CC BY
11
УДК 615.324:615.272:616.613-003.7
0 РОЛИ ПРЯМОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ В МЕХАНИЗМЕ АНТИЛИТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ТРИПЕПТИДА LEU-ILE-LYS
1Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул
2Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины, г. Новосибирск
Жариков А.Ю.12, Мазко О.Н.1, Макарова О.Г.1, Госсен И.Е.1, Якушев Н.Н.1, Жарикова Г.В.1
Установлено, что трипептид Leu-Ile-Lys обладает выраженным антилитогенным эффектом, который, предположительно, носит мембранотропный характер. Вероятно, он может быть обусловлен прямым антиоксидантным действием трипептида. Теоретические расчеты количественных отношений между структурой и активностью Leu-Ile-Lys подтверждают такую возможность. Мы решили изучить прямой антиоксидантный эффект трипептида Leu-Ile-Lys, чтобы оценить его вклад в механизм антилитоген-ного действия. Цель исследования - изучить влияние трипептида Leu-Ile-Lys на общую антиоксидантную активность и общую прооксидантную активность в условиях in vitro.
Материалы и методы. Использовались субстанции трипептида Leu-Ile-Lys и дипептида карнозин (препарат сравнения). Изготавливались их растворы в концентрациях 2, 4 и 8 мг/мл. Определялась общая анти-оксидантная (ОАА) и общая прооксидантная активность (ОПА) in vitro. ОАА определяли по способности угнетать Fe2+/аскорбат-индуцированное окисление ТВИН-80. ОПА оценивали по интенсивности окраски продуктов взаимодействия ТВИН-80 с тиобарбитуровой кислотой.
Результаты и обсуждение. Установлено, что ОАА карнозина последовательно возрастала в 6,9 раза, а ОПА последовательно снижалась в 6,7 раза. ОАА трипептида Leu-Ile-Lys увеличивалась в 2-2,8 раза при сопутствующем увеличении ОПА в 2,3-4,9 раза. Для всех разведений ОАА трипептида статистически значимо уступала уровню карнозина, а ОПА в разведениях 4 и 8 мг/мл статистически значимо превышала уровень карнозина. По-видимому, прямое антиоксидантное действие трипептида Leu-Ile-Lys незначительно и не может объяснить его антилитогенное действие.
Заключение. В сравнении с карнозином трипептид Leu-Ile-Lys обладает незначительным прямым антиоксидантным эффектом.
Ключевые слова: трипептид Leu-Ile-Lys, прямой антиоксидантный эффект, механизм антилитогенного действия.
ON THE ROLE OF DIRECT ANTIOXIDANT ACTIVITY IN THE MECHANISM OF ANTI-LITHOGENIC ACTION OF TRIPEPTIDE LEU-ILE-LYS
1 Altai State Medical University, Barnaul
2Scientific-Research Institute of Physiology and Basic Medicine, Novosibirsk
A.Yu. Zharikov12, O.N. Mazko1, O.G. Makarova1, I.E. Gossen1, N.N. Yakushev1, G.V. Zharikova1
Tripeptide Leu-Ile-Lys has been found to have a pronounced anti-lithogenic effect, which is presumably membrane trophic in nature. It can probably be due to the direct antioxidant action of the tripeptide. Theoretical calculations of the quantitative relationship between Leu-Ile-Lys structure and activity confirm this possibility. We decided to study the direct antioxidant effect of the tripeptide Leu-Ile-Lys to assess its contribution to the mechanism of anti-lithogenic action. The research objective was to study the effect of the tripeptide Leu-Ile-Lys on total antioxidant status and total prooxidant status under in vitro conditions.
Materials and methods. Tripeptide Leu-Ile-Lys and dipeptide carnosine (comparison drug) substances were used. Their solutions were made in concentrations of 2, 4 and 8 mg/ml. Total antioxidant (TAS) and total prooxidant (TPS) statuses were determined in vitro. TAS was determined by the ability to inhibit FE2+/ascorbate-induced oxidation of Tween-80. TPS was evaluated by the intensity of staining of products of Tween-80 interaction with thiobarbituric acid.
Results and discussion. It was found that carnosine TAS consistently increased by 6.9 times, and TPS consistently decreased by 6.7 times. Tripeptide Leu-Ile-Lys TAS increased by 2-2.8 times with a concomitant increase in TPS by 2.3-4.9 times. For all dilutions, tripeptide TAS was statistically significantly inferior to carnosine levels, and TPS in dilutions of 4 and 8 mg/ml statistically significantly exceeded carnosine levels. Apparently, the direct antioxidant
effect of tripeptide Leu-Ile-Lys is negligible and cannot explain its anti-lithogenic effect. Conclusion. In comparison with carnosine, tripeptide Leu-Ile-Lys has a minor direct antioxidant effect. Keywords: tripeptide Leu-Ile-Lys, direct antioxidant effect, mechanism of anti-lithogenic action.
Ранее в экспериментах на животных нами был выявлен выраженный антилитогенный эффект трипептида Leu-Ile-Lys при 6-недельном оксалатном нефролитиазе [1, 2]. Затем данный эффект был подтвержден в условиях хронического 16-недельного экспериментального окса-латного нефролитиаза [3].
Исходя из полученных данных биохимического исследования функций почек подопытных крыс в указанных экспериментах, возникло предположение, что механизм антилитогенно-го эффекта трипептида может быть напрямую или косвенно обусловлен его мембранотроп-ным действием, на что в том числе указывало снижение концентрации в почках тиобарбиту-ратреактивных продуктов - основного продукта перекисного окисления мембранных фосфоли-пидов [1].
Не исключено, что это могло происходить вследствие прямого антиоксидантного эффекта трипептида Leu-Ile-Lys. Возможность наличия такого эффекта имеет расчетное подтверждение. Так, расчеты количественных отношений между структурой и активностью (QSAR) для потенциальных антиоксидантных трипепти-дов показали, что структура пептида Leu-Ile-Lys имеет положительный антиоксидантный потенциал, а именно: условный вклад аминокислоты лейцин в положении 1 составил плюс 0,05, аминокислоты изолейцин в положении 2
- плюс 0,4, аминокислоты лизин в положении 3 - минус 0,1 [4].
Учитывая вышесказанное, мы решили изучить прямое влияние трипептида Leu-Ile-Lys на активность процесса свободнорадикального окисления, чтобы оценить его вклад в механизм антилитогенного действия пептида.
Таким образом, цель исследования - изучить влияние трипептида Leu-Ile-Lys на общую антиоксидантную активность и общую проок-сидантную активность в условиях in vitro.
Материалы и методы
Для проведения экспериментов была использована субстанция трипептида Leu-Ile-Lys, полученная методом химического синтеза на предприятии SHANGHAI АРЕРТГОЕ CO., LTD (г. Шанхай, Китайская народная республика) при посредничестве ЗАО «Эвалар». Чистота образца составила не менее 98%. В качестве препарата сравнения использовали карнозин
- дипептид Ala-His с широко известными свойствами прямого пептидного антиоксиданта [5, 6]. Субстанция карнозина с чистотой не менее 98% была получена от ЗАО «Эвалар».
Для каждого пептида были приготовлены растворы в трех разведениях с концентрациями 2 мг/мл, 4 мг/мл и 8 мг/мл. Это растворы использовались для изучения общей антиокси-дантной активности и общей прооксидантной активности в условиях in vitro.
Общую антиоксидантную активность (ОАА) определяли по способности пептида угнетать Fe2+/аскорбат-индуцированное окисление ТВИН-80. Суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов, общую прооксидантную активность (ОПА) оценивали по интенсивности окраски флуоресцентного комплекса, образующегося при взаимодействии продуктов перекисного окисления ТВИН-80 с тиобарби-туровой кислотой [7, 8]. Для всех растворов измерения проводили на 20 образцах. По итогам измерений рассчитывали индекс соотношения ОАА/ОПА.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием компьютерной программы STATISTICA 13.3.1. (лицензия JPZ906I448517FAACD-K). Результаты исследований представлены медианой и интерквартиль-ным размахом (Me (25%;75%)). Статистические сравнения между группами проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни [9].
Результаты и обсуждение
Проведенные эксперименты показали, что препарат сравнения карнозин, как и ожидалось, продемонстрировал выраженные свойства прямого антиоксиданта (рисунок 1). Так, в концентрации раствора карнозина 2 мг/мл ОАА составила 10,0 (7,3;12,3) %, а ОПА - 41,0 (39,0;44,4) %. Индекс 0АА/0ПА=0,24. При увеличении концентрации карнозина в растворе в 2 раза его ОАА увеличилась в 4 раза и составила 40,7 (28,9;51,9) %. ОПА при этом, напротив, уменьшилась в 2,2 раза до значения 18,7 (10,0;26,0) %. Индекс ОАА/ОПА=2,2. В максимальной концентрации (8 мг/мл) ОАА раствора карнозина равнялась 68,9 (67,7;70,1) %, ОПА - 6,1 (3,8;7,9) %. Индекс ОАА/ОПА=11,3.
Как показано на рисунке 2, ОАА раствора трипептида Leu-Ile-Lys в концентрации 2 мг/мл составила 6,5 (6,2;7,6) %, что было меньше, чем у раствора карнозина, в 1,5 раза (p=0,008). ОПА равнялась 12,5 (6,1;17,2) %, уступая уровню препарата сравнения в 3,3 раза (p<0,001). Индекс ОАА/ОПА для раствора трипептида Leu-Ile-Lys в концентрации 2 мг/мл составил 0,52. ОАА раствора трипептида Leu-Ile-Lys в концентрации
Рисунок 1 - Динамика общей антиоксидантной активности и общей прооксидантной активности растворов карнозина. «Легенда»: по горизонтальной оси - название показателя и единицы измерения. По вертикальной оси - значение показателя. Значения представлены в виде медианы и интерквартильного размаха.
Рисунок 2 - Динамика общей антиоксидантной активности и общей прооксидантной активности растворов
трипептида Leu-Ile-Lys. «Легенда»: по горизонтальной оси - название показателя и единицы измерения. По вертикальной оси - значение показателя. Значения представлены в виде медианы и
интерквартильного размаха.
4 мг/мл увеличилась в 2,8 раза и составила 18,1 (15,8;19,0) %, что, однако, было ниже уровня препарата сравнения в 2,2 раза (p<0,001). При этом у раствора трипептида существенно возросла и ОПА, составив 60,8 (57,8;63,6) %, что превышало величину данного показателя у карнозина в 3,3 раза (p<0,001). Индекс ОАА/ОПА=0,30. В концентрации 8 мг/мл ОАА раствора трипептида Leu-Ile-Lys несколько снизилась и равнялась 12,7 (11,4;14,2) %, уступая уровню препарата сравнения уже в 5,4 раза (p<0,001). ОПА раствора трипептида при этом также снизилась (28,9 (26,3;31,3) %), но по-прежнему превышала ОПА раствора карнозина - в 4,7 раза (p<0,001). Индекс ОАА/ОПА=0,44.
Заключение
В результате проведенных экспериментов установлено, что по мере увеличения концентрации раствора карнозина его ОАА последовательно и выраженно возрастала, а ОПА столь же последовательно и выраженно снижалась. Как следствие, наблюдалось значительное увеличение индекса ОАА/ОПА более 1, что свидетельствует о преобладании антиоксидантных свойств над прооксидантными. Это хорошо согласуется с известными свойствами карнози-на как мощного прямого антиоксиданта и подтверждает корректность использования его в качестве препарата сравнения.
На этом фоне характер влияния трипепти-да Leu-Ile-Lys на ОАА и ОПА в условиях in vitro отличался. Так, наблюдалось некоторое увеличение ОАА при росте концентрации пептида в растворе, однако оно было менее выражено, чем у карнозина. Кроме того, рост ОАА сопровождался ростом и ОПА. По всей видимости, свойства прямого неферментного антиоксидан-та у трипептида Leu-Ile-Lys не столь выражены, в связи с чем зафиксированные ранее благоприятные изменения в картине оксидативного стресса в почках при нефролитиазе на фоне лечения изучаемым трипептидом, вероятно, были обусловлены косвенным влиянием на системы антиоксидантной защиты клеток, характер которого еще предстоит изучать.
Отметим также, что фармакодинамика ан-тилитогенного эффекта трипептида Leu-Ile-Lys, вполне возможно, в большей степени базируется на механизмах, не связанных с его антирадикальной активностью. Так, например, важную роль может играть выраженное снижение пересыщения мочи литогенными ионами кальция, обнаруженное нами в предыдущих экспериментах [2]. Разумеется, данные предположения нуждаются в детальном изучении, на что и будут направлены дальнейшие исследования.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об
отсутствии конфликта интересов.
Список литературы:
1. Жариков А.Ю., Якушев Н.Н., Жарикова Г.В., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Лепилов А.В., Бобров И.П. Влияние трипептида Leu-Ile-Lys на течение экспериментального оксалатного неф-ролитиаза. Бюллетень экспериментальной биологии и медицине. 2019;167(6): 704-708.
2. Жариков А.Ю., Якушев Н.Н., Жарикова Г.В. Фармакологическое средство для лечения мочекаменной болезни Пат. РФ № 2679120; опубл. 06.02.2019.
3. Жариков А.Ю., Якушев Н.Н., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Лепилов А.В., Бобров И.П., Жарикова Г.В., Киселев В.И. Опыт применения трипептида LEU-ILE-LYS для экспериментальной терапии хронического 16-недельного окса-латного нефролитиаза у крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицине. 2020;169(2): 197-202.
4. Chen N., Chen JI., Yao B., Zhengguo Li. QSAR Study on Antioxidant Tripeptides and the Antioxidant Activity of the Designed Tripeptides in Free Radical Systems. Molecules. 2018; 3(6): 1407. DOI: 10.3390/molecules23061407
5. Ярыгина Е.Г., Прокопьева В.Д., Бохан Н.А. Окислительный стресс и его коррекция карнозином. Успехи современного естествознания. 2015; 4: 106-113.
6. Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine. Physiol Rev. 2013;93(4): 1803-1845. DOI: 10.1152/phys-rev.00039.2012.
7. Волобой Н.Л., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Талалаева О.С., Замятина С.В., Зяблова О.Н., Смирнов И.В. Антиоксидантный и проок-сидантный эффекты арбутина и гидрохинона в эксперименте in vitro. Бюллетень сибирской медицины. 2011;10(5): 41-44.
8. Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. Жариков А.Ю., Талалаева О.С. Методы доклинического (экспериментального) исследования влияния лекарственных средств на функцию почек. Новосибирск. АИ Гео; 2013: 84.
9. Хафизьянова Р.Х., Бурыкин И.М., Алее-ва Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной и клинической фармакологии. Казань: Медицина; 2006: 374.
References
1. Zharikov A.Yu., Yakushev N.N., Zhariko-va G.V., Mazko O.N., Makarova O.G., Lepilov A.V., Bobrov I.P. Influence of Leu-Ile-Lys tripeptide on experimental oxalate nephrolithiasis. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2019;167(6): 704708. (In Russ.)
2. Zharikov A.Yu., Yakushev N.N., Zharikova G.V. Pharmacological agent for the treatment of
urolithiasis. Patent of the RF No. 2679120; publication date 06.02.2019.
3. Zharikov A.Yu., Yakushev N.N., Mazko O.N., Makarova O.G., Lepilov A.V., Bobrov I.P. et al. Experience with tripeptide Leu-Ile-Lys for experimental therapy of chronic 16-week oxalate nephrolithiasis in rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2020;169(2): 197-202. (In Russ.)
4. Chen N., Chen JI., Yao B., Zhengguo Li. QSAR Study on Antioxidant Tripeptides and the Antioxidant Activity of the Designed Tripeptides in Free Radical Systems. Molecules. 2018; 3(6): 1407. DOI: 10.3390/molecules23061407
5. Yarygina E.G., Prokopyeva V.D., Bokhan N.A. Oxidative stress and its correction with carnosine. Advances in Current Natural Sciences. 2015; 4: 106-113. (In Russ.)
6. Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine. Physiol Rev. 2013;93(4): 1803-1845. DOI: 10.1152/ physrev.00039.2012.
7. Voloboy N.L., Zverev Ya.F., Bryukhan-ov V.M., Talalaeva O.S., Zamyatina S.V., Zyablo-va O.N., Smirnov I.V. Antioxidant and prooxi-dant effects of arbutin and hydroquinone in the experiment in vitro. Bulletin of Siberian Medicine. 2011;10(5): 41-44. (In Russ.)
8. Bryukhanov V.M., Zverev Ya.F., Lampatov V.V. Zharikov A.Yu., Talalaeva O.S. Methods of preclinical (experimental) research of the effect of medicines on renal function. Novosibirsk. AI Geo; 2013: 84. (In Russ.)
9. Khafiziyanova R.Kh., Burykin I.M., Aleeva G.N. Mathematical statistics in experimental and clinical pharmacology. Kazan: Medicina; 2006: 374. (In Russ.)
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Жариков Александр Юрьевич, д.б.н., доцент, заведующий кафедрой фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул; Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины, г. Новосибирск.
656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Тел.: +79130825477. E-mail: zharikov_a_y@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4884-220X
Информация об авторах
Мазко Олеся Николаевна, к.б.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126.
Тел.: (3852) 566891.
E-mail: olesia.mazko@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0001-7299-4516
Макарова Олеся Геннадьевна, к.фарм.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656038, г. Барнаул, пер. Некрасова, 65. Тел.: (3852) 566893. E-mail: olesia552@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7771-9468
Госсен Иван Егорович, к.м.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: gossen@agmu.ru
Якушев Николай Николаевич, к.м.н., доцент кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: yakushevnn@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-4059-569X
Жарикова Ганна Викторовна, к.б.н., преподаватель кафедры общей и биологической химии, клинической лабораторной диагностики Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566938. E-mail: ganna1704@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3227-2348
Поступила в редакцию 08.02.2021 Принята к публикации 26.03.2021
Для цитирования: Жариков А.Ю., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Якушев Н.Н., Жарикова Г.В. О роли прямой антиоксидантной активности в механизме антилитогенного действия три-пептида Leu-Ile-Lys. Бюллетень медицинской науки. 2021;1(21): 94-98.
Citation: Zharikov A.Yu., Mazko O.N., Makarova O.G., Gossen I.E., Yakushev N.N., Zharikova G.V. On the role of direct antioxidant activity in the mechanism of anti-lithogenic action of tripeptide Leu-Ile-Lys. Bulletin of Medical Science. 2021;1(21): 94-98. (In Russ.)
