CC BY
50
УДК 581.5, 581.1
© М. Ф. Шишова1, М. Пахлер 2, Ф. Шталь 2, Г. Шерер 2
1 Санкт-Петербугский государственный университет;
2 Университет им. Лейбница, Ганновер
C Рост и развитие растений в изменяющихся условиях окружающей среды находится под контролем целого ряда факторов, приводящих к сдвигу гормонального баланса и последующему изменению интенсивности экспрессии гормонзависимых генов. Корнеспецифичная экспрессия ранних ауксинидуцируемых генов семейств Aux/IAA, SAUR, ARF и GH3 оценена у проростков арабидопсиса с использованием специально разработанных биочипов. Воздействие фитогормона (15, 30 и 60 мин) приводило к устойчивому усилению экспрессии генов IAA1, IAA3, IAA5, IAA11, IAA19, а также GH3-1, GH3-3, GH3-5. Увеличение экспрессии SAUR9 и SAUR10 было меньшим по амплитуде и наблюдалось только на 30-й минуте воздействия гормона.
C Ключевые слова: арабидопсис; ауксин; экспрессия генов; чип-технология.
Поступила в редакцию 05.11.2013 Принята к публикации 26.06.2014
ЭКСПРЕССИЯ РАННИХ АУКСИНЗАВИСИМЫХ ГЕНОВ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ АРАБИДОПСИСА
ВВЕДЕНИЕ
Рост и развитие растений находятся под постоянным действием большого числа абиотических и биотических факторов, в том числе неблагоприятных. Возникающие ответные адаптационные механизмы опираются на активацию комплекса регуляторных систем как на уровне клетки, так и на уровне всего организма. Одной из важнейших систем, осуществляющих управление развитием растительного организма, является гормональная система, насчитывающая в настоящее более 15 рострегулирующих соединений. Особое внимание исследователей обращено к выявлению биохимических, физиологических и молекулярно-генетических основ многообразия действия фитогормона ауксина (индолил-3-уксусная кислота, ИУК), химически очень простой молекулы, регуляторные свойства которой проявляются уже на самых ранних этапах эволюции растительного мира (Bari, Jones, 2009; Patel, Franklin, 2009; Chehab et al., 2009). К числу таковых можно отнести динамичный баланс концентрации эндогенного фитогормона, изменение числа рецепторов, направленностью трансдукционных путей, физиологическим состоянием клеток-мишеней и т. д. Исследования последних десятилетий предоставили достаточно большое число данных о регуляторном действии ауксина на экспрессию генов. Усиление экспрессии некоторых из них может быть зарегистрировано уже через 5—15 мин после начала воздействия фитогормона (Abel, Theologis, 1996; Guilfoyle, 1999; Hagen, Guilfoyle, 2002). Эти гены, активация которых протекает без участия ауксининдуцированного синтеза белков, принято относить к группе ранних генов или группе генов первичного ответа. К их числу можно причислить гены таких семейств как Aux/IAA, SAUR и GH3.
Гены Aux/IAA
Гены Aux/IAA (Auxin/lNDOLE-3-ACETIC ACID) были идентифицированы как быстро активируемые при действии ауксина на гипо- и эпикотили (Walker, Key, 1982; Hagen et al., 1984; Theologis et al., 1985). Они представлены мультигенными семействами у арабидопсиса (Liscum, Reed, 2002), сои (Ainley et al., 1988), гороха (Oeller et al.,1993), томата (Nebenfuhr et al., 2000), табака (Dargeviciute et al., 1998) и других растений. Усиление экспрессии данной группы генов наблюдается при ауксинзависимом росте растяжением. Накопление мРНК Aux/IAA специфично индуцируется физиологически активными ауксинами, а также в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида (Guilfoyle, 1999).
Белки, кодируемые генами семейства Aux/IAA, имеют молекулярную массу 20—36 кДа, локализованы в ядре и являются короткоживущими (Abel et al., 1994; Abel, Theologis, 1995). Белки характеризуются наличием четырех консервативных доменов I, II, III и IV (Abel et al., 1995). Домены II и III имеют функциональное значение, отвечая за убиквитинизацию белков (домен II) и димеризацию/мультимеризацию (домен III), а также взаимодействие с белками ARF (Abel et al., 1994; Ouellet et al., 2001). Значение доменов I и IV пока не установлено. Предполагается, что домен I может участвовать в гомодиме-ризации белков Aux/IAA (Ouellet et al., 2001).
Особое внимание уделяется белкам Aux/IAA в связи с их участием в трансдукции ауксинового сигнала, воспринятого рецептором TIR1 (Hao, Yang, 2010). Ранее белок TIR1 был отнесен к системе ауксинрегулируемой убиквитинизации, приводящей к деградации белков Aux/IAA (Dharmasiri,
Estelle, 2004). Эти белки являются негативными регуляторами ауксинзависимой экспрессии генов, благодаря своей способности к связыванию с белками ARF (Auxin Response Factor). TIR1 входит в состав обширной группы белков, содержащих домен F-box, и отвечает за специфичность связывания фитогормона.
Показано, что ИУК непосредственно связывается с белком TIR1, что активирует ЕЗ-лигазу убиквитинового комплекса. Тем не менее следует заметить, что растения арабидопсиса, дефектные по гену TIR1, не проявляют специфичного фенотипа. Лишь множественная мутация по генам TIR1, AFB1, AFB2 и AFB3 (три последних гена являются близкими гомологами TIR1) приводит к развитию дефектного фенотипа (Dharmasiri et al., 2005).
Гены SAUR
Семейство генов SAUR (small-auxin-up-RNAs) было идентифицировано при исследовании роста растяжением гипокотилей, обработанных ауксином (McClure, Guilfoyle, 1987). Появление их транскриптов было зарегистрировано уже через 2—5 мин после внесения фитогормона. Анализ последовательности кДНК трех транскриптов SAUR и последующий анализ соответствующих генов позволили сделать вывод, что они не содержат интронов (McClure et al., 1989). Кодируемые белки имеют молекулярную массу 9—10 кДа и консервативную область на С-конце. В дальнейшем гены SAUR были идентифицированы у гороха (Guilfoyle et al., 1993), арабидопсиса (Gil et al., 1994), кукурузы (Yang, Poovaiah, 2000) и т. д. У арабидопсиса выявлено более 70 SAUR генов, многие из которых организованы в кластеры.
Предполагается, что время жизни мРНК и белков SAUR может регулироваться на пост-транскрипционном уровне (Hagen, Guilfoyle, 2002). Функциональное значение белков, кодируемых генами SAUR, недостаточно изучено, тем не менее ряд экспериментальных данных указывает, что они могут быть вовлечены в трансдукцию ауксинового сигнала с участием кальмодулина. Способность связывать кальмодулин была показана для N-кон-ца белка SAUR-AC1 (SMALL AUXIN UP RNA 1 FROM ARABIDOPSIS THALIANA ECOTYPE COLUMBIA, Yang, Poovaiah, 2000).
Гены GH3
Уровень мРНК генов GH3 резко увеличивается в течение 5 мин после внесения ауксина, что было продемонстрировано на проростках сои (Hagen, Guilfoyle, 1985). Выявленный эффект был специфичен для физиологически активных ауксинов. Ауксинрегулируемые гены семейства GH3 были обнаружены также у табака (Roux, Perrot-Rechenmann, 1997), арабидопсиса (Hagen, Guilfoyle, 2002), у мха Physcomitrela patens (Bierfreund et al., 2004) и у зеленой водоросли Synechocystis sp. (Paponov et al., 2008). Функциональный анализ мутантов арабидопсиса по ряду генов семейства GH3 выявил учас-
тие, по крайней мере, нескольких белков, кодируемых этими генами, в трансдукции не только гормонального (ауксина), но и светового (дальний красный) сигналов при фототропизме (Tian, Reed, 1999).
Гены GH3 кодируют цитоплазматические белки массой 70 кДа (Wright et al., 1987; Hagen et al., 1991). Для некоторых белков GH3 была выявлена способность конъюгировать растительные фитогормоны с аминокислотами in vitro (Staswick et al., 2002). По структуре и субстратной специфичности, белки GH3 арабидопсиса делятся на 3 группы. Группа I представлена двумя белками, катализирующими связывание жасмоновой кислоты с аминокислотами. Группа II, включая AtGH3a, конъюги-рует ИУК. Представители группы III не активны в отношении фитогормонов (жасмонаты, салицилаты или ИУК), и их функция до сих пор не известна (Staswick et al., 2005).
Транскрипционные факторы ARF
Несмотря на различия в структуре вышеперечисленных групп генов они характеризуются одной общей особенностью — наличием в промоторной области TGTCTC последовательности — ауксинзависимого элемента (auxin responsive elements) (Ulmasov et al., 1997a, b). Впоследствии были выявлены ARF — короткоживущие ядерные белки, выполняющие функцию транскрипционных факторов, специфично связывающихся с промоторами ауксининдуцируемых генов.
Накопленные данные свидетельствуют о важности каждой из перечисленных групп генов в направленном изменении морфогенеза под действием ауксина, концентрация которого в различных тканях варьирует при действии неблагоприятных факторов окружающей среды. Абсолютное большинство данных экспрессионного анализа получено с использованием целых проростков, что затрудняет их использование для характеристики развития различных органов и тканей растения. Расшифровка механизмов, определяющих интенсивность тканеспеци-фичной экспрессии ауксининдуцируемых генов, лежит в основе понимания механизмов адаптации растительного организма к факторам среды. Данное исследование нацелено на выявление специфичного изменения экспрессии ауксинрегулируемых генов в корнях проростков арабидопсиса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал
Семена арабидопсиса Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., экотип Columbia, поверхностно стерилизовали с использованием 70 %-го этанола, водного 5 %-го раствора гипохлорита натрия (NaClO) и triton X-100, промывали дистиллированной водой и помещали на 1—2 суток в холодильник для яровизации. Затем семена помещали в 6-луночные планшеты из расчета 20 семян на лунку,
содержащую 5 мл среды Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) с пониженным (1 %) содержанием сахарозы. Планшеты помещали на ротационный шейкер (80 об./мин) для элиминации гравитропической реакции и равномерного снабжения проростков кислородом. Выращивание проводили на свету (длина светового периода — 19 часов). На 10-й день проростки обрабатывали раствором ИУК в концентрации 10 мкМ, приготовленном на среде выращивания. В контрольных растениях питательную среду меняли на свежую. В работе было использовано 4 варианта: контрольные проростки (временная точка 0); проростки, обработанные гормоном в течение 15, 30 и 60 минут. Изолированные корни помещали в специальные пробирки, содержащие циркониевые шарики для последующей гомогенизации и хранили при температуре -70 °C до начала выделения РНК. Эксперимент имел двукратную биологическую повторность.
Выделение РНК
Гомогенизацию растительных тканей (150-200 мкг) проводили в присутствии 1 мл Trizol (TRIzol® Reagent) на установке FastPrep EP 120 (Thermo Savant BI0101) за 60-90 с. Далее пробы центрифугировали при 12 000 g. Полученный супернатант смешивали с хлороформом и посредством фазового разделения получали водную фракцию, обогащенную РНК. К этой фракции добавляли изопропанол для осаждения РНК, центрифугировали, полученный осадок промывали 70 %-м этанолом, высушивали в токе воздуха, а затем растворяли в стерильной деионизованной воде. Далее проводили определение количества РНК в пробе на спектрофотометре NanoDrop ND-1000. Количество РНК варьировало в диапазоне от 500 до 4500 нг в пробе. Качество полученного образца определяли по интегральному показателю сохранности РНК (RIN — RNA Integrity Number) с помощью Биоанализатора Agilent 2100.
Подготовка чипов для анализа экспрессии генов интереса
Нанесение олигонуклеотидов, комплементарных участкам генов интереса (см. таблицу), проводили на стекла (CSS-100 Silylated Slides (Aldehyde), nuclease-free slides for DNA MicroArrays) с помощью печатающего устройства, после чего проводили процедуру фиксации. Для этого биочипы помещали сначала на 3 мин под ультрафиолетовый свет (254 нм), затем в термостат на 2 часа при 80 °С и, наконец, на 24 часа оставляли при комнатной температуре.
На следующий день проводили процедуру активации поверхности биочипов. Для этого стекла последовательно обрабатывали растворами 0,2 % SDS и боратно-спир-товым раствором (1gNaBH4+300 ml Na-фосфатного буфера, рН 7,2 + 100ml ethanol). После каждой инкубации слайды промывали дистиллированной водой. В завершении их высушивали в токе воздуха. Для окончатель-
ной фиксации биочипы помещали на 45 мин в раствор, содержащий 0,1 % SDS и 1 % бычий сывороточный альбумин, при 42 °С. Далее слайды многократно промывали дистиллированной водой и высушивали током воздуха. Готовые слайды хранили при комнатной температуре в темноте.
Анализ экспрессии генов
Для повышения эффективности проводимого анализа при низких концентрациях РНК нами был использован набор реагентов MICROMAXTM, TSATM LABELING AND DETECTION KIT. Основная последовательность проводимых реакций по протоколу производителя заключается в следующем:
1. Проводили синтез кДНК в присутствии меченых флуоресцентными зондами нуклеотидных аналогов. В результате синтезировались 2 пробы кДНК: меченая флуоресцином (FL) и биотином (B). Полученную кДНК очищали с использованием специальной мембранной колонки, входящей в набор.
2. Очищенную пробу кДНК наносили на биочип и оставляли для гибридизации на ночь при температуре 42 °С на шейкере (Thermomixer Comfort, Eppendorf). Пробу наносили только на область, где «напечатаны» олигонуклеотиды. Далее эту область накрывали покровным стеклом и герметизировали. На один чип обычно наносили кДНК-FL, полученную из одной пробы РНК, и кДНК-В, полученную из другой пробы РНК.
3. «Проявку» результатов гибридизации осуществляли с помощью репортерных зондов Cyani-ne 3 и Cyanine 5.
4. Анализ интенсивности экспрессии проводили с помощью чип-ридера Gene Pix 4000B (Axon Instrument).
Оценка уровней экспрессии генов.
Анализ флуоресценции, зафиксированный с помощью чип-ридера Gene Pix 4000B, производили с помощью специальной компьютерной программы Gene Pix Pro 6.0™. Флуоресценцию каждой точки нормализовали по отношению к фоновому свечению слайда. Отношение флуоресценции Cyanine 3 и Cyanine 5 рассчитывали для каждого гена. Учитывая 3-кратную повторность нанесения олигонуклеотидов на биочипе, для каждого гена оценивали 12 значений интенсивности флуоресценции. Величину относительной экспрессии генов интереса проводили при сравнении массивов данных с помощью /-критерия Стьюдента (при 95 %-м уровне значимости). На графиках представлена кратность изменения экспрессии генов относительно средних значений экспрессии генов интереса, высчитанных по отношению к значениям экспрессии таковых в момент начала эксперимента (t = 0 мин). Обсуждаются только изменения относительных уровней экспрессии генов более чем двукратные.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Опираясь на представленные в литературе данные, нами были отобраны гены, характеризующиеся быстрым (в период 30—60 мин) повышением экспрессии при обработке ауксином проростков арабидопсиса (Abel, Theologis, 1996; Goda et al., 2002, 2008; Pufky et al., 2003; Scherer et al., 2007). Олигонуклеотиды, комплементарные участкам данных генов (список генов представлен в таблице 1) были использованы для дизайна чипов, которые были применены для изучения интенсивности ауксинзависимой экспрессии генов в корнях проростков арабидопсис.
Проведенный анализ экспрессии показал, что не все гены отличаются увеличением экспрессии после внесения ауксина. На рисунке 1 приведены данные аук-сининдуцированной экспрессии генов семейства IAA. Можно видеть, что только 5 из исследованных генов характеризовались увеличением экспрессии через час после начала гормонального воздействия. Для IAA1 и IAA11 увеличение экспрессии начиналось очень быстро — уже в первые 15 мин. Через полчаса к их числу присоединялись еще 2 гена: IAA3 и IAA19. По истечении часа повышение экспрессии регистрировали и для IAA5.
список ауксининдуцируемых генов, олигонуклеотиды, комплементарные которым, были использованы для изготовления чипов
Таблица 1
Название гена Название локуса Название гена Название локуса
семейство IAA семейство ARF
IAA1 AT4G14560 ARF6 AT1G30330
IAA2 AT3G23030 ARF7 AT5G20730
IAA3 AT1G04240 ARF8 AT5G37020
IAA4 AT5G43700 ARF19 AT1G19220
IAA5 AT1G15580
IAA6 AT1G52830 семейство SAUR
IAA7 AT3G23050 SAUR-1 AT4G34770
IAA8 AT2G22670 SAUR-7 AT2G21200
IAA9 AT5G65670 SAUR-9 AT4G36110
IAA11 AT4G28640 SAUR-10 AT2G18010
IAA12 AT1G04550 SAUR-14 AT4G38840
IAA13 AT2G33310 SAUR-25 AT4G13790
IAA14 AT4G14550 SAUR-46 AT2G37030
IAA19 AT3G15540 SAUR-AC1 AT4G38850
семейство GH3 Другие
GH3-1 AT2G14960 белок семейства F-box AT1G78100
GH3-2 AT4G37390 ядерный транскрипционный фактор, содержащий homebox-leucine zip домен AT5G47370
GH3-3 AT2G23170 белок, похожий на убиквитин-специфичную протеазу 12 AT2G32870
GH3-5 AT4G27260 предполагаемый транскрипционный фактор с цинковыми пальцами AT5G04340
предполагаемый транскрипционный фактор AT1G74650
предполагаемый репрессор транскрипционного фактора с цинковыми пальцами AT1G27730
белок, подобный EF-1 транскрипционному фактору AT4G22780
MYB- транскрипционный фактор AT5G58340
MYB- транскрипционный фактор AT5G11050
8 H
s s 7 -
0
fl>
CL r 6 -
0
(1) 5 -
n;
X (1) 4 -
1
(1)
^ § 3 -
n
10 2 -
0
1
1- ro 1 -
Ci
ï£
n -
□ 15 мин
□ 30 мин 0 60 мин
i
4-
IAA1 IAA3 IAA5 IAA11 IAA19
Рис. 1. Уровень корнеспецифичной экспрессии генов семейства Aux/IAA при действии ИУК (10-5 М) на проростки араби-допсиса в течение 15, 30 и 60 минут
Несколько иным был профиль экспрессии группы GH3 (рис. 2). Из четырех исследованных генов три характеризовались усилением экспрессии, причем уже к 15-й минуте действия гормона. Наиболее интенсивное увеличение экспрессии было отмечено для GH3-3. Для гена GH3-2 увеличение экспрессии было кратковременным и возвращалось к исходному уровню уже к 30-й минуте.
Анализ экспрессии генов семейства SAUR выявил нелинейный во времени характер накопления транскрип-тов. Первые 15 мин после начала гормонального воздействия характеризовались снижением экспрессии всех исследованных представителей данного семейства (рис. 3). Лишь на 30-й мин воздействия слабую стимуляцию экспрессии идентифицировали для SAUR9 и SAUR 10 генов.
8 7 6 5 4 3 2 1 0
s о о <и
CL
с
0
V <0
к
s
1
<D I CD
5
о о
X
го
Q.
В дальнейшем (через 60 мин) экспрессия снова снижалась, но изменение экспрессии не превышали двукратного.
Слабо отзывчивыми (усиление не было статистически достоверным) в исследуемый интервал времени оказались и представители семейства ЛЯГ, кодирующие транскрипционные факторы. В связи с этим мы не приводим эти результаты.
Помимо перечисленных семейств, усилением экспрессии характеризовался ряд генов, предположительно кодирующих транскрипционные факторы или белки, имеющие сходство с белками-трансдукторами гормонального сигнала (табл. 1). Можно видеть, что 2 из 9 генов этой группы уже через 15 мин после начала воздействия усиливали экспрессию (рис. 4). Тем не менее интенсивность
□ 15 min
□ 30 min ЕбО min
i
M
GH3-1
GH3-2
GH3-3
GH3-5
Рис. 2. Уровень корнеспецифичной экспрессии генов семейства GH3 при действии ИУК (10-5 М) на проростки арабидопсиса в течение 15, 30 и 60 минут
Рис. 3. Уровень корнеспецифичной экспрессии генов семейства SAUR при действии ИУК (10-5 М) на проростки арабидопсиса в течение 15, 30 и 60 минут
экспрессии в значительной степени падала в ходе часовой инкубации, когда своего максимума достигала экспрессия гена, кодирующего F-box-содержащий белок.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Использование метода технологии микрочипов позволяет одномоментно оценить экспрессию большого числа генов и выявить изменение их экспрессии при действии того или иного фактора. Данный метод был применен для идентификации ауксининдуцированной экспрессии у це-
8
лого ряда растений. Особо пристальное внимание уделено изменениям, происходящим в первые 1—3 часа после начала воздействия. Для растений арабидопсиса при анализе 24000 генов (чипы для диагностики активности всего генома) было показано накопление транскриптов 222 генов, в том числе Aux/IAA, SAUR и GH3 (Redman et al., 2004). В этом исследовании сравнительный анализ экспрессии генов выявил, что не все представители этих групп характеризовались ранним откликом на внесение гормона. Способностью усиливать экспрессию отличались лишь 19 из 77 генов SAUR, 15 из 36 Aux/IAA
о о CD CL С о
о
7 -6 -5 -4 -
$
I 3
03 CL
□ 15 min
□ 30 min z60 min
1
2 1 0 -1
transfactor, similar to F-box family homebox-leucine ubiquitin-specific protein zipper protease 12
Рис. 4. Уровень корнеспецифичной экспрессии генов AT5G47370, AT2G32870 и AT1G78100 при действии ИУК (10-5 М) на проростки арабидопсиса в течение 15, 30 и 60 минут
и 5 из 20 GH3. Сходный феномен различной отзывчивости генов перечисленных групп был отмечен еще в ряде исследований (Esmon et al., 2006, Hager, Guilfoyle, 2002, Paponov et al., 2008, Pufky et al., 2003). Причина этого феномена может быть опосредована временной и тканевой специализацией экспрессии при действии гормона. Последнее редко принимается авторами во внимание в связи с использованием для анализа целых проростков араби-допсиса. Косвенно это подтверждается различием ауксин-индуцированной экспрессии анализируемых генов в корнях и побегах проростков арабидопсиса (Шишова и др., 2011). Вторая причина может заключаться в концентрациях гормона, оказывающего воздействие на различные органы проростка. При работе с целыми проростками и развитыми органами растения арабидопсис традиционно используют достаточно высокие до 10 мкМ ауксина, что может оказывать негативное действие на гормонин-дуцированные процессы, например, в корне.
Проведенное нами исследование было сфокусировано на анализе экспрессии ауксининдуцированных генов в корнях проростков арабидопсиса при увеличении длительности гормонального воздействия. Для этого были разработаны биочипы, позволяющие проанализировать экспрессию ограниченного числа генов, относящихся к семействам Aux/IAA, SAUR и GH3 (табл. 1). Полученные результаты (рис. 1 -4) свидетельствуют о том, что корневая система проростков арабидопсиса характеризуется увеличением экспрессии лишь небольшого количества генов.
Из 14 проанализированных генов группы Aux/IAA лишь пять характеризовались усилением накопления транскриптов в ответ на действие ауксина: IAA1, IAA3, IAA5, IAA11, IAA19. Можно отметить, что общей особенностью характера экспрессии этих генов является постепенное ее возрастание с продолжительностью действия гормона. Ранее было показано, что ген IAA1 экспресси-руется в ходе развития проростка арабидопсиса с максимальным накоплением РНК в корнях, соцветиях и цветках (Yang et al., 2004). Усиление его экспрессии наблюдается уже через 4 минуты после воздействия ауксина (Abel, Theologis, 1996) и продолжается достаточно долго, что указывает на широкий спектр его действия в ауксинрегу-лируемых процессах. С использованием различных подходов к выявлению функциональной значимости IAA1 гена было установлено, что повышение стабильности кодируемого им белка приводит к ингибированию закладки латеральных корней, роста гипокотиля, удлинения листьев, а также формирования проводящей системы побега проростков арабидопсиса (Park et al., 2002; Yang et al., 2004; Ku et al., 2009). Эти данные согласуются с общим представлением о том, что продукт гена IAA1 участвует в тран-сдукции ауксинового сигнала за счет быстрой деградации в результате TIR-зависимой убиквитинизации. Известно также, что IAA1 регулирует (ингибирует) не только собственный синтез, но и синтез ряда представителей семейства Aux/IAA, например IAA5 (Lee et al., 2009). Известно,
что нарушения в кодировании IAA3 приводят к появлению сходного c iaal фенотипа, характеризующегося большими по размеру семядолями, коротким гипокотилем и т. д., что указывает на сходную «ингибиторную функцию» гена в регуляции ауксинового ответа (Tian et al., 2002). Было показано, что IAA3 также участвует в регуляции экспрессии ряда генов Aux/IAA, в том числе IAA5. По нашим данным, именно ген IAAl характеризуется наиболее быстрым откликом при действии ауксина. Эффект стимуляции регистрировался на протяжении всего времени воздействия гормона на проростки арабидопсиса. Значимое усиление экспрессии генов IAA3 и IAA5, напротив, регистрировалось лишь при более длительном воздействии гормона. Изменение экспрессии гена IAAll имело ту же тенденцию, но ее усиление не превышало 2,5 раза, что позволяет нам судить лишь о сходных тенденциях. Несколько иной динамикой отличалась экспрессия гена IAA19. Она достигала максимума к 30 мин действия гормона и далее сохранялась на достаточно высоком уровне, что соответствует литературным данным (Tatematsu et al., 2004). Следует подчеркнуть, что ранее были выявлены отличия в профиле экспрессии гена IAA19 по отношению к другим представителям семейства Aux/IAAs. РНК IAA19 не детектируется в листьях и соцветиях, что функционально подтверждается сильным ингибированием экспрессии данного гена под действием света. Визуализация белка IAA19 показала отличия его локализации от ряда других белков, кодируемых генами Aux/IAAs в корнях (Muto et al., 2007). Кроме того, экспрессия гена IAA19 находилась под контролем не только ауксина, но и света, однако была нечувствительна по отношению к сахарам, по сравнению с экспрессией IAA3, также отличающегося достаточно сильной экспрессией в гипокотилях (Tatematsu et al., 2004). В целом можно заключить, что при действии ауксина на проростки арабидопсиса в корнях регистрируется быстрая и усиливающаяся со временем активация экспрессия гена IAA1. Более поздняя (после 1 часа действия ауксина) отзывчивость генов IAA3 и IAA5 указывает на возможность кросс-регуляции генов данной группы. Напротив, для гена характерен IAA19 быстрый и интенсивный отклик уже на 30 мин, который сохраняется весь последующий период исследования, что может свидетельствовать о приоритетном значении данного гена в формировании ответной ростовой реакции корня.
В настоящее время доказано, что убиквитинизация белков семейства Aux/IAA приводит к высвобождению транскрипционных факторов семейства ARF, регулирующих интенсивность экспрессии ауксинчувствительных генов (Mockaitis, Estelle, 2008). Проведенный нами анализ, к сожалению, не выявил накопления в корнях проростков арабидопсиса транскриптов ни одного из четырех исследованных генов этой группы при обработке ауксином.
В тоже время полученные нами данные о быстром и интенсивном увеличении экспрессии генов группы GH3 полностью соответствуют результатам предшествующих
исследований. Все исследованные нами гены относятся к группе II GH3, кодирующей ферменты, отвечающие за конъюгацию ауксина с аминокислотами, что может рассматриваться как первый этап в инициации катаболизма ИУК (Staswick et al., 2005). Тем самым ауксин обладает способностью не только усиливать интенсивность трансдукции своего сигнала, как в случае семейства Aux/IAA, но и активно участвовать в авторегуляции своей концентрации. Этот феномен может иметь особое регуляторное значение в определении специфичности и интенсивности индуцируемого ответа. В литературе отмечалось, что у арабидопсиса ряд генов группы GH3, например, GH3.2 и GH3.5, характеризуются корнеспецифичной экспрессией или экспрессируются при закладке латеральных корней (Takase et al., 2004; Zhang et al., 2008). В связи с этим представляет интерес выявление особенностей в динамике экспрессии генов данного семейства в корнях при действии ауксина. К сожалению, нам не удалось выявить общую тенденцию в гормонинду-цированной экспрессии генов группы GH3. Было показано, что кратковременная экспрессия характерна для генов GH3-1 и GH3-2, а для GH3-5 — стабильная, но близкая к пороговой (2-кратная). Только ген GH3.3 отличался быстрым и значительным накоплением РНК, сохраняющимся и после часа воздействия ауксина, что может указывать на особую роль этого гена в регуляции концентрации свободного гормона в развитии корня.
Последующий анализ выявил несколько иную тенденцию для генов группы SAUR. Слабое увеличение уровня транскриптов регистрировалось только на 30-й мин после начала воздействия лишь для генов SAUR9 и SAUR10. Более интенсивное усиление экспрессии представителей семейства было нами показано для листьев проростков арабидопсис (Шишова и др., 2011). Можно предположить, что хорошо известные данные об ауксинзависимом повышении накопления транскриптов для генов этого семейства были получены на целых проростках или же с использованием хорошо развитых органов. Полученные нами и имеющиеся в литературе данные указывают на то, что участие генов SAUR в трансдукции гормонального сигнала в корнях проростков арабидопсиса ограничено достаточно узким временным интервалом. Это положение остается в большой степени дискуссионным, так как в настоящее время недостаточно данных о возможной физиологической роли продуктов указанных генов.
Наряду с генами семейств Aux/IAA, GH3 и SAUR, характеризующихся доказанной чувствительностью к ауксину, нами была проанализирована экспрессия ряда генов, которые, по литературным данным, также отличались быстрым накоплением продуктов транскрипции. В первую очередь была исследована экспрессия генов, кодирующих транскрипционные факторы и/или белки, принимающие участие в трансдукции гормональных сигналов (табл. 1). Краткосрочной и достаточно сильной отзывчивостью характеризовались гены AT5G47370 (кодирует транскрип-
ционный фактор, характеризующийся наличием «лейци-новой застежки», homeobox-leucine zipper) и AT2G32870 (кодирует белок, аналогичный убиквитин-специфичной протеазе 12). Тем не менее экспрессия этих генов очень быстро возвращалась к исходному значению. Напротив, экспрессия гена AT1G78100, кодирующего F-box содержащий белок, возрастала более чем в 6 раз лишь через час ауксинового воздействия. У арабидопсиса идентифицировано около 200 F-box содержащих белков. Несколько ярких представителей относятся к группе рецепторов аукина. Функция данного белка, кодируемого геном AT1G78100, неизвестна, однако временная зависимость накопления продуктов его транскрипции может свидетельствовать о более позднем вовлечении в формирование адаптивного гормониндуцированного физиологического ответа.
В заключение следует отметить, что полученные результаты указывают на наличие специфичного для корней проростков арабидопсиса профиля экспрессии генов раннего ауксинового ответа, который в значительной степени модулируется с увеличением длительности гормонального воздействия. Особое значение, по-видимому, имеет быстрая и интенсивная экспрессия таких генов, как IAA1, IAA19, GH3-3, AT1G78100. В ряде случаев интенсивность накопление РНК отличалась от таковой, характеризующей полученные ранее данные с использованием целых проростков арабидопсиса (Abel, Theologis, 1996; Goda et al., 2002). Требуется последующее сравнительное исследование, направленное на выявление различий активации экспрессии в корнях и побегах проростков арабидопсиса при различных по времени воздействиях ауксина.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №13-04-00945-a), Министерства образования и науки РФ (соглашение №8093 от 23.07.2012, проект 2012-1.2.1-12-000-1013-003) и Совместной программы «Михаил Ломоносов II» Министерства образования и науки РФ и DAAD (РНП. 2.2.2.3.16191).
ЛИТЕРАТУРА
1. Шишова М. Ф., Опперман К., Пахлер М., Шталь Ф., Шерер Г. (2011) Орган-специфичная экспрессия ранних ауксин-зависимых генов проростков араби-допсиса. Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. Вып. 3. С. 89-100.
2. Ainley W. M., Walker J. C., Nagao R. T., Key J. L. (1988) Sequence and characterization of two auxin-regulated genes from soybean. J. Biol. Chem. Vol. 263. P. 10 658-10666.
3. Abel S., Oeller P. W, Theologis A. (1994) Early aux-ininduced genes encode short-lived nuclear proteins. PNAS. Vol. 91. P. 326-330.
4. Abel S., Nguyen M. D., Chow W. et al. (1995) ACS4, a primary indoleacetic acid-responsive gene encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate syn-
thase in Arabidopsis thaliana. Journal Biol. Chem. Vol. 270. P. 19 093-19099.
5. Abel S., Theologis A. (1995) A polymorphic bipartite motif signals nuclear targeting of early auxin-inducible proteins related to PS-IAA4 from pea (Pisum sativum). Plant J. Vol. 8. P. 87-96.
6. Abel S., Theologis A. (1996) Early genes and auxin action. Plant Physiology. Vol. 111. P. 9-17.
7. Bari R., Jones J. D. G. (2009) Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Mol Biol. Vol. 69. P. 473-488.
8. Bierfreund N. M., Tintelnot S., Reski R., Decker E. L. (2004) Loss of GH3 function does not affect phyto-chrome-mediated development in a moss, Physcomi-trellapatens. J. Plant Physiol. Vol. 161. P. 823-835.
9. Chehab E. W, Eich E., Braam J. (2009) Thigmomor-phogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. J. Exp. Botany. Vol. 60. P. 43-56.
10. Dargeviciute A., Roux C., Decreux A. et al. (1998) Molecular cloning and expression of the early auxin-responsive Aux/IAA gene family in Nicotiana ta-bacum. Plant Cell Physiol. Vol. 39. P. 993-1002.
11. Dharmasiri N., Estelle M. (2004) Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. Vol. 9. P. 302-308.
12. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Weijers D. et al. (2005) Plant development is regulated by a family of auxin receptor F box proteins. Dev. Cell. Vol. 9. P. 109-119.
13. Esmon C. A., Tinsley A. G., Ljung K. et al. (2006) A gradient of auxin and auxin-dependent transcription precedes tropic growth responses. PNAS. Vol. 103. P 236-241.
14. Gil P., Liu Y., Orbovic V. et al. (1994) Characterization of the auxin-inducible SAUR-AC1 gene for use as a molecular genetic tool in Arabidopsis. Plant Physiology. Vol. 104. P. 777-784.
15. Goda H., Sasaki E., Akiyama K. et al. (2008) The At-GenExpress hormone and chemical treatment data set: experimental design, data evaluation, model data analysis and data access. Plant J. Vol. 55. P. 526-542.
16. Goda H., Shimada Y., Asami T. et al. (2002) Microar-ray analysis of brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis. Plant Physiol. P. 130. P. 1319-1334.
17. Guilfoyle T. J. (1999) Auxin-regulated genes and promoters. In: Eds. P. J. J. Hooykaas, M. A. Hall, K. R. Lib-benga. Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones. Elsevier, Amsterdam. P. 423-459.
18. Guilfoyle T. J., McClure B. A., Gee M. A., Hagen G. (1993) Auxin-regulated transcription. Aust. J. Plant Physiol. Vol. 20. P. 489-502.
19. Hagen G., Guilfoyle T. J. (1985) Rapid induction of selective transcription by auxins. Mol. Cell. Biol. Vol. 5. P. 1197-1203.
20. Hagen G., Guilfoyle T. (2002) Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors. Plant Mol. Biol. Vol. 49. P. 373-385.
21. Hagen G., Kleinschmidt A., Guilfoyle T. (1984) Auxinreg-ulated gene expression in intact soybean hypocotyl and excised hypocotyl sections. Planta. Vol. 162. P. 147-153.
22. Hagen G., Martin G., Li Y., Guilfoyle T. J. (1991) Auxin-induced expression of the soybean GH3 promoter in transgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol. Vol. 17. P. 567-579.
23. Hao G.-F., Yang G.-F. (2010) The role of Phe82 and Phe351 in auxin-induced substrate perception by TIR1 ubiquitin ligase: A novel insight from molecular dynamics simulations. PLoS ONE 5 (5): e10742. doi:10.1371/journal.pone.0010742.
24. Ku S. J., Park J. Y., Ha S. B., Kim J. (2009) Overexpression of IAA1 with domain II mutation impairs cell elongation and cell division in inflorescences and leaves of Arabidopsis. J. Plant Physiol. Vol. 166. P. 548-553.
25. Lee D. J., Park J. W, Lee H. W, Kim J. (2009) Genome-wide analysis of the auxin-responsive transcriptome downstream of iaa1 and its expression analysis reveal the diversity and complexity of auxin-regulated gene expression. J. Ex. Botany. Vol. 60. P. 3935-3957.
26. Liscum E., and Reed, J. W (2001) Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development. Plant Mol. Biol. Vol. 49. P. 387-400.
27. McClure B. A., Guilfoyle T. J. (1987) Characterization of a class of small auxininducible soybean polyadeny-lated RNAs. Plant Mol. Biol. Vol. 9. P. 611-623.
28. McClure B. A., Guilfoyle T. (1989) Rapid redistribution of auxin-regulated RNAs during gravitropism. Science. Vol. 243. P. 91-93.
29. McClure B. A., Hagen G., Brown C. S. et al. (1989) Transcription, organization, and sequence of an auxin-regulated cluster in soybean. Plant Cell. Vol. 1. P 229-239.
30. Mockaitis K., Estelle M. (2008) Auxin receptors and plant development: a new signaling paradigm. Annu Rev Cell Dev Biol. Vol. 24. P. 55-80.
31. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. Vol. 15. P. 473-497
32. Muto H., Watahiki M. K., Nakamoto D. et al. (2007) Specificity and similarity of functions of the Aux/IAA genes in auxin signaling of Arabidopsis revealed by promoter-exchange experiments among MSG2/IAA19, AXR2/IAA7, and SLR/IAA14. Plant Physiology. Vol. 144. P 187-196.
33. Nebenfuhr A., White T. J., Lomax T. L. (2000) The dia-geotropica mutation alters auxin induction of a subset of the Aux/IAA gene family in tomato. Plant Mol. Biol. Vol. 44. P. 73-84.
34. Oeller P. W, Keller J. A., Parks J. E. et al. (1993) Structural characterization of the early indoleacetic acid-in-ducible genes, PS-IAA4/5 and PS-IAA6, of pea (Pisum sativum L.). J. Mol. Biol. 1993. Vol. 233. P. 789-798.
35. Ouellet F., Overvoorde P. J., Theologis A. (2001) IAA17/AXR3: biochemical insight into an auxin mutant phenotype. Plant Cell. Vol. 13. P. 829-841.
36. Patel D., Franklin K. A. (2009) Temperature-regulation of plant architecture. Plant Signaling & Behavior. Vol. 4. P. 577-579.
37. Park J. Y., Kim H. J., Kim J. (2002) Mutation in domain II of IAA1 confers diverse auxin-related phe-notypes and represses auxin-activated expression of Aux/IAA genes in steroid regulator-inducible system. Plant Journal. Vol. 32. P. 669-683.
38. Paponov I. A., Paponova M., Tealea Wet al. (2008) Comprehensive Transcriptome Analysis of Auxin Responses in Arabidopsis. Molecular Plant. Vol. 1. P. 321-337.
39. Pufky J., Qiu Y., Rao M. V. et al. (2003) The auxinin-duced transcriptome for etiolated Arabidopsis seedlings using a structure/function approach. Functional Integrative Genomics. Vol. 3. P. 135-143.
40. Redman J. C., Haas B. J., Tanimoto G., Town C. D. (2004) Development and evaluation of an Arabidopsis whole genome Affymetrix probe array. Plant Journal. Vol. 38. P. 545-561.
41. Roux C., Perrot-Rechenmann C. (1997) Isolation by differ ential display and characterization of a tobacco auxin-responsive cDNA Nt-gh3, related to GH3. FEBS Letters. Vol. 419. P. 131-136.
42. Scherer G., Zahn M., Callis J., Jones A. (2007) A role for phospholipase A in auxin-regulated gene expression. FEBS Letters. Vol. 581. P. 4205-4211.
43. Staswick P. E., Tiryaki I., Rowe M. (2002) Jasmonate response locus JAR1 and several related Arabidopsis genes encode enzymes of the firefly luciferase super-family that show activity on jasmonic, salicylic, and in-dole-3-acetic acids in an assay for adenylation. Plant Cell. Vol. 14. P. 1405-1415.
44. Staswick P. E., Serban B., Rowe M. et al. (2005) Characterization of an Arabidopsis enzyme family that conjugates amino acids to indole-3-acetic acid. Plant Cell. Vol. 17. P. 616-627.
45. Takase T., Nakazawa M., Ishikawa A. et al. (2004) ydk1-D, an auxin-responsive GH3 mutant that is involved in hypocotyl and root elongation. Plant Journal. Vol. 37. P. 471-483.
46. Tatematsu K., Kumagai S., Muto H. et al. (2004) MASSUGU2 encodes Aux/IAA19, an auxin-regulated protein that functions together with the transcriptional activator NPH4/ARF7 to regulate differential growth responses of hypocotyl and formation of lateral roots in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. Vol. 19. P. 379-393.
47. Theologis A., Huynh T. V., Davis R. W. (1985) Rapid induction of specific mRNAs by auxin in pea epicotyl tissue. J. Mol. Biol. Vol. 183. P. 53-68.
48. Tian Q., Reed J. W (1999) Control of auxin-regulated root development by the Arabidopsis thaliana SHY2/IAA3 gene. Development. Vol. 126. P 711-721.
49. Tian Q., Uhlir N. J., Reed J. W. (2002) Arabidopsis SHY2/IAA3 inhibits auxin-regulated gene expression. Plant Cell. Vol. 14. P. 301-319.
50. Ulmasov T., Hagen G., Guilfoyle T. J. (1997) ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements. Science. Vol. 276. P. 1865-1868
51. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T. J. (1997) Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. Vol. 9. P. 1963-1971.
52. Walker J. C., Key J. L. (1982) lsolation of cloned cD-NAs to auxin-responsive poly (A+) RNAs of elongating soybean hypocotyl. PNAS. Vol. 79. P. 7185-7189.
53. Wright R. M., Hagen G., Guilfoyle T. J. (1987) An aux-ininduced polypeptide in dicotyledonous plants. Plant Mol. Biol. Vol. 9. P. 625-634.
54. Yang T., Poovaiah B. W (2000) Molecular and biochemical evidence for the involvement of calcium/calmodulin in auxin action. J. Biol. Chem. Vol. 275. P 3137-3143.
55. Yang X., Lee S., So J. H. et. al. (2004) The IAA1 protein is encoded by AXR5 and is a substrate of SCFTIR1. Plant Journal. Vol. 40. P. 772-782.
56. Zhang Z., Wang M., Li Z., Li Q., He Z. (2008)Arabidopsis GH3.5 regulates salicylic acid-dependent and both NPR1-dependent and independent defense responses. Plant Signaling and Behavior. Vol. 3. P. 537-542.
ROOT-SPECIFIC EXPRESSION OF EARLY AUXIN-REGULATED GENES IN ARABIDOPSIS
Shishova M. F., Pahler M., Stahl F., Scherer G.
C SUMMARY: At the variable environmental conditions plant growth and development are under the control of different factors triggered shifts in hormonal balance and followed changes in intensity of hormone-induced gene expression. Root-specific expression of early auxin-regulated genes, belonged to Aux/lAAs, SAURs, ARFs u GH3s gene families, was tested with specially designed chip. An auxin treatment (15, 30 and 60 min) led to increase of IAA1, IAA3, IAA5, IAA11, IAA19 and GH3-1, GH3-3, GH3-5 genes. Intensification of SAUR9 and SAUR10 genes expression was less significant and appeared only at 30 min.
C KEY WORDS: Arabidopsis; auxin; gene expression; microarray. C REFERENCES (TRANSLITERATED)
1. Shishova M.F., Opperman K., Pahler M., Shtal' F., Sherer G. 2011. Organ-specifichnaja jekspressija rannih auksin-zavisimyh genov prorostkov arabidopsisa [Organ-specific expression of early auksin-dependent genes in arabidopsis plantlets]. Vestnik S.-Pe-terburgskogo un-ta. Ser. 3. Vyp. 3. S. 89-100.
2. Ainley W M., Walker J. C., Nagao R. T., Key J. L. 1988. Sequence and characterization of two auxin-regulated genes from soybean. J. Biol. Chem. Vol. 263. P 10 658-10 666.
3. Abel S., Oeller P. W, Theologis A. 1994. Early aux-ininduced genes encode short-lived nuclear proteins. PNAS. Vol. 91. P. 326-330.
4. Abel S., Nguyen M. D., Chow W et al., 1995. ACS4, a primary indoleacetic acid-responsive gene encoding 1 -ami-
nocyclopropane-1-carboxylate synthase in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. Vol. 270. P 19 093-19 099.
5. Abel S., Theologis A. 1995. A polymorphic bipartite motif signals nuclear targeting of early auxin-inducible proteins related to PS-IAA4 from pea (Pisum sativum). Plant J. Vol. 8. P. 87-96.
6. Abel S., Theologis A. 1996. Early genes and auxin action. Plant Physiology. Vol. 111. P. 9-17.
7. Bari R., Jones J. D. G. 2009. Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Mol Biol. Vol. 69. P 473-488.
8. Bierfreund N. M., Tintelnot S., Reski R., Decker E. L. 2004. Loss of GH3 function does not affect phyto-chrome-mediated development in a moss, Physcomi-trellapatens. J. Plant Physiol. Vol. 161. P. 823-835.
9. Chehab E. W, Eich E., Braam J. 2009. Thigmomor-phogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. J. Exp. Botany. Vol. 60. P. 43-56.
10. Dargeviciute A., Roux C., Decreux A. et al., 1998. Molecular cloning and expression of the early auxin-responsive Aux/IAA gene family in Nicotiana ta-bacum. Plant Cell Physiol. Vol. 39. P. 993-1002.
11. Dharmasiri N., Estelle M. 2004. Auxin signaling and reg. protein degradation. Trends Plant Sci. Vol. 9. P 302-308.
12. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Weijers D. et al., 2005. Plant development is regulated by a family of auxin receptor F box proteins. Dev. Cell. Vol. 9. P. 109-119.
13. Esmon C. A., Tinsley A. G., Ljung K. et al., 2006. A gradient of auxin and auxin-dependent transcription precedes tropic growth responses. PNAS. Vol. 103. P 236-241.
14. Gil P., Liu Y., Orbovic V. et al., 1994. Characterization of the auxin-inducible SAUR-AC1 gene for use as a molecular genetic tool in Arabidopsis. Plant Physiology. Vol. 104. P. 777-784.
15. Goda H., Sasaki E., Akiyama K. et al., 2008. The At-GenExpress hormone and chemical treatment data set: experimental design, data evaluation, model data analysis and data access. Plant J. Vol. 55. P. 526-542.
16. Goda H., Shimada Y., Asami T. et al., 2002. Microar-ray analysis of brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis. Plant Physiol. P. 130. P. 1319-1334.
17. Guilfoyle T. J. 1999. Auxin-regulated genes and promoters. Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones / Eds. P. J. J. Hooykaas, M. A. Hall, K. R. Libbenga. Elsevier, Amsterdam. P. 423-459.
18. Guilfoyle T. J., McClure B. A., Gee M. A., Hagen G. 1993. Auxin-regulated transcription. Aust. J. Plant Physiol. Vol. 20. P. 489-502.
19. Hagen G., Guilfoyle T. J. 1985. Rapid induction of selective transc. by auxins. Mol. Cell. Biol. Vol. 5. P 1197-1203.
20. Hagen G., Guilfoyle T. 2002. Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors. Plant Mol. Biol. Vol. 49. P. 373-85.
21. Hagen G., Kleinschmidt A., Guilfoyle T. 1984. Auxinreg-ulated gene expression in intact soybean hypocotyl and excised hypocotyl sections. Planta. Vol. 162. P 147-153.
22. Hagen G., Martin G., Li Y., Guilfoyle T. J. 1991. Auxin-induced expression of the soybean GH3 promoter in transgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol. Vol. 17. P. 567-579.
23. Hao G.-F., Yang G.-F. 2010. The role of Phe82 and Phe351 in auxin-induced substrate perception by TIR1 ubiquitin ligase: A novel insight from molecular dynamics simulations. PLoS ONE 5 (5): e10742. doi:10.1371/journal.pone.0010742.
24. Ku S. J., Park J. Y., Ha S. B., Kim J. 2009. Overexpression of IAA1 with domain II mutation impairs cell elongation and cell division in inflorescences and leaves of Arabidopsis. J. Plant Physiol. Vol. 166. P. 548-553.
25. Lee D. J., Park J. W, Lee H. W and Kim J. 2009. Genome-wide analysis of the auxin-responsive transcrip-tome downstream of iaa1 and its expression analysis reveal the diversity and complexity of auxin-regulated gene expression. J. Ex. Botany. Vol. 60. P. 3935-3957.
26. Liscum E., and Reed, J. W 2001. Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development. Plant Mol. Biol. Vol. 49. P. 387-400.
27. McClure B. A., Guilfoyle T. J. 1987. Characterization of a class of small auxininducible soybean polyadenylated RNAs. Plant Mol. Biol. Vol. 9. P. 611-623.
28. McClure B. A., Guilfoyle T. 1989. Rapid redistribution of auxin-regulated RNAs during gravitropism. Science. Vol. 243. P. 91-93.
29. McClure B. A., Hagen G., Brown C. S. et al., 1989. Transcription, organization, and sequence of an auxin-regulated cluster in soybean. Plant Cell. Vol. 1. P 229-239.
30. Mockaitis K., Estelle M. 2008. Auxin receptors and plant development: a new signaling paradigm. Annu Rev Cell Dev Biol. Vol. 24. P. 55-80.
31. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. Vol. 15. P. 473-497
32. Muto H., Watahiki M. K., Nakamoto D. et al., 2007. Specificity and similarity of functions of the Aux/IAA genes in auxin signaling of Arabidopsis revealed by promoter-exchange experiments among MSG2/IAA19, AXR2/IAA7, and SLR/IAA14. Plant Physiology. Vol. 144. P 187-196.
33. Nebenführ A., White T. J., Lomax T. L. 2000. The dia-geotropica mutation alters auxin induction of a subset of the Aux/IAA gene family in tomato. Plant Mol Biol. Vol. 44. P. 73-84.
34. Oeller P. W, Keller J. A., Parks J. E. et al., 1993. Structural characterization of the early indoleacetic acid-in-ducible genes, PS-IAA4/5 and PS-IAA6, of pea (Pisum sativum L.). J Mol Biol. 1993. Vol. 233. P. 789-798.
35. Ouellet F., Overvoorde P. J., Theologis A. 2001. IAA17/AXR3: biochemical insight into an auxin mutant phenotype. Plant Cell. Vol. 13. P. 829-841.
36. Patel D., Franklin K. A. 2009. Temperature-regulation of plant architecture. Plant Signaling & Behavior. Vol. 4. P. 577-579.
37. Park J. Y., Kim H. J., Kim J. 2002. Mutation in domain II of IAA1 confers diverse auxin-related phe-notypes and represses auxin-activated expression of Aux/IAA genes in steroid regulator-inducible system. Plant Journal. Vol. 32. P. 669-683.
38. Paponov I. A., Paponova M., Tealea W et al., 2008. Comprehensive Transcriptome Analysis of Auxin Responses in Arabidopsis. Molecular Plant. Vol. 1. P. 321-337.
39. Pufky J., Qiu Y., Rao M. V. et al., 2003. The auxinin-duced transcriptome for etiolated Arabidopsis seedlings using a structure/function approach. Functional Integrative Genomics Vol. 3. P. 135-143.
40. Redman J. C., Haas B. J., Tanimoto G., Town C. D. 2004. Development and evaluation of an Arabidopsis whole genome Affymetrix probe array. Plant Journal. Vol. 38. P. 545-561.
41. Roux C., Perrot-Rechenmann C. 1997. Isolation by differ ential display and characterization of a tobacco auxin-responsive cDNA Nt-gh3, related to GH3. FEBS Letters. Vol. 419. P. 131-136.
42. Scherer G., Zahn M., Callis J., Jones A. 2007. A role for phospholipase A in auxin-regulated gene expression. FEBS Letters. Vol. 581. P. 4205-4211.
43. Staswick P. E., Tiryaki I., Rowe M. 2002. Jasmonate response locus JAR1 and several related Arabidopsis genes encode enzymes of the firefly luciferase super-family that show activity on jasmonic, salicylic, and in-dole-3-acetic acids in an assay for adenylation. Plant Cell. Vol. 14. P. 1405-1415.
44. Staswick P. E., Serban B., Rowe M. et al., 2005. Characterization of an Arabidopsis enzyme family that conjugates amino acids to indole-3-acetic acid. Plant Cell. Vol. 17. P. 616-627.
45. Takase T., Nakazawa M., Ishikawa A. et al., 2004. ydk1-D, an auxin-responsive GH3 mutant that is involved in hypocotyl and root elongation. Plant Journal. Vol. 37. P. 471-483.
C Информация об авторах
Шишова Мария Федоровна — д. б. н., профессор, биологический факультет, кафедра физиологии и биохимии растений. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: [email protected].
Пахлер Мартин — исследователь, факультет естественных наук, отделение технической химии. Университет им. Лейбница. D-30167, Каллин штрассе, д. 3, Ганновер, Германия. E-mail: [email protected].
Шталь Франк — профессор, факультет естественных наук, отделение технической химии. Университет им. Лейбница. D-30167, Каллин штрассе, д. 3, Ганновер, Германия. E-mail: [email protected].
Шерер Гюнтер — профессор, факультет естественных наук, отделение декоративного растениеводства, кафедра молекулярной физиологии растений. Университет им. Лейбница. D-30419, Херренхойзер штрассе, д. 2, строение 4116, Ганновер, Германия. E-mail: [email protected].
46. Tatematsu K., Kumagai S., Muto H. et al., 2004. MASSUGU2 encodes Aux/IAA19, an auxin-regulated protein that functions together with the transcriptional activator NPH4/ARF7 to regulate differential growth responses of hypocotyl and formation of lateral roots in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. Vol. 19. P. 379-393.
47. Theologis A., Huynh T. V., Davis R. W. 1985. Rapid induction of specific mRNAs by auxin in pea epicotyl tissue. J. Mol. Biol. Vol. 183. P. 53-68.
48. Tian Q., Reed J. W 1999. Control of auxin-regulated root development by the Arabidopsis thaliana SHY2/IAA3 gene. Development. Vol. 126. P 711-721.
49. Tian Q., Uhlir N. J., Reed J. W. 2002. Arabidopsis SHY2/IAA3 inhibits auxin-regulated gene expression. Plant Cell. Vol. 14. P. 301-319.
50. Ulmasov T., Hagen G., Guilfoyle T. J. 1997. ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements. Science. Vol. 276. P. 1865-1868
51. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T. J. 1997. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. Vol. 9. P. 1963-1971.
52. Walker J. C., Key J. L. 1982. lsolation of cloned cDNAs to auxin-responsive poly (A+) RNAs of elongating soybean hypocotyl. PNAS. Vol. 79. P. 7185-7189.
53. Wright R. M., Hagen G., Guilfoyle T. J. 1987. An aux-ininduced polypeptide in dicotyledonous plants. Plant Mol. Biol. Vol. 9. P. 625-634.
54. Yang T., Poovaiah B. W 2000. Molecular and biochemical evidence for the involvement of calcium/calmodulin in auxin action. J. Biol. Chem. Vol. 275. P 3137-3143.
55. Yang X., Lee S., So J. H. et. al., 2004. The IAA1 protein is encoded by AXR5 and is a substrate of SCFTIR1. Plant Journal. Vol. 40. P. 772-782.
56. Zhang Z., Wang M., Li Z., Li Q., He Z. 2008. Arabidopsis GH3.5 regulates salicylic acid-dependent and both NPR1-dependent and independent defense responses. Plant Signaling and Behavior. Vol. 3. P. 537-542.
Shishova Mariya Fedorovna — Professor, Faculty of Biology, Department of Plant Physiology and Biochemistry. Saint Petersburg State University. 199034, Saint-Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9. Russia. E-mail: [email protected].
Pahler Martin — Scientific Researcher, Fakultaet fuer Naturwissenschaften, Institut fuer Technische Chemie. Leibniz Universitaet Hannover. D-30167, Hannover, Callinstrasse, 3. Deutschland. E-mail: [email protected].
Stahl Frank — Professor, Fakultaet fuer Naturwissenschaften, Institut fuer Technische Chemie. Leibniz Universitaet Hannover. D-30167, Hannover, Callinstrasse, 3. Deutschland. E-mail: [email protected].
Scherer Guenther — Professor, Fakultaet fuer Naturwissenschaften, Institut fuer Zierpflanzen- und Gehoelzwissenschaften, Abteilung Molekulare Ertragsphysiologie. Leibniz Universitaet Hannover. D-30419, Hannover, Herrenhaeuser Strasse, 2, Gebaeude 4116. Deutschland. E-mail: [email protected].
