандидатов регуляции гравитропического ответа
Название гена Олигонуклеотидная последовательность ДНК-праймеров
Фосфолипаза С (PLC) S TGCATATTCTCCACCAGACT, A GGAACTGTCAATGGGAACTC
Фосфолипаза De (PLDs) S GTGATCCCAGTGCAGAAATT, A TGATCATCACAGCTACACCT
Н+-аденозин-трифосфатаза 2 (H-ATPase) S CACAGAGAACCCTTCATGG, A GACCTTTCAGTGTATGCAAC
Флиппаза (Flipp) S CGTCTTCTCTGTGTAGCTTG, A CACCCTCATGCACAATATCC
Экспансин A5 (EXP) S AATTTGTCCACCCATGCTAC, A TTCTGATACTGCACTCCCAT
ß-глюкозидаза (ß-Gluc) S GGGATCAGGATACACACAGA, A TTCATCCAAAGAGCAGAACG
а- глюкозидаза (a-Gluc) S CCAAACTTGTCCCCAAAGAA, A GGTAGACGGAAAGAGTGAGA
18S рибосомальная РЖ (I8S rRNA) S CGACCCGCGAACTCGTTTT, A GGGAGGGCTGTCGATTGTAGTATT
ция и эпин, гравистимуляция и этефон.
Как видно из таблицы 2, при действии гра-вистимуляции происходило быстрое повышение уровня экспрессии генов фосфолипидной сигнализации (PLC, PLDe), для которых максимальный уровень экспрессии наблюдался на 15-30 мин воздействия. Для генов трансмембранного транспорта H-ATPase, Flipp также обнаруживалось увеличение относительного уровня экспрессии, начиная с 15 мин воздействия, при этом максимум достигался через 1 ч, затем наблюдалось ее незначительное снижение. Увеличение экспрессии гена углеводного обмена a-Gluc проявлялось уже через 15 мин гравистимуляции, аß-Gluc и EXP не ранее чем через 30 мин. Высокий уровень экспрессии этой группы генов сохраняется в течение 6 ч воздействия.
При сочетанном воздействии гравистиму-ла и эпина экспрессия изученных генов по критерию транскрипции изменялась в целом в том же направлении, что и при действии одной гравистимуляции, но для ряда исследованных генов сдвигалась на более ранний период (табл. 3). Например, максимальный уровень экспрессии PLDe регистрировался через 15 мин, в то время как при гравистимуляции без дополнительных воздействий — через 30 мин. Предварительное воздействие на растения эпина приводит к более сильному увеличению уровня экспрессии генов, ассоциированных с трансмембранным транспортом и углеводным обменом. Особенно сильно (по сравнению с чистой гравистимуляцией) возрастал уровень экспрессии для таких генов, как a-Gluc и Flipp.
Функциональная активность генов и их наименования Временной интервал воздействия
0 мин 15 мин 30 мин 1 ч 3 ч 6 ч 24 ч
Фос фолипидная сигнализация PLC 1 10,23* 7,2* 6,5* 1,36 3,42 7,3
PLDe 1 20,25* 30,08* 16,24* 4,11* 3,75 4,76
Трансмембранный транспорт H-ATPase 1 1,75 2,09* 4,33* 2,9 2,51 3,03
Flipp 1 2,63* 2,68* 5,2* 2,71 3,22 4,29
Углеводный обмен EXP 1 0,84 7,11* 9,17* 9,82* 9,51 3,71
a-Gluc 1 1,48* 11,93* 12,8* 11,97* 18,1 1,22*
ß-Gluc 1 0,97 6,81* 7,44* 9,42* 8,47 0,93
Примечание. * — статистически значимые различия (P < 0,05)
Таблица 2
Уровень относительной экспрессии генов фосфолипидного обмена, трансмембранного транспорта и углеводного обмена в клетках листьев томата при действии гравистимуляции,
отн. ед.
Таблица 3
Уровень относительной экспрессии генов фосфолипидного обмена, трансмембранного транспорта и углеводного обмена в клетках листьев томата при действии гравистимуляции
и эпина, отн. ед.
Функциональная активность генов и их наименования Временной интервал воздействия
0 мин 15 мин 30 мин 1 ч 3 ч 6 ч 24 ч
Фосфолипидная сигнализация PLC 1 2,83 5,95* 3,78* 5,34* 3,47* 5,2*
PLDe 1 14,01* 12,66* 7,92* 8,77* 1,05 4,47
Трансмембранный транспорт H-ATPase 1 0,56 4,22* 5,49* 4,16* 0,87 12,77*
Flipp 1 0,64 7,34* 4,12* 2,48* 5,71* 6,23*
Углеводный обмен EXP 1 0,95* 17,27* 24,56* 22,78* 12,3 1,18*
a-Gluc 1 1,54* 30,28* 48,21* 39* 8,82* 6,18*
ß-Gluc 1 1 7,14* 8,61* 6,75* 3,82 1,05
Примечание. * — статистически значимые различия (P < 0,05)
По итогам экспериментов по действию гра-вистимуляции и этефона было зарегистрировано изменение уровня экспрессии PLC, PLDe, H-ATPase, Flipp, EXP, ß-Gluc, a-Gluc, значительно отличающееся от двух предыдущих воздействий (табл. 4). В присутствии этефо-на повышенный уровень экспрессии PLC наблюдался в период воздействия 15 мин-24 ч. Однако для всех остальных генов экспрессия уменьшалась и сохранялась пониженной по сравнению с контролем весь период наблюдения, за исключением 6 ч гравистимуляции, в этот период воздействия наблюдалось некоторое повышение экспрессии H-ATPase, Flipp.
Интересно, что с течением времени при гра-вистимуляции наблюдается изменение профилей экспрессии изучаемых генов (рис. 1). При всех трех типах воздействия в первые 15 мин преобладает экспрессия генов фосфоли-паз: при гравистимуляции, гравистимуляции
и эпине — PLC и PLDe, при гравистимуляции и этефоне — только PLC. При воздействии гравистимуляции и эпина уже на 30 мин в общем пуле исследованных генов начинает преобладать доля транскриптов генов углеводного обмена EXP, fi-Gluc, a-Gluc, в то время как при одиночной гравистимуляции значительное возрастание доли этих генов начинается лишь с 60 мин воздействия. Следует отметить, что при воздействии гравистимуляции и эпина в интервале времени 30-180 мин среди генов углеводного обмена превалирует a-Gluc, а при одиночной гравистимуляции доли а- иfi-Gluc примерно одинаковы в этот период. Через 6 ч воздействия гравистимуляции, грависти-муляции и эпина распределение экспрессии генов становится примерно одинаковым, за исключением незначительного преобладания EXP в клетках эпин-обработанных растений. После 24 ч воздействия гравистимуляции,
Таблица 4
Уровень относительной экспрессии генов фосфолипидной сигнализации, трансмембранного транспорта и углеводного обмена в клетках листьев томата при действии гравистимуляции
и этефона, отн. ед.
Функциональная активность генов и их наименования Временной интервал воздействия
0 мин 15 мин 30 мин 1 ч 3 ч 6 ч 24 ч
Фос фолипидная сигнализация PLC 1 17,15* 31,23* 28,35* 39,73* 15,78* 3,56
PLDs 1 0,34* 0,57 0,46 0,44* 1,16 0,26
Трансмембранный транспорт Н-АТРа&'в 1 0,33* 0,49 0,29* 0,57 1,66 0,48*
Flipp 1 0,58* 0,78 0,39 0,43* 1,63* 0,45*
Углеводный обмен ЕХР 1 1 0,3* 0,01* 0,02* 0,09 0,89*
а^Ыс 1 0,72* 0,17* 0,05* 0,16* 0,22 0,6*
1 0,95* 0,18* 0,06* 0,1* 0,15 0,89*
Примечание. * — статистически значимые различия (Р < 0,05)
Э
£ ■
> ■
с ■
в
*
п
£
Рис. 1. Профили экспрессии генов фосфолипидной сигнализации, трансмембранного транспорта и углеводного обмена в клетках листьев томата при действии гравистимуляции и фитогормонов
24 часа
МО мим
130 мии
№ мин
МШ[
15 мни
«г V
О
гравистимуляции и эпина обнаруживается снижение доли экспрессии генов углеводного метаболизма, постепенное увеличение доли фосфолипаз. Также в общем пуле возрастает доля экспрессии генов H-ATPase, Flipp. Воздействие гравистимуляции и этефона через 30-180 мин не приводило к значительным изменениям в распределении экспрессии генов — динамика накопления транскриптов оставалась практически такой же, как и на 15 мин воздействия. Через 6-24 ч воздействия этефона происходит постепенное снижение доли экспрессии в общем пуле PLC и увеличение PLDe, H-ATPase, Flipp, EXP, ß-Gluc, a-Gluc. Исходя из проведенного анализа по временному перераспределению уровней экспрессии генов в пределах 15 мин-24 ч воздействия, можно сделать вывод о том, что на ранних этапах развития гравитропического ответа быстро активируются гены ферментов, участвующих в развитии фосфолипидной сигнализации, далее нарастает роль процессов метаболизма углеводных элементов клеточной стенки, что, видимо, связано с процессами растяжения клетки. Несмотря на то, что уровень экспрессии генов, ассоциированных с трансмембранным транспортом протонов и перемещением фосфолипидов плазмалеммы, также усиливается при действии гравистимуляции, их доля в общем пуле становится заметной только через 24 ч. Наиболее быстрое накопление транс-криптов происходит при совместном влиянии гравистимуляции и эпина. При воздействии гравистимуляции и этефона уровень практически всех исследованных генов снижается ниже контрольного.
В ходе проведенных экспериментов выявлено, что гравистимуляция приводит к быстрой и временной активации в клетках листьев томата экспрессии генов, ассоциированных с фосфолипидной сигнализацией, трансмембранным транспортом и углеводным обменом. Экзогенно добавленный БС эпин усиливает действие гравистимуляции на изучаемые гены, в то время как этефон, предшественник этилена, вызывает значительное ингибирова-ние экспрессии практически всех изучаемых генов, за исключением PLC, что, вероятно, указывает на важную роль фосфоинозитид-ного цикла, катализируемого PLC, в развитии этиленового ответа.
Эти результаты согласуются с ранее полученными нами данными о скорости формирования угла изгиба стебля томата при трех типах воздействия, из которых следует, что гравистимуляция вызывает наиболее активное формирование изгиба стебля томата в первые 3 ч воздействия, при этом в обработанных эпи-ном растениях изгиб формируется быстрее, чем при действии одной гравистимуляции, а при действии этефона — сильно тормозится и даже через 24 ч растение не возвращается в нормальное положение [15, 16].
Таким образом, гравистимуляция растений путем их поворота на 90° относительно гравитационного вектора Земли приводит к временным изменениям в клетках листьев томата экспрессии различных групп генов, связанных с сигнальными, транспортными и метаболическими процессами в тот же период, когда формируется активный изгиб стебля растения и восстановление его естественного вертикального положения. Гравистимуля-ция растений в темноте позволила избежать возможного дополнительного воздействия фототропических реакций. Темнота может вызывать в тканях растений разнообразные перестройки, вызванные прекращением фотосинтетического процесса. Использовавшийся в работе общепринятый при исследованиях гравитропизма надземных фотосинтезирую-щих органов растений прием предварительной адаптации растений к темноте (24 ч) позволил избежать воздействия гравистимула в период формирования наиболее активных первичных реакций растения на затемнение, связанных с циркадным ритмом и ответом метаболизма на отсутствие фотосинтеза. В условиях продолжительного действия темноты (превышающего время периода типичной ночи) происходит поступательный рост активности и экспрессии различных групп гидролаз, необходимых для обеспечения тканей растения питательными веществами, и постепенное старение тканей. Например, в проростках овса в течение нескольких суток постоянного затемнения наблюдается постепенный и необратимый рост экспрессии гена фосфолипазы D [17]. В случае же гравитропического ответа мы наблюдали быстрые и обратимые реакции экспрессии генов, в том числе фосфолипазы D, которые регистрировались сразу после пово-
рота растения горизонтально и возвращались к уровню, близкому к контрольному, в первые 6 ч воздействия. Следует отметить, что через 24 ч после начала гравистимуляции экспрессия ряда генов вновь повышалась по сравнению с нулевым контролем, что, вероятно, уже объясняется влиянием не гравистимула, а затемнения, тем более что в этот период процесс формирования изгиба практически завершен.
В литературе описано участие некоторых из исследуемых нами генов в развитии грави-тропического ответа в других органах растений. Так, у мутантных линий мха с целевым нокаутом гена PLC [18] значительно снижается способность протонемы к отрицательному гравитропизму во время роста в темноте. Также показано изменение экспрессии гена PLC при гравистимуляции в клетках корней ара-бидопсиса [19]. При гравистимуляции корней Arabidopsis thaliana показана передача сигнала с участием гена PLDzeta2 [20]. Мутанты ара-бидопсиса по гену PLDzeta2 и трансгенные растение с нокаутом PLDzeta2 характеризовались меньшей чувствительностью к ауксину и проявляли пониженную способность к формированию гравитропического изгиба, тогда как трансгенные проростки со сверхэкспрессией гена PLDzeta2 демонстрировали повышенную способность к гравитропиче-скому ответу. Указанный ответ трансгенных проростков со сверхэкспрессией PLDzeta2 на гравистимуляцию предположительно связан с тем, что PLDzeta2 и фосфатидная кислота контролируют везикулярную секрецию, транспортировку и распределение ауксина [21]. Наши исследования показывают, что в формировании ответа на гравистимул в клетках листьев томата участвует ген другой изофор-мы PLD, PLDe. Учитывая вышеописанную информацию, а также исследования Lee и др., где показано участие гена фосфолипазы А2р в формировании гравитропизма в стеблях ара-бидопсиса [22], и представлены данные о подавлении гравитропической реакции в корнях, гипокотилях и соцветиях у нокаут-мутантов Arabidopsis thaliana по гену фосфолипазы A-I [23], можно предположить участие всех трех типов фосфолипаз в формировании гра-витропического ответа растений, в том числе листьев.
В публикации журнала Plant Cell в 2020
году появились данные о том, что фосфоли-пид-транспортирующая АТФаза (флиппаза) ALA3 (aminophospholipid ATPase 3) регулирует полярность транспортеров ауксина — PIN-белков [24]. Нокаут-мутанты арабидопсиса по гену ALA3 проявляют множество связанных с ауксином пороков развития, в их числе сниженную способность к корневому грави-тропизму и нарушение полярного транспорта ауксина за счет снижения способности к везикулярному транспорту PIN-белков. Роль Н+-АТФазы на биохимическом уровне в аук-син-индуцированном удлинении растительных клеток достаточно хорошо исследована и связана с тем, что этот фермент снижает и активирует pH-чувствительные гидролазы, необходимые для размягчения клеточной стенки и роста клеток растяжением [25]. В наших исследованиях обнаружено участие на молекулярно-генетическом уровне флиппа-зы (phospholipid-transporting ATPase 6) и H+-АТФазы в верхушечных листьях томата при действии гравистимуляции.
К числу ферментов, которые могут участвовать в обеспечении роста клеток растений растяжением, относятся различные глюкозидазы и экспансины. Имеется, например, информация о том, что активность ß-глюкозидаз увеличивается в период роста растений, индуцированного ауксинами [26], за счет возрастания растяжимости клеточных стенок растений
[27]. Показано увеличение в клеточных стенках экспрессии ß-Gluc при удлинении клеток в процессе роста базальной части ножки гриба Coprinopsis cinerea [8]. Ауксин также вызывает локальное увеличение транскрипции генов экспансинов у делящихся клеток: в апикальной меристеме побега томата, корней риса и при соматическом эмбриогенезе сосны
[28]. Б. Р. Кулуев с соавторами (2013) получили трансгенные растения табака со сверхэкспрессией гена NtEXPA5, кодирующего а-экспансин в растениях табака, которые характеризовались увеличением размеров листьев и стеблей, при этом величина цветков оставалась практически неизменной. Увеличение размеров органов было обусловлено стимулированием только клеточного растяжения, при этом число клеточных делений даже уменьшалось [29]. Наши исследования показывают, что в клетках листьев томата при действии гравистимуля-
ции увеличивается на уровне транскрипции экспрессия альфа-, бета-глюкозидазы, а также гена экспансина А5.
Заключение
В ходе проведенных исследований показано, что в клетках листьев томата при воздействии гравистимула, гравистимула и эпина, гравистимула и этефона изменяется экспрессия ряда ключевых генов фосфолипидной сигнализации, трансмембранного транспорта, а также метаболизма полисахаридов клеточной стенки.
Следует отметить, что выявленные нами изменения генной экспрессии обнаруживаются не в месте непосредственного гравитропиче-ского изгиба, в стебле томата, но в клетках верхушечных листьев растений. Это обстоятельство указывает на то, что к гравистимуля-ции чувствительны различные ткани и органы растения, что, видимо, позволяет растению быстро и эффективно адаптироваться к изменениям пространственного положения и восстанавливать нормальную ориентацию в пространстве, причем изменения происходят не только на биохимическом или физиологическом уровне, но также на уровне транскрипции генов. Полученные данные свидетельствуют также о том, что гравитропический ответ представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных молекулярно-генетических реакций на уровне различных систем организма.
Список использованных источников
1. Molecular Mechanisms of Root Gravit-ropism / Shih-Heng Su [et al.] // Current Biology.
- 2017. - Vol. 27, iss. 17. - P. 964-972.
2. Statolith sedimentation kinetics and force transduction to the cortical endoplasmic reticulum in gravity-sensing Arabidopsis columella cells / Y. Kolesnikov [et al.] // Protoplasma. - 2016. -Vol. 253, iss. 4. - P. 987-1004.
3. Якушкина, Н. И. Физиология растений: учеб. пособие / Н. И. Якушкина; Просвещение.
- Москва. - 1980. - 303 c.
4. A role for lipid-mediated signaling in plant gravitropism / C. M. Smith [et al.] // Botany. -2013. - Vol. 100, iss. 1. - P. 153-160.
5. Hager, A. Role of the plasma membrane H+-ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects/ A. Hager // J Plant
Res. - 2003. - Vol. 416, iss. 6. - P. 483-505.
6. Daniel, J. C. Plant expansins: diversity and interactions with plant cell walls/ J. C. Daniel // Current opinion in plant biology. - 2015. - Vol. 25. - P. 162-172.
7. a-Glucosidase I is required for cellulose biosynthesis and morphogenesis in Arabidopsis / C. Stewart Gillmor [et al.] // J Cell Biology. - 2002.
- Vol. 156, iss. 6. - P. 1003-1013.
8. Purification, characterization, and function analysis of an extracellular B-glucosidase from elongating stipe cell walls in Coprinopsis cinerea/ W. Zhang [et al.] // FEMS Microbiology Letters.
- 2016. - Vol. 363, iss. 9. - P. 112.
9. Gibberellin-regulated XET is differentially induced by auxin in rice leaf sheath bases during gravitropic bending / Dayong Cui [et al.] // Journal of Experimental Botany. - 2005. - Vol. 56, iss. 415 - P. 1327-1334.
10. Brassinosteroids: Multidimensional Regulators of Plant Growth, Development, and Stress Responses / Trevor M. Nolan [et al.] // Plant Cell.
- 2020. - Vol. 32, iss. 2. - P. 295-318.
11. Ross, JJ. Auxin, gibberellins and the gravitropic response of grass leaf sheath pulvini / JJ. Ross, C. M. Wolbang // Plant Signal Behav. -2008. - Vol. 3, iss. 1. - P. 74-75.
12. Li, N. The dual-and-opposing-effect of eth-ylene on the negative gravitropism of Arabidopsis inflorescence stem and light-grown hypocotyls / N. Li // Plant Science. - 2008. - Vol. 175, iss. 1-2. - P. 71-86.
13. The Role of Brassinosteroids in Shoot Gravitropism / F. Vandenbussche [et al.] // Plant Physiology. - 2011. - Vol. 156, iss. 3. - P. 13311336.
14. Maxwell, K Chlorophyll fluorescence — a practical guide / K. Maxwell, G. N. Johnson // Journal of Experimental Botany. - 2000. - Vol. 51, iss. 345. - P. 659-668.
15. Суховеева, С. В. Влияние биостимулятора эпина на развитие гравитропической реакции верхушечных листьев растений томата / С. В. Суховеева, Е. М. Кабачевская, И. Д. Волотовский// Сборник материалов V Международной научно-методологической конференции «Роль физиологии и биохимии в интродукции и селекции сельскохозяйственных растений». - Москва. - 15-19 апреля 2019 г.
- Т. 2. - С. 88-90
16. Суховеева, С. В. Формирование угла
изгиба и изменение скорости изгиба стеблей растений томата при гравистимуляции и воздействии экзогенного этилена / С. В. Суховеева, Е. М. Кабачевская, И. Д. Волотовский// Сборник тезисов докладов XIX Всероссийской конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии». - Москва. - 15-16 апреля 2019 г. - Т. 2. - С. 86.
17. Кабачевская, Е. М. Сахарозависимая регуляция активности фосфолипазы D в проростках овса / Е. М. Кабачевская, С. В. Суховеева, И. Д. Волотовский // Доклады НАН Беларуси. - 2019. - Т. 63, № 1. - C. 61-71.
18. Phosphoinositide-specific phospholipase C is involved in cytokinin and gravity responses in the moss Physcomitrella patens / A. Repp [et al.] // The Plant Journal. - 2004. - Vol. 40, iss. 2. - P. 250 - 259.
19. Role of inositol 1,4,5-triphosphate signalling in gravitropic and phototropic gene expression/ R. Salinas [et al.] // Plant Cell and Environment. - 2010. - Vol. 33, iss. 12. - P. 2041-2055.
20. Involvement of Arabidopsis thaliana phospholipase D^2 in root hydrotropism through the suppression of root gravitropism/ Y. Y. Tanigu-chi [et al.] // Planta. - 2010. - Vol. 231, iss. 2. -P. 491-497.
21. Li, G. Arabidopsis PLDzeta2 regulates vesicle trafficking and is required for auxin response/ G. Li, H. Xue // Plant Cell. - 2007. - Vol. 1. -P. 281-295
22. Secretory low molecular weight phospho-lipase A2 plays important roles in cell elongation and shoot gravitropism in Arabidopsis / H.
Y. Lee [et al.] // Plant Cell. - 2003. - Vol. 15. -P. 1990-2002.
23. Scherer, G. F. E. Gravity-dependent differentiation and root coils in Arabidopsis thaliana wild type and phospholipase-AI knockdown mutant grown on the International Space Station / G. F. E. Scherer, P. Pietrzyk // Plant Biology. -2014. - Vol. 16. - P. 97-106
24. Whitewoods, C. Flipping the Vs: Integrating Vesicle Trafficking, PIN Polarity, and Plant Development / C. Whitewoods // Plant Cell. -2020. - Vol. 32, iss. 5. - P. 1354.
25. Hade, A. Role of the plasma membrane H+-ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects / A. Hager // J. Plant Res. - 2003. - Vol. 116, iss. 6. - P. 483-505.
26. Shah, M. A. Strategy for purification of aggregation prone P-glucosidases from the cell wall of yeast: a preparative scale approach / M. A. Shah, T. K. Chaudhuri, S. Mishra // N. Biotech-nol. - 2012. - Vol. 29, iss. 3. - P. 311-320
27. Hsieh, M. C. Partial purification and characterization of a soybean P-glucosidase with high specific activity towards isoflavone conjugates / M. C. Hsieh, T. L. Graham // Phytochemistry. -2001. - Vol. 58. - P. 995-1005.
28. Головацкая, И. Ф. Морфогенез растений и его регуляция: учеб. пособие / И. Ф. Головацкая; Издательский Дом Томского государственного университета. - Томск, 2016. - 14 c.
29. Головацкая, И. Ф. Морфогенез растений и его регуляция: учеб. пособие / И. Ф. Головацкая; Издательский Дом Томского государственного университета. - Томск, 2016. - 16 c.
S. V. Sukhaveyeva, A. M. Kabachevskaya, I. D. Volotovski
ON THE COUPLING OF EXPRESSION OF SOME KEY GENES CONTROLLING PHOSPHOLIPID, CARBOHYDRATE METABOLISM AND TRANSMEMBRANE TRANSPORT IN TOMATO PLANTS WITH THEIR GRAVITROPIC REACTION
State Scientific Institution "Institute of Biophysics and Cell Engineering of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: suhoveevalmbc@mail.ru
Effect of gravistimulation on the level of gene expression controlling phospholipid, carbohydrate metabolism and transmembrane transport in tomato leaf cells at early (15 minutes-3 hours) and late (more than 3 hours-24 hours) expositions of gravitropic response was estimated. Sensitivity to gravistimulation of the PLC, PLDs, H-ATPase, Flipp, EXPA5, fi-Gluc and a-Gluc expression was determined using real-time RT-PCR. The pretreatment of plants with ethephon (the chemical analog of exogenous ethylene) and epibrassinolide (epin) led to a change in the relative level of expression of investigated genes in response to gravistimulation.
Keywords: tomato (Lycopersicum esculentum L.), gravitropism, gene expression, phytohormones, ethylene, brassi-nosteroids, ethephon.
Дата поступления в редакцию: 18 октября 2021 г.
