CC BY
22
УДК 581; 575
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГЕНА MINI2 В КОНТРОЛЕ РАЗВИТИЯ ПОБЕГА ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH
Кавай-оол У.Н., Ежова ТА* Лаборатория генетики, Тувинский государственный университет, Кызыл *Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия
STUDYING THE ROLE OF GENE MINI2 IN MONITORING THE DEVELOPMENT OF ARABIDOPSIS
THALIANA (L.) HEYNH. ESCAPE
Kavai-ool U.N., Ezhova T.A.* Laboratory of genetics, Tuvan state University, Kyzyl M.V. Lomonosov Moscow State University*, Russia
Среди новых мутантных форм A.thaliana (коллекция МГУ им. М.В. Ломоносова) имеется мутант, характеризующийся необычной миниатюрностью и поэтому был назван mini2 (min2, линия Т-38-2б) [1]. Мутантные растения характеризуются полукарликовым ростом, ветвящимся габитусом и сниженным апикальным доминированием (АД). Обычно подобные черты присущи ауксиновым мутантам A.thaliana [2]. Их карликовость связана не столько с уменьшением длины междоузлиев, сколько с нарушением АД. Кроме того, для мутанта min2 характерно раннее зацветание [3, 4].
Ключевые слова: Arabidopsis, фенотип, генотип, дикий тип, мутанты, двойные мутанты, генетика развития растений, ауксин.
Among the new mutant forms of A. thaliana (collection of the M.V. Lomonosov Moscow State University), a mutant characterized by the unusual small size and was therefore named mini2 (min2, line T-38-2B) [1]. Mutant plants are characterized by semi-dwarf growth habit branching and reduced apical dominance (AD). Usually such traits are inherent auxin mutants of A. thaliana [2]. Their dwarfism is not so much the decrease in the length of internodes, as with the breach of AD. In addition, the mutant min2 characterized by early flowering [3, 4].
Key words: Arabidopsis, phenotype, genotype, wild type, mutants, double mutants genetics of plant development, auxin.
Миниатюрность габитуса у мутантных растений min2 заметна на стадии раннего проростка, а конечные размеры полноценных органов, - в среднем в 2 раза меньше, чем у исходной расы Dijon-M (рисунок 1).
Рис. 1. Проростки и органы побега min2 и Di-M (а-ж). Сканирующий электронный микроскоп (СКАН): (в) и (г). Бары: 300 и 1000 ум соответственно
У мутантных растений min2 уменьшены верхушка цветоноса и розетка, а также размеры стебля, листьев, цветков, стручков и семян. Наблюдали, что в 5-ти недельном возрасте min2
Тувинский государственный университет
опережает рост дикого типа (в 1.2 раза) и по длине генеративной части (в 4.8 раза) и соответственно числу узлов (1.7 раза) (таблица 1).
Таблица 1
Параметры главного цветоноса мутанта тП2 в сравнение с диким типом _(возраст - 5 недель)_
Параметры Di-M min2
1.Число листьев розетки 8.5 ± 1.1 5.4 ± 0.7
2.Высота растений 11.9 ± 1.4 14.6 ± 1.7*
З.Высота вегетативной части 11.0 ± 1.8 8.8 ± 0.8
4.Число узлов вегетативной части 3.6 ± 0.6 3.2 ± 0.3
5.Длина междоузлий вегетативной части 3.2 ± 1.0 2.8 ± 0.3
б.Высота генеративной части 1.2 ± 0.7 5.8 ± 1.7
7.Число узлов генеративной части 13.5 ± 1.6 23.5 ± 3.0
8.Длина междоузлий генеративной части 0.1 ± 0.04 0.2 ± 0.02
Примечание: * - различия достоверны при Р > 0.95. Параметры - 2, 3, 5, 6 и 8 в (см).
Еще одной характерной особенностью т1п2 является раннее формирование цветоноса, -сразу после 5-го розеточного листа (8 у дикого типа) и в возрасте 4 недели мутант имеет высоту 4.1 см (у дикого типа 0.5). Раскрытие бутонов у мутанта также происходит раньше, чем у дикой расы 01-М. Часто листья имеют супротивное расположение вследствие нарушения филлотаксиса, что может быть вызвано нарушением полярного транспорта ауксина (ПТА). Поскольку у т1п2 снижены линейные размеры всех органов побега и цветка, мы исследовали клетки мутанта в сравнение с контролью. Диаметр стебля у тп2 в 2 раза меньше, чем у нормы (рис. 1). Длина эпидермальной клетки стебля у мутанта (рисунок 2) в среднем снижена в 1.6 раза (39.1 рм, у нормы 62.5 рм), а её ширина в 1.5 раза превышает таковую дикого типа (22.5 рм по сравнению с 15 рм в контроле).
Рис. 2. СКАН. Клетки стебля: а и в - дикий тип (wild type, wt); б и г - min2. Бары: 30 ум
В цветке тп2 уменьшены размеры флоральных органов. Общая площадь лепестка мутанта равняется 3570 рм2, а число клеток в нём, - 364 (у дикого типа 9675 и 488 соответственно). При этом круглые клетки лепестков мутанта имеют диаметр 8.9 рм (у дикого типа - 14.3 рм) (рисунок 3).
Рис. 3. СКАН. Клетки лепестков дикого типа и тП2 соответственно. Бары: 10 ум
Противоположная картина наблюдается для клеток листьев, которые у мутанта имеют более вытянутую форму в сравнение с диким типом (рисунок 4). Средние длины клеток листьев у тп2 и дикого типа составляют 129.2рм и 71.1рм соответственно.
Рис. 4. СКАН. Клетки листа min2 в сравнение с диким типом (а и б). Бары: 100 ум
В отличие от мутантов erectal, erecta2 и lepida-2 мутант min2 обнаруживает более сложные закономерности изменения размера клеток, что требует дальнейших исследований. Возможно, размер клеток - не является причиной миниатюрности мутанта, а является следствием его ускоренного развития. Ускорение развития проявляется и в раннем вступлении мутанта min2 в фазу плодоношения (на 1.5 недели раньше, чем дикий тип). Ускорение развития видно и по уменьшению числа листьев розетки у мутанта (4.7, у дикого типа - 7.4), и по снижению числа узлов в вегетативной части цветоноса (2.3, у дикого типа - 3.4) (табл. 1). Таким образом, миниатюрность мутанта min2, как и других, рано зацветающих мутантов, является следствием раннего вступления на репродуктивную стадию развития.
Яркой особенностью мутанта min2 является нарушение АД. Развитие цветоноса у min2 прекращается вследствие остановки функционирования апикальной меристемы (АМ) (рисунок 5), что несколько напоминает развитие цветоноса у мутанта nana. Развитие мутанта min2 после замирания АМ продолжается за счёт ветвления боковых и дополнительных побегов стебля и розетки.
Генетический анализ показал, что все фенотипические изменения фенотипа (миниатюрность строения, снижение АД и ускоренное зацветание) обнаруженные у мутантов min2 наследовались сцеплено, как моногенный рецессивный признак в потомстве F2 от скрещивания мутантов min2 с растениями расы Di-M. Результаты реципрокных скрещиваний были одинаковыми. Суммарно все Fi имели нормальный фенотип, а в F2 обнаружили 131 дикого типа : 48 растений фенотипа min2 (х2 31 равняется 0.3, Р > 0.95). Эти данные свидетельствуют о том, что изменённые признаки мутанта min2, - обусловлены рецессивной ядерной мутацией в одном гене.
Тувинский государственный университет _
В связи с тем, что у min2 нарушено функционирование АМ, исследовали фенотип двойных мутантов min2 (clavata 1), min2 Ф2 и min2 Ф3 (рисунок 5). Отметим, что двойные мутанты (двойные гомозиготы по мутациям) выделяли среди растений F2-Fз поколений от скрещивания одиночных мутантов (родительских форм). Во всех 3-х семьях в F2 наблюдали независимое дигенное расщепление 9 : 3 : 3 : 1 (х2 = 7.81 при уровне значимости Л= 0.05 и степени свободы ^ = 3).
Двойные мутанты имели признаки родителей: увеличение числа плодолистиков в гинецее (стручке), как у Ф и миниатюрность органов, как у min2. Обнаружено, что мутации Ф не восстанавливают нормальное АД у мутанта min2 (рисунок 5, стрелки). У min2 Ф3, как у min2, наблюдали преждевременную терминацию развития АМ (рис. 5 а, б, стрелки).
Рис. 5. Верхушки соцветия и стручки min2 (а, г, стрелки и е) и min2 clv3 (б, в, стрелки и ж) в сравнение с диким типом (г, слева и д). СКАН: а-в, д-ж. Бары: (а), (д) и (ж) - 500, (б) и (в) - 1000, (е)
- 200 ум
На верхушке цветоносов двойных мутантов min2 clv3 можно увидеть кластеры из недоразвившихся бутонов, которые сначала прекращают расти, а затем постепенно отмирают (рис. 5 б). Таким образом, нами не выявлено взаимодействия генов MIN2 и CLV, то есть ген MIN2 не оказывает прямого влияния на систему генов WUS - CLV. В связи со снижением АД (рис. 5 а, стрелка) и «кустистой» архитектурой побега, характерными для ауксиновых мутантов (в том числе, и мутанта abruptus, abr), а также преждевременным истощением верхушки цветоноса, нами проанализированы двойные мутанты min2 abr. Для получения двойных гомозиготных растений одиночные мутанты скрещивали между собой. В F1 растения характеризовались нормальным фенотипом, а среди F2 наблюдали расщепление на 4 фенотипических класса в соотношении 9 частей нормального фенотипа : 3 части растений фенотипа abr : 3 части растений фенотипа min2 : 1 части карликового фенотипа min2 abr. Двойные мутанты, как и мутант min2 характеризуются миниатюрностью, имеют мелкие цветки, которые по морфологии околоцветника напоминают цветки мутанта abr (редуцированные чашелистики и тычинки, многолепестковость).
Главной особенностью двойного мутанта min2 abr было выраженное нарушение филлотаксиса, чем у обеих родительских форм, а также более раннее (чем у min2) отмирание верхушек цветоносов, поэтому увидеть характерные для мутанта abr булавковидные структуры, терминирующие цветоносы, не удалось. В то же время, на дополнительных розеточных цветоносах, которые развивались очень быстро, иногда можно было увидеть подобие
терминального цветка, который состоял из одного палочковидного пестика. Подобные структуры встречались у одиночного мутанта abr и были отличительной особенностью двойного мутанта abr tfl (terminal flower) [1]. Их образование у мутантов abr min2 и abr tfl, по-видимому, связано с большей скоростью развития растений под влиянием мутаций min2 и tfl, соответственно.
Таким образом, нарушение АД и филлотаксиса у двойного мутанта, более ярко выраженное, чем у родительских форм, позволяют говорить о комплементарном взаимодействии генов MIN2 и ABR/PID1 (PINOID) в регуляции развития главного цветоноса и поддержании его АД.
Исследования мутанта min2 пока не завершены. По предварительным данным, у этого мутанта, как и у мутанта abr изменено распределение ауксина в растениях (результаты по экспрессии DR5::GUS). Возможно, что дефицит ауксина в апикальной части побега и его накопление в розетке листьев (как и у мутанта abr) являются основой выявленного комплементарного взаимодействия и объясняет увеличение размера клеток в листьях, несмотря на их уменьшенный размер в остальных органах. Нами показано, что ген MIN2 локализован в правом плече I-ой хромосомы (рекомбинанты между генами min2 и ар1 (apetala) отсутствовали, следовательно, расстояние между ними, - при допущении наличия одного рекомбинанта, составляет менее 16 сМ).
Библиографический список
1. Ежова, Т А., Лебедева, О.В., Огаркова, О.А., Пенин, А.А., Солдатова, О.П., Шестаков, С.В. Arabidopsis thaliana -модельный объект генетики растений. М.: Макс-Пресс, 2003. 220 с.
2. Лутова, Л.А. Генетика развития растений (для биологических специальностей университетов). 2-ое перераб. и доп. издание. Спб.: Л-Н, 2010. 432 с.
3. Кавай-оол, У.Н., Ежова, Т.А. Репортёрные гены в решении прикладных и фундаментальных вопросов генетики растений. Кызыл: ТувГУ, 2013. 70 с.
4. Кавай-оол, У.Н. Взаимодействие генетических и фитогормональных факторов в контроле развития растений // Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук. М: МГУ, 2012. 334 c.
Bibliographicheskiy spisok
1. Yezhovа, T.A., Lebedeva, O.V., Ogarkova, O.A., Penin, A.A., Soldatova, O.P., Shestakov, S.V. Arabidopsis thaliana forma plantae recusat. M.: Max Press, 2003. 220 s.
2. Lutova, L.A. Genetics of herba biological development (pro Propria universitatibus). 2nd revised. et ext. ed. Spb.: L-N, 2010. 432 s.
3. Kavai-ool, U.N., Yezhova, T.A. Hordeum vulgare est in solutione quaestionum et applicatam genetica plantae. Kyzyl: TuvSU, 2013. 70 s.
4. Kavai-ool, U.N. De commercio phytohormonal geneticae factores et plantae in potestate. Pro gradu doctoratus, summisque in scientiarum progressum Thesis // M.: MSU, 2012. 334 s.
Кавай-оол Урана Николаевна - доктор биологических наук, профессор Тувинского государственного университета, член Центрального совета и Научного общества ВОГИС им. Н.И. Вавилова. E-mail: [email protected]
Kavai-ool Urana - doctor of biological sciences, professor of Tuvan State University, member of the Central Council and Scientific Society VOGIS named after N.E. Vavilov. E-mail: [email protected]
Ежова Татьяна Анатольевна - доктор биологических наук, профессор кафедры генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Член Научного общества ВОГИС им. Н.И. Вавилова. E-mail: [email protected]
Ezhova Tatiana - doctor of biological sciences, professor of the Department of Genetics, faculty of Biology of Moscow State University named after M.V. Lomonosov, member of the Central Council and Scientific Society VOGIS named after N.E. Vavilov. E-mail: [email protected]
