CC BY
17
УДК 575.164
АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АУКСИНА В РАСТЕНИЯХ ДИКОГО ТИПА И МУТАНТА ABRUPTUS ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО ГЕНА DR5::GUS
У.Н. Кавай-оол1, Т.А. Ежова
(кафедра генетики; e-mail: [email protected])
В растениях Arabidopsis thaliana исследовали активность слитого гена DR5..GUS, позволяющего выявлять участки локализации активного ауксина и качественно оценивать его уровень в тканях растения. Установлено, что температурочувствительная мутация abruptus приводит к температурозависимому накоплению свободного ауксина в листьях, а также увеличению уровня ауксина в тычинках и чашелистиках по сравнению с контрольными растениями, гомозиготными по аллелю гена ABRUPTUS/PINOID дикого типа. Полученные данные подтверждают важную роль гена ABRUPTUS/PINOID в регуляции полярного транспорта ауксина.
Ключевые слова: развитие растений, ауксин, мутанты, трансгенные растения, Arabi-dopsis thaliana.
Ауксин является важнейшим регулятором морфогенеза растений. Благодаря работе систем полярного транспорта ауксина (ПТА) в тканях растения создаются локальные участки высокой концентрации этого гормона, что приводит к изменению экспрессии в этих участках десятков генов-мишеней. Исследования на модельном растении Arabidopsis thaliana позволили идентифицировать гены, контролирующие ПТА. Установлено, что одним из ключевых регуляторов ПТА в тканях побега является ген ABRUPTUS/PINOID (ABR/PID), кодирующий серин-треониновую протеинкиназу, активность которой важна для правильной локализации белка PIN1, выносящего ауксин из клеток. У мутантов pid белок PIN1 утрачивает свойственное для него положение на апикальных частях клеток [1], что обусловливает фенотипическое сходство мутантов pid и pin [2, 3]. Мутанты pid и pin характеризуются слиянием семядолей, нарушением филло-таксиса, развитием цветоноса, похожего на булавку. Проявление мутации abr (аллель pid) зависит от температуры. В условиях повышенной температуры наблюдается высокая экспрессивность мутантного признака и растение не способно развивать цветки на булавковидном цветоносе. При более низкой температуре мутант формирует цветки измененной морфологии [4], что, по-видимому, связано с сохранением остаточной функции мутантного белка. Задачей данной работы являлось изучение влияния мутации abr на распределение активного ауксина в органах побега растений A. thaliana. Для выявления участков локализации активного (свободного)
ауксина использовали линию трансгенных растений A. thaliana, в геном которых включен репор-терный ген ß-глюкуронидазы GUS под контролем чувствительного к ауксину синтетического промотора DR5 (DR5::GUS) [5].
Объект и методы исследования
Растительный материал. В работе использовали трансгенные растения A. thaliana, экспрессиру-ющие химерный ген DR5..GUS. Путем скрещивания с растениями расы Dijon-M (линия К-1) и мутанта abr (линия К-150, полученная из расы Dijon-M после обработки мутагеном нитрозометилмочевиной) получены гомозиготы по нормальной и мутантной аллелям гена ABR/PID и трансгену DR5::GUS. Растения выращивали в асептических условиях на ага-ризованной среде Квитко [6] в люминостате при 16-часовом фотопериоде (интенсивность освещения 4000 лк) и температуре 23—25°. После достижения стадии цветения (4 недели от посадки) часть растений переносили в условия 27—29°, где они росли еще одну неделю. Растения, постоянно растущие при 23—25°, анализировали на стадии ювенильной розетки (2 недели) и стадии цветения (5 недель). Растения, перенесенные в условия 27—29°, анализировали в возрасте 5 недель.
Анализ активности репортерного гена GUS. В качестве субстрата для определения активности ß-глю-куронидазы использовали 20 мМ раствор X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide) в диме-тилформамиде [7]. Образцы тканей помещали в раствор, содержащий 1 мМ X-gluc; 50 мМ фосфатный
1 Тувинский государственный университет. 667000, г. Кызыл; Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. 119991, г. Москва.
буфер Na2HPO4 + NaH2PO4, pH 7,0-7,2; 0,01 объемных % Tween-20, и инкубировали в темноте в термостате при 37° от 5 до 48 ч. Затем образцы переносили в 70%-й этанол для удаления хлорофилла, после чего анализировали их стереомикроскопом STEMI-2000 ("K. Zeiss", Германия).
Результаты и обсуждение
В растениях дикого типа, выращенных при температуре 23—25°, активность слитого гена DR5::GUS наблюдали в локальных участках листьев розетки (в кончиках зубчатых выростов листа) ювениль-ных 2-недельных и цветущих 5-недельных растений, а также в стеблевых листьях, развивающихся на цветоносах (рисунок, а, б). Эти локальные участки соответствуют местам расположения гидатод, что отмечалось и в ранее проведенных исследованиях [8, 9].
Наибольший уровень экспрессии DR5::GUS наблюдали в тычинках распускающихся бутонов и самых молодых цветках (рисунок, в). В условиях повышенной температуры (25—27°) экспрессия DR5::GUS в растениях дикого типа становилась ниже, чем в растениях, которые постоянно росли при 23—25°. Эти данные можно объяснить влиянием температуры на биосинтез ауксина. Ранее было показано, что уровень свободного ауксина в проростках A. thaliana, выращенных при 26°, существенно ниже, чем в выращенных при 21° [10]. По-видимому, и в нашем эксперименте снижение экспрессии трансгена
Схе м атическое изображе ние экспресс ии тра нс гена ОК5::С1/$ в листьях и цветках растений дикого типа (а—г) и мутанта аЬг (д—з) А. ЖаИапа: а, д — листья розетки; б, е — стеблевые листья; в, ж — молодые цветки; г, з — чашелистики (объяснения
в тексте)
БЯ5::Ои8 в растениях дикого типа после переноса растений в условия 27—29° связано со снижением синтеза ауксина.
В растениях мутанта аЬг экспрессия БЯ5::Ои8 во всех органах была выше, чем в растениях дикого типа (рисунок, д, е, ж, з). В листьях накопление ауксина наблюдали не только в гидатодах, но и по краю всей пластинки листа, а также диффузно, по всей площади листа (рисунок, д, е). Основным местом экспрессии БЯ5::Ои8 в цветках мутанта, как и в цветках дикого типа, были тычинки (рисунок, ж). Существенный уровень экспрессии БЯ5::Ои8 отмечался и в чашелистиках молодых цветков (рисунок, ж, з), который ослабевал по мере распускания цветков мутанта аЬг. Более активная экспрессия ВЯ5::ОШ в листьях и цветках мутанта аЬг свидетельствует о более высоком уровне свободного ауксина в этих органах.
При повышенной температуре (25—27°) уровень активности репортерного гена в растениях мутанта увеличивался по сравнению с 23—25°, а пространственные особенности экспрессии оставались практически неизменными. Эти результаты находятся в соответствии с усилением экспрессивности фенотипического проявления мутация аЬг при выращивании растений в условиях повышенной температуры [4]. По-видимому, повышение температуры приводит к инактивации мутантного белка и полному блоку транспорта ауксина в побеге, что вызывает усиление мутантного фенотипа и более выраженное накопление ауксина в тканях.
Эти результаты подтверждают полученные ранее данные о более высоком содержании свободной формы ауксина, определенном методом ИФА, в растениях мутанта на стадии бутонизации (— в 2 раза) по сравнению с растениями дикого типа [11, 12]. Кроме того, выявленное с помощью анализа экспрессии БЯ5::Ои8 накопление ауксина в листьях розетки и стебля мутанта аЬг хорошо соответствует обнаруженным ранее данным об увеличении в 1,5—3 раза содержания ауксина в розетке листьев и базальной части цветоноса (где формируются стеблевые листья) у мутанта по сравнению с растениями дикого типа [12].
Обнаруженная нами более высокая активность БЯ5::Ои8 в цветках мутанта по сравнению с диким типом не противоречит также данным об отсутствии различий в содержании ауксина в апикальной части цветоноса мутанта и растений дикого типа на стадии бутонизации и даже данным о 2-кратном сниженном содержании ауксина у мутанта в апикальной части цветоноса на стадии полного цветения [12]. Это кажущееся противоречие легко объясняется тем, что растения мутанта имеют существенно более низкое число цветков по сравнению с растениями дикого типа. Более того, в цветках мутанта уменьшено число тычинок и чашелистиков [4], которые по результатам анализа экспрес-
сии DR5::GUS являются основными органами, накапливающими ауксин.
Таким образом, благодаря использованию химерного гена DR5::GUS нам удалось более детально исследовать влияние мутации abr, нарушающей транспорт ауксина в побеге, на распределение ауксина в растениях. Показано, что мутация приводит к накоплению ауксина не только в листьях, но и в цветках, что подтверждает отсутствие нарушений в процессах синтеза этого фитогормона у мутанта.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Friml J., Yang X., Michniewicz M. et al. A PINOID dependent binary switch in Apical-Basal PIN Polar Targeting directs auxin efflux // Science. 2004. Vol. 306. P. 862-865.
2. Bennett S.R.M., Alvarez J., Bossinger G., Smyth D.R. Morphogenesis in pinoid Mutants of Arabidopsis thaliana // Plant J. 1995. Vol. 8. P. 505-520.
3. Christensen S.K., Dagenais N., Chory J., Weigel D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID // Cell. 2000. Vol. 100. P. 469-478.
4. Ежова T.A., Ондар У.Н., Солдатова О.П., Кузнецова Т.В. Изучение роли гена ABRUPTUS в дифферен-цировке цветоносов у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Докл. РАН. 1997. Т. 354. № 6. С. 839-842.
5. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T.J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements // Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 1963-1971.
6. Квитко К.В. Асептическая культура Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. и перспективы ее использования в ботанических исследованиях // Вестн. Лен. ун-та. Сер. биология. 1960. Т. 15. № 3. С. 47 -56.
Выявленное снижение уровня экспрессии ВЯ5::Ои5 в растениях дикого типа после переноса растений в условия 27—29° указывает на важную роль температуры в регуляции синтеза ауксина.
* * *
Исследования поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований и ФЦП НШ 4202.2008.4.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
8. Aloni R. The induction of vascular tissue by auxin // Plant hormones: biosynthesis, signal transduction, action / Ed. Davies P.J. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 2004. P. 471-492.
9. Aloni R., Aloni E., Langhans M., Ullrich C.I. Role of auxin in regulating Arabidopsis flower development // Planta. 2006. Vol. 223. P. 315-328.
10. Zhao Y, Hull A.K., Gupta N.R. et al. Trp-dependent auxin biosynthesis in Arabidopsis: involvement of cytochrome P450s CYP79B2 and CYP79B3 // Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 3100-3112.
11. Калинина А.Ю., Ежова T.A., Голубева Н.В. и др. Полярный транспорт ауксина у мутанта abruptus Arabi-dopsis thaliana (L.) Heynh. // Вестн. СПбГУ. 2000. Сер. 3. Вып. 1. № 3. С. 42-49.
12. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Калинина А.Ю., Медведев С.С. Взаимодействие генов ABRUPTUS/PINOID и LEAFY в процессе флорального морфогенеза у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Генетика. 2000. Т. 36. № 12. С. 1-6.
Поступила в редакцию 05.11.09
THE ANALYSIS OF AUXIN DISTRIBUTION IN THE WILD TYPE
AND ABRUPTUS MUTANT PLANTS OF ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH.
BY USING THE OTIMERIC GENE DR5::GUS
U.N. Kavai-ool, T.A. Ezhova
We have studied the activity of the chimeric gene DR5::GUS that indicates the spatial pattern of free auxin distribution and relative auxin level in the tissues of A. thaliana plants. It is established that the temperature sensitive abr mutation leads to temperature-dependent increased accumulation of the free auxin in leaves, stamens and sepals in comparison to control plants homo-zygous for the wild type allele ABRUPTUS/PINOID. Our data revealed the important role of the ABRUPTUS/PINOID gene in the regulation of the auxin polar transport.
Key words: plant development, auxin, mutants, transgenic plants, Arabidopsis thaliana.
Сведения об авторах
Кавай-оол Урана Николаевна - канд. биол. наук, докторант Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Тел.: (495)939-05-67; e-mail: [email protected]
Ежова Татьяна Анатольевна - докт. биол. наук, проф. кафедры генетики биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-54-90, 8(915)313-93-64; e-mail: [email protected]
