Научная статья на тему 'О роли глицина в регуляции скорости переноса электронов в реакционном центре фотосистемы II'

О роли глицина в регуляции скорости переноса электронов в реакционном центре фотосистемы II Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
236
35
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР / ТРАНСМЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ / ВАН-ДЕР-ВААЛЬСОВЫ СИЛЫ / КОМБИНАТОРНЫЙ МУТАГЕНЕЗ / ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ / REACTION CENTER / TRANSMEMBRANE PROTEINS / VAN-DER-WAALS FORCES / COMBINATORIAL MUTAGENESIS / HYDROGEN BOND

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Шлык-кернер Оксана Владимировна, Кафтан Давид, Шерц Авигдор

Аминокислота (АК) глицин (Гли) белка D1 может участвовать в слабых белок-белковых взаимодействиях. Они важны для изменения конформаций реакционного центра (РЦ) фотосистемы II (ФСII), таким образом, регулируя скорость переноса электронов (ПЭ) в белке. Гли замещался на 20 АК мутагенезом в цианобактериях Synechocystis РСС6803. Только три мутанта поддержали фотоавтотрофный рост организма. Показано, что функция белка и скорость ПЭ в мутантах уменьшались прямо пропорционально размеру АК, тогда как энергия активации возрастала. Результаты указывают на центральную роль Гли в образовании межбелковых связей и регуляции скорости ПЭ в РЦ ФСII.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Шлык-кернер Оксана Владимировна, Кафтан Давид, Шерц Авигдор

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Glycine at the reaction center of photosystem II plays key role in regulation of electron transfer rates

Amino acid (AA) glycine (Gly) of D1 protein may participate in protein-protein interactions. They are important for conformational change that may regulate the electron transfer (ET) rates in the photosystem II (PSII) reaction center protein (RC). Gly was replaced by 20 AA by mutagenesis in cyanobacteria Synechocystis PCC 6803. Only three mutants supported the photoautotrophic growth of an organism. It was shown that function of protein and ET rates in mutants decreased in direct ratio to the AA size. On the contrary, energy of activation of ET at mutants increased. Results indicate at central role of Gly in inter-protein interactions forming and ET rates regulation in PSII RC.

Текст научной работы на тему «О роли глицина в регуляции скорости переноса электронов в реакционном центре фотосистемы II»

УДК 577.112.389.5(045)

О.В. Шлык-Кернер, Д. Кафтан, А. Шерц

О РОЛИ ГЛИЦИНА В РЕГУЛЯЦИИ СКОРОСТИ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В РЕАКЦИОННОМ ЦЕНТРЕ ФОТОСИСТЕМЫ II

Аминокислота (АК) глицин (Гли) белка D1 может участвовать в слабых белок-белковых взаимодействиях. Они важны для изменения конформаций реакционного центра (РЦ) фотосистемы II (ФСП), таким образом, регулируя скорость переноса электронов (ПЭ) в белке. Гли замещался на 20 АК мутагенезом в цианобактериях Syne-chocystis РСС6803. Только три мутанта поддержали фотоавтотрофный рост организма. Показано, что функция белка и скорость ПЭ в мутантах уменьшались прямо пропорционально размеру АК, тогда как энергия активации возрастала. Результаты указывают на центральную роль Гли в образовании межбелковых связей и регуляции скорости ПЭ в РЦ ФСП.

Ключевые слова: реакционный центр, трансмембранные белки, Ван-дер-ваальсовы силы, комбинаторный мутагенез, водородная связь.

Реакционный центр (РЦ) фотосистемы II (ФС11) - это трансмембранный (ТМ) белково-пигментный комплекс, который катализирует превращение солнечной энергии в электро-химический потенциал в про- и эукариотах. Превращение энергии происходит при помощи переноса электронов (ПЭ), вызванного квантом света, между различными кофакторами, которые нековалентно связанны с белковым матриксом. Сформировавшийся потенциал катализирует окисление воды и мобилизацию протонов, результатом чего является освобождение молекулярного кислорода и гидрохинона. Структура ФСП термофильных цианобактериий Thermosynechococcus elongatus была опубликована недавно при разрешении 3.5 А [1] и 3.0 А [2], показывая высокую гомологию с давно известными структурами РЦ различных видов пурпурных бактерий [3; 4]. Как и предполагалось ранее, ядро РЦ ФСП состоит из двух гомологичных белковых субъединиц D1 и D2, каждая из которых содержит пять ТМ альфа-спиралей, A, B, C, D и Е. В основном пигменты-переносчики связаны D спиралями D1 и D2 субъединиц, расположенных близко к зеркальной симметрии (С2). Эти спирали пересекают друг друга в середине мембраны, формируя структуру, похожую на «Х». Верхние части «Х» связывают неге-мовое железо, а также два пластохинона (QA и Qв), совместно образуя акцепторную часть РЦ ФСП. Нижние части, погруженные в цитозоль, образуют область донора и содержат «специальную пару» хлорофиллов (Хл), Р680, два дополнительных Хл и феофетина [5]. Следуя прямому или непрямому (посредством антенны Хл) фотовозбуждению, электрон перемещается от донора к акцептору комплекса РЦ в несколько этапов. На заключительном этапе молекула QA переносит электрон к Qв, который подвергается дополнительному протонированию [6]. После получения второго электрона от QA и прохождения дополнительного протонирования дважды восстановленный Qв покидает свой сайт как QH2 и замещается другой молекулой Qв из пула хинонов.

Часто обсуждается роль белка в регуляции скорости ПЭ и получении энергии. Мы предложили механизм адаптации скорости ПЭ между кофакторами QA (связан с белком D2) и Qв (связан с D1) к температуре окружающей среды [7]. В соответствии с предложенным механизмом электрон в РЦ далее не ускоряется при значениях температур выше физиологических. Более того, мы показали, что скорость ПЭ от QA к Qв выходит на плато около значений физиологических температур у мезофилов и термофилов, достигая очень похожих скоростей при разных температурах (Там же). Механизм адаптации связан с мотивом ГлихххГли, который находится рядом с белковыми впадинами, близкими к области пересечения D спиралей. Мы показали при помощи анализа т silico, что, изменяя расстояние и, таким образом, силу Ван-дер-ваальсовых взаимодействий между атомами одной или двух аминокислот (АК) внутри мотива, одна из впадин, обнаруженная рядом с участком Qв, может полностью заблокироваться. Эксперименты в клетках цианобактерий показали, что энтропия активации для ПЭ от QA к Qв изменялась, таким образом, регулируя адаптацию мезофилов и термофилов к различным температурам среды (Там же). Изменения в энтропии активации были связаны с модификацией локальной конформации белка из-за разрушения впадины. Эти опубликованные данные поднимают несколько вопросов: как и насколько возможно изменить гибкость белка без нарушения его стабильности? И наоборот - насколько можно увеличить стабильность определенной белковой структуры без нарушения ее функциональности? Соответствует ли этим требованиям мотив ГлихххГли, в частно-

сти? Некоторые из этих вопросов задавались в контексте других белковых комплексов [8]. Однако белки, осуществляющие фундаментально важный процесс фотосинтетического превращения энергии, являются привлекательной моделью для ответа на эти вопросы. В данной модели можно измерить скорость ПЭ от Qa к QB и найти четкую взаимосвязь между мутациями, а значит изменением силы взаимодействия между атомами в мотиве ГлихххГли и скоростью реакции. Более того, известны кристаллические структуры с высоким разрешением белков, участвующих в фотосинтезе [1; 2] и есть методы, позволяющие проследить реакцию ПЭ в целых (неразрушенных) клетках цианобактерий.

В этой работе мы сфокусировали наше внимание на сайте D1-208, который входит в состав мотива ГлихххГли. Этот сайт занят аминокислотой (АК) Гли (в основном) в эукариотических и прокариоти-ческих организмах (рис. 1). Глицин не имеет боковой цепи, таким образом, он способен образовывать большое разнообразие пространственных конформаций остова альфа-цепи и повышать местную гибкость белка. Несколько исследований показали, что Гли присутствует в ТМ доменах мембранных белков. Здесь остатки Гли могут функционировать как молекулярные метки, которые отвечают за расположение альфа-спиралей в нативных белках [9; 10]. Более того, Гли был найден в последовательности мотива ГлихххГли, который обуславливает взаимодействие ТМ альфа-спиралей [11-13]. Анализ АК последовательностей в мембранных белках показывает высокую концентрацию Гли на поверхностях спираль-спиральных контактов и в точках пересечения спиралей [10; 14]. В целом предполагается, что Гли и другие малые АК стабилизируют спиральные мембранные белки (делая возможным образование Ван-дер-ваальсовых связей) и одновременно допускают функциональную гибкость структуры [15].

В свете изложенных наблюдений мы применили комбинаторный мутагенез к сайту D1-208 РЦ ФСИ и проанализировали полученных мутантов, используя измерения фотосинтетической активности, скорости ПЭ и расчёт энергии активации для реакции ПЭ от QA к QB в зависимости от температуры.

Материалы и методика исследования

Сравнительный анализ последовательностей. Последовательности ТМ спиралей D белка D1 РЦ ФСИ (рис. 1), полученные из базы данных SwissProt, были выровнены с помощью CLUSTALW [16] и вручную отредактированы. Структурные модели РЦ ФСП, полученные из Thermosynechococcus elongatus, были проанализированы с помощью программы визуализации белковых структур Swiss-pdb-viewer для обнаружения белок-белковых взаимодействий в ТМ области (рис. 2).

Условия культивирования и рост. Дикий тип и мутантные линии Synechocystis РСС 6803 были выращены на агаризованной среде BG 11, как описано ранее [7]. Жидкие культуры были выращены при стандартных условиях. Клетки для измерения флуоресценции Хл собирались в экспоненцио-нальной фазе роста при концентрации 4цмоль Хл а"1 [17].

Измерение скорости роста. Капля клеток 10цл жидкой культуры (0D730=0.1), выращенной при стандартном освещении и температуре, была размещена на агарозной пластине среды BG-11. Эти клетки выращивались в течение трех дней при слабом освещении (10цмоль м"2с_1). Жидкие культуры также были перемещены под слабое освещение (10цмоль м~2с_1) или стандартное освещение (50 цмоль м~2с_1) для иммуноблотинга, где выращивались в течение 7 дней. Аликвоты объёмом 3 мл отбирались из этих культур каждые 24 часа и измерялись спектрометрически, используя Jasco V-570 спектрофотометр (Jasco Incorp., USA).

Подготовка мутантов. Основанный на ПЦР комбинаторный мутагенез гена psbAII Synechocystis РСС 6803, кодирующего белок D1, был выполнен в соответствии с [18; 19]. Фрагмент гена 3' psbAII , имеющий мутацию в позициях 622-62492, соответствующий D1-G208, был создан с помощью праймера Р3 и праймера Р208 (табл.), кодирующего все 20 АК. Специальные олигонуклеотиды Х208 (табл.) были созданы, чтобы ввести кодоны в участок D1-208, соответствующие АК, которые не были получены при комбинаторном мутагенезе.

ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг. Тилакоиды были получены, как описано ранее [20]. Тилако-идные белки были растворены в буферном растворе (0.5 М Трис-HCl pH 6.8, 1% додецилсульфата натрия (ДСН), 24% глицерина и 4% 2-меркаптоэтанола), оставлены при комнатной температуре на один час и разделены при помощи 12.5% ДСН-ПААГ (полиакриламидный гель). Эквивалент белка, равный 2,5 мкг хлорофилла, помещался в лунку геля. Белки переносились на поливинилиден диф-луоридную мембрану (Hybond-P, Amersham) и затем проводилась иммунная детекция с использованием усиленной хемолюминесцентной реакции (Pierce). Был проведен блоттинг с первичными антителами против белка D1 (Agrisera, Sweden). Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, закупались у компаний Promega и Sigma.

Анализ фотосинтетической деятельности в целых клетках. Затухание флуоресценции Хл, следующее за насыщающей вспышкой света и серией коротких, дозированных вспышек (продолжительность импульса 4мкс), было измерено в пределах 0-50±0.1 °С при помощи стандартной версии флуореметра двойной модуляции Fl-100, оборудованного терморегулятором TR 2000 (P.S. Instruments, Brno, Czehia). Стандартная флуоресценция была измерена в разное время после каждого импульса и подогнана к трех-экспоненциальной функции F=aiexp(-kix)+a2exp(-k2x)+a3exp(-k3x) при помощи подходящего нелинейного алгоритма наименьших квадратов. Самая быстрая константа скорости ПЭ была отнесена к реакции передачи электронов от QA к QB.

Результаты и их обсуждение

Недавние исследования обнаружили присутствие АК Гли в сайтах контакта ТМ спиралей [10] и положили начало поискам их структурной и функциональной роли. Способствуют ли эти одиночные АК функционированию или укладке целого белка? В этом исследовании мы обратились к данному вопросу, проведя анализ мутации в ключевом сайте D1-G208. Функция РЦ ФС11 была проанализирована в полученных фотоавтотрофных мутантах путем отслеживания кинетики и термодинамики прямого ПЭ от Qa~ к QB измерения фотосинтетической активности белкового комплекса.

Взаимодействие между гибкостью и стабильностью мембранных белков является ключевым аспектом в поддержании их биологической активности, особенно при различных физиологических температурах [21]. Гибкость необходима для того, чтобы запустить функции, которые вовлекают обратимые изменения в третичных или четвертичных белковых структурах. Полученные структуры могут быть стабильными и в равновесии как при чередовании между активными и неактивными формами белка в ионных каналах [22] или нестабильными и временными как при активации/возбуждении фермента из основного состояния в переходное состояние [23]. В первом случае гибкость белка отражается в энтропии и энтальпии активации каталитического процесса, а во втором - она соотносится с термодинамической стабильностью двух альтернативных структур.

Структура и эволюционная консервативность ФС II. Сравнительный анализ последовательностей показал, чтоG208 сохранен в центре ТМ спирали D во всех изученных фотосинтетических организмах (рис. 1), за исключением Vigna ungiculata, где он был замещен остатком Сер. Важно то, что замещение Гли на Сер, который имеет более низкое значение упаковки атомов, вероятно, повысит То, температуру, близкую к оптимальной, при которой скорость от QA к QB выходит на плато [7]. Действительно, Vigna ungiculata - это теплолюбивая культура, переносящая жару и сухость, но не терпящая холод.

Organism D helix sequence

PSB1 SYNEL PFHQLGVAGVFGGALFCAMHGSLVTS

PSB1 SYNVU PFHQLGVAGVFGGALFCAMHGSLVTS

PSB2 SYNEL P FHML GVAGVF GGAL FAAMHGS LVT S

PSB2 SYNY3 PFHMLGVAGVFGGSLFSAMHGSLVTS

PSBA CYAPA P FHMMGVAGVFGGS LFSAMHGS LVT S

PSBA CHLRE PFHMLGVAGVFGGSLFSAMHGSLVTS

PSBA SPIOL PFHMLGVAGVFGGSLFSAMHGSLVTS

PSBA VIGUN P FHML GVAGVF GS SL FSAMHGS LVT S

Рис. 1. Аминокислотная последовательность D спирали в D1 белке РЦ ФСП. Последовательности белка РЦ ФС11 обозначаются согласно коду SwissProt Остаток D1-G208 выделен серым цветом в середине спирали D

Остаток D1 - G208, который находится на стороне донора мотива ГлихххГли, расположен прямо в точке контакта спиралей D, пересекающихся под углом 57° в комплексе РЦ ФС11 (рис. 2) на расстоянии 6.2 А от D2-G207 (Са к Са) в середине мембраны. Аминокислота Гли в сайте D1-208 вовлечена в образование Ван-дер-ваальсовых белок-белковых связей между субъединицами D1/D2. Более того, G208 располагается в центре пути ПЭ и может участвовать в регуляции локальной динамики белков и, таким образом, менять скорость ПЭ на участках донора и акцептора.

D1D спираль D2 D спираль

Рис. 2. Структура белка РЦ ФСИ Thermosynechococcus elongatus. Спирали D обозначены стрелками, соответственно. Кофакторы изображены как: Р680 (специальная пара Хл.), дополнительный Хл, фео-фитины, пластохиноны и негемовое железо. Изучаемый остаток G208 (атомы G208 и G207 показаны как сферы), расположенный на спирали D1-D, формирует Ван-дер-ваальсовые взаимодействия с

G207 спирали D2-D

Приготовление и физиологическая характеристика жизнеспособных мутантов. Комбинаторный мутагенез при использовании праймера, который содержит вырожденную последовательность кодона, был применён к сайту G208 белка D1 (табл.). В результате были получены только три жизнеспособных мутанта (А208, S208 и Т208).

Олигонуклеотиды, использованные в комбинаторном и направленном мутагенезе

Олигонуклеотид3 Нуклеотидная последовательности Позиция в генее

Р208ь GCTGGTGTATTCGGTNNNAGCTTGTTCTCCGCCATGCATGGTTCC 606-651

Х208с GCTGGTGTATTCGGTXXXAGCTTGTTCTCCGCCATGCATGGTTCC 606-651

А208 ACCGAATACACCAGCCACACCTAACATG 620-592

Р3 GGATTAATTCTCTAGACTCTCTAATGG 1233-1179

Р5 CCAAAACGCCCTCTGTTTACC (-187)-(-166)

Р260 GCCGTGGGCGGCAACGATGTTGTAGG 759-734

Р4 CTTCCACATGTTAGGTGT 588-605

Примечание. а Олигонуклеотиды Р260 и Р4 использовались для секвенирования ПЦР продукта. ь Сайт рестрикции №П введён как молчащая мутация и его модификация выделена курсивом. сПозиции нуклеоти-дов в гене psbAII нумеруются как описано [24]. Универсальный код для вырожденного олигонуклеотида N (А, g, С, Т). е Последовательность ххх представляет определенные кодоны для других 16 АК кроме Гли, Ала, Сер и Тре.

Все три мутанта содержат малые АК остатки в участке G208 белка D1 и сохраняют фотосинтетическую активность, хотя и в разной степени. Другие 16 АК, введённые в позицию D1-208, не смогли обеспечить жизнеспособность клеток, вероятно, из-за нарушения ими нативной конформации РЦ ФСИ (в процессе фолдинга) или фотосинтетической деятельности, необходимой для поддержания фотоавтотрофного роста.

Скорости фотоавтотрофного роста мутантов А208, S208 и T208 и дикого типа в208 ^^ были изучены качественно на агаровых пластинах и количественно спектрофотометрически. Рост мутанта Тре оказался на 40% медленнее чем рост дикого типа, в то время как Ала и Сер показали скорости роста на 25% меньше по сравнению с диким типом (рис. 3).

2.5-

А208 Т208

А.

Б.

л н о о а н о ч с

я

л ^

о ш т

Я Н С

О

гт 2-

1.5-

1 -

0.5

-G208 ^Т)

-А208

^208

-1208

Время, дни

Рис. 3. Скорости роста дикого типа и мутантных клеток: А - рост клеток на пластине твердой среды Бв-11; Б - кривые роста всех четырёх линий, выращенных в жидкой среде Бв-11. Стандартное отклонение указано как результат трёх независимых экспериментов

0

0

2

3

4

5

6

7

Количество мутантного полипептида D1 в ФС11 при обычных условиях роста было проанализировано в тилакоидных мембранах четырех линий цианобактерий, выращенных при слабом (10 цмоль м-2с-1) и стандартном (50 цмоль м-2с-1) освещении с помощью иммуноблоттинга (рис. 4). Все три мутанта, выращенные при стандартном освещении, показали сильное уменьшение (70%) количества полипептида D1. Тогда как клетки, выращенные при слабом освещении, мутанта А208 продемонстрировали уменьшение на 50%, а S208 и T208 показали уменьшение на 60% и 70% в уровне D1 соответственно по сравнению с диким типом. В дополнение на блотах, иммунизированных антителами к белку D1, была обнаружена дополнительная полоса весом ~55-60кДа, вероятнее всего соответствующая перекрестному сшиванию продуктов белка D1 (32кДа) с белком D2 (34кДа). Количество агрегатов (аддукта) D1/D2 увеличилось во всех мутантах D1-208 по сравнению с диким типом. Повышенное количество аддукта может свидетельствовать об увеличении оксидативного статуса клетки, то есть повышенного содержания активных форм кислорода. Это явление в свою очередь указывает на то, что мутантные клетки находятся в состоянии сильного стресса, а значит, произошёл сбой в функционировании основных фотосинтезирующих белков.

WT А208 Э208 Т208 WT А208 Э208 Т208

51.7 — 35.9 —

- ж*

29.5 —

10 цмоль м-2с-1

50 цмоль м-2с-1

Рис. 4. Иммуноблот, демонстрирующий содержание полипептида D1 в мутантах А208, S208, T208 и диком типе WT при слабом и стандартном освещении. Полоса над белком D1 (32Шн), вероятно, является перекрестно-сшитым продуктом гетеродимера (~66Шн) D1/D2. Эта полоса заметна во всех мутантах, но слабо видна в диком типе, особенно при степени освещения в 50цмоль м-2с-1

Прямой перенос электронов QA к QB в мутантах. Эффект мутагенеза на участке D1-G208 на деятельность РЦ ФС11 был изучен при помощи измерения скорости прямого ПЭ (от QЛ к QB) при температуре от 0 до 50оС с использованием флуоресценции Хл из целых клеток.

Образцы клеток, адаптированные к темноте, были активированы одиночной сильной вспышкой, что привело к образованию состояний S2QA или S2,зQB. Позже, серия слабых вспышек была применена к образцу, флуоресценция Хл была измерена и кривая затухания была разложена на три компоненты, как описывалось ранее [7]. Флуоресцентный сигнал с самой короткой продолжительностью жизни контролировал скорость ПЭ от QA к QB. Константы скорости (к) ПЭ от QA к QB были вычислены при температуре 0-50оС с помощью теории переходного состояния (рис. 5) [23].

А.

2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5

0,0031 0,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,0036 0,0037 1/Т

__ ♦ ♦ ф гр О Т о=25 С ♦ 1Л/Т

♦ ОА208

Т О \ То=27С дэгов

♦ ♦ ♦ ♦<. ♦ Т208

♦ ^^ о^

Т о Т о=37 гр о То=35 С ♦ч А с Чо Ча

5,15

5,1

„ 5,05

4,95

4,9

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4,85

4,8

Т208

5208 ♦ / У*

у/ , А208

♦ Ш

50

60

70

80

90

100 110

120

Б.

Объём атомов остатка, А3

Рис. 5. А. Графики Эйринга для ПЭ от QA' к QB для WT и мутантов. Б. Взаимосвязь между энергией активации и размером остатка боковых цепей оценена из графиков Эйринга

На графиках Эйринга WT продемонстрировал отмеченную нами ранее [7] двухфазную температурную зависимость мезофиллов с То=25оС, чьё значение несколько ниже физиологической температуры (30 оС) Synechocystis 6803. При более высоких значениях температуры константа скорости ПЭ оказалась от неё независимой (рис. 6А), и снизилась при более высоких температурах, вероятно из-за денатурации РЦ ФСП. Мы нашли, что То=27, 35 и 37 °С для мутантов А208, S208 и Т208 соответственно. Таким образом, Ала едва перемещает То, в то время как Сер и Тре, оба способные к образованию Н-связи через гидроксильную группу ОН, переместили То на 7,5 и 12,5 °С соответственно. Вероятно, сдвиг То мутантов относительно дикого типа соотносится со способностью мутантных АК входить в межбелковые водородные связи в составе D спирали (рис. 1), а не с размером остатков или значений плотной упаковки атомов, как обнаружено на участке D1-212 [7].

Термодинамические параметры (ЛН*, ЛЗ* и ЛЕ*) для части графика Эйринга 1п(к/Т) <х1/Т зависимой от температуры были подсчитаны для мутантов и дикого типа D1-208 (данные не указываются). Хотя абсолютная величина обеих ЛН* и ЛЗ* слегка изменилась между различными мутантами, только ЛЕ* последовательно увеличивалась вместе с размером остатка (рис. 6Б).

Значения энергии активации ЛЕ* для З208 и Т208 мутантов соответствуют энергии Н-связи, равной 5,05 и 5,1 ккал мол-1 К соответственно. Таким образом, мы можем сказать, что мутации сайта D1-208 привносят в четвертичную структуру РЦ более сильные связи, чем Гли, которые не поддерживают функционально гибкую структуру белкового комплекса ФСП.

Выводы

Наши результаты подтвердили гипотезу, что слабые белок-белковые взаимодействия, образуемые Гли в сайте D1-208 важны для функциональных изменений конформаций, которые управляют скоростью ПЭ от QA к QB. Мы можем сделать следующие выводы:

1. Только три малых аминокислоты (схожие по размеру с Гли) Ала, Сер и Тре в сайте D1-208 поддержали фотоавтотрофный рост.

2. Измерение функциональной активности показало нарушение фотосинтетических процессов у всех мутантов. Скорости роста уменьшились на 25% и 70% у А208, З208 и Т208. Содержание

ключевого белка РЦ ФС11 D1 уменьшилось при слабом освещении на 50%, у А208 и на 60% и 70% у S208 и T208 соответственно, по сравнению с диким типом.

3. Скорость реакции ПЭ от QA к QB в зависимости от температуры уменьшилась во всех трёх мутантах по сравнению с диким типом. Зависимость константы скорости реакции ПЭ от температуры имеет двухфазное поведение (графики Эйринга), что соответствует изменению конформации для дикого типа и мутантов.

4. Значение оптимальной температуры на графике Эйринга То перемещалось к более высокой температуре по сравнению с диким типом во всех трех мутантах, но в различной степени: 2,5 °C для Ала, 7,5 °C для Сер и 12,5 °C для Тре.

5. Значение энергии активации возросло с 4,85 ккал мол-1 К для Гли до 5,0 и 5,1 ккал мол-1 К для Сер и Тре соответственно. Эти две полярные АК способны к образованию межбелковой водородной связи, которая может внести дополнительную стабильность в РЦ ФСП, но нарушить локальную гибкость, а значит повредить функцию белка, что было доказано измерением фотосинтетической активности в целых клетках. Причём функции белка и клеток уменьшались, а энергия активации реакции ПЭ увеличивалась прямопропорционально размеру боковой цепи мутантной АК. Можно предположить, что Гли в сайте D1-208 играет ключевую роль в образовании белок-белковых связей в комплексе РЦ ФСП. В свою очередь эти связи контролируют переход конформаций функционально активной структуры и приспособлении константы скорости ПЭ к физиологической температуре. Эти наблюдения подчеркивают значимую роль Гли в пространственной структуре мембранных белков и его важности в определении биологической функции белков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ferreira K.N., Iverson T.M., Maghlaoui K., Barber J., Iwata S. Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center // Science. 2004. Vol. 303. P. 1831-1838.

2. Loll B., Kern J., Saenger W., Zouni A., Biesiadka J. Towards complete cofactor arrangement in the 3.0 A resolution structure of photosystem II // Nature. 2005.Vol. 438. P. 1040-1044.

3. Deisenhofer J., Michel H. The photosynthetic reaction center from the purple bacterium Rhodopseudomonas viridis // Science. 1989. Vol. 245. P. 1463-1473.

4. Ermler U., Fritzsch G., Buchanan S., Michel H. Structure of photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A resolution: cofactors and protein-cofactor interactions // Structure. 1994. Vol. 2. P. 925-936.

5. Grotjohann I., Jolley C., Fromme P. Evolution of photosynthesis and oxygen evolution: Implications from the structural comparison of Photosystems I and II // Physical Chemistry Chemical Physics. 2004. Vol. 6. P. 4743-4753.

6. Wraight C.A. Proton and electron transfer in the acceptor quinone complex of photosynthetic reaction centers from rhodobacter sphaeroides // Front Biosci. 2004. Vol. 9. P. 309-337.

7. Shlyk-Kerner, O. et al. Modulation of Protein Flexibility Acclimatizes Photosynthetic Energy Conversion to the Ambient Temperature // Nature. 2006. Vol. 442. P. 827-830.

8. Senes A., Engel D.E., DeGrado W.F. Folding of helical membrane proteins: the role of polar, GxxxG-like and proline motifs // Curr Opin Struct Biol. 2004. Vol. 14. P. 465-479.

9. Landolt-Marticorena C., Williams K.A., Deber C.M., Reithmeier R.A. Non-random distribution of amino acids in the transmembrane segments of human type I single span membrane proteins // J. Mol Biol. 1993. Vol. 229. P. 602-608.

10. Javadpour M.M., Eilers M., Groesbeek M., Smith S.O. Helix packing in polytopic membrane proteins: role of glycine in transmembrane helix association // Biophys J. 1999. Vol. 77. P. 1609-1618.

11. Lemmon M., Engelman D. Specificity and promiscuity in membrane helix interactions // Quarterly Reviews in Biophysics. 1994. Vol. 27. P. 157-218.

12. Senes A., Gerstein M., Engelman D.M. Statistical analysis of amino acid patterns in transmembrane helices: the GxxxG motif occurs frequently and in association with beta-branched residues at neighboring positions // J. Mol Biol. 2000. Vol. 296. P. 921-936.

13. Russ W.P., Engelman D.M. The GxxxG motif: a framework for transmembrane helix-helix association // J. Mol Biol. 2000. Vol. 296. P. 911-919.

14. Eilers M., Patel A.B., Liu W., Smith S.O. Comparison of helix interactions in membrane and soluble alpha-bundle proteins // Biophys J. 2002. Vol. 82. P. 2720-2736.

15. Curran A.R., Engelman D.M. Sequence motifs, polar interactions and conformational changes in helical membrane proteins // Curr Opin Struct Biol. 2003. Vol.1. P. 412-417.

16. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4673-4680.

17. Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf xtracts in dif-ferent solvents// Biochem Soc Trans. 1983. Vol. 603. P. 591-592.

18. Kless H., Vermaas W. Combinatorial mutagenesis and structural simulations in the environment of the redox-active tyrosine YZ of photosystem II // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 16458-16464.

19. Fleming P.J., Richards F.M. Protein packing: dependence on protein size, secondary structure and amino acid composition // J Mol Biol. 2000. Vol. 299. P. 487-498.

20. Callahan F.E. et al. A novel metabolic form of the 32 kDa-D1 protein in the grana-localized reaction center of photosystem II // J. Biol Chem. 1990. Vol. 265. P. 15357-15360.

21. Collins T., Meuwis M.A., Gerday C., Feller G. Activity, stability and flexibility in glycosidases adapted to extreme thermal environments // J Mol Biol. 2003. Vol. 328. P. 419-428.

22. Spencer R.H., Rees D.C. The alpha-helix and the organization and gating of channel // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2002. Vol. 31. P. 207-233.

23. Fersht A. Structure and Mechanism in Protein Science. W.H. Freeman and Company. N. Y., 1999. 326 с.

24. Ravnikar P.D., Debus R., Sevrinck J., Saetaert P., McIntosh L. Nucleotide sequence of a second psbA gene from the unicellular cyanobacterium Synechocystis 6803 // Nucleic Acids Res. 1989. Vol. 17. P. 3991.

Поступила в редакцию 20.12.12

O. V. Shlyk-Kerner, D. Kaftan, A. Scherz

Glycine at the reaction center of photosystem II plays key role in regulation of electron transfer rates

Amino acid (AA) glycine (Gly) of D1 protein may participate in protein-protein interactions. They are important for conformational change that may regulate the electron transfer (ET) rates in the photosystem II (PSII) reaction center protein (RC). Gly was replaced by 20 AA by mutagenesis in cyanobacteria Synechocystis PCC 6803. Only three mutants supported the photoautotrophic growth of an organism. It was shown that function of protein and ET rates in mutants decreased in direct ratio to the AA size. On the contrary, energy of activation of ET at mutants increased. Results indicate at central role of Gly in inter-protein interactions forming and ET rates regulation in PSII RC.

Keywords: reaction center, transmembrane proteins, Van-der-waals forces, combinatorial mutagenesis, hydrogen bond.

Шлык-Кернер Оксана Владимировна, кандидат биологических наук, доцент

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1) E-mail: [email protected]

Кафтан Давид, Ph.D, доцент E-mail: [email protected] Шерц Авигдор, Ph.D, профессор E-mail: [email protected]

Научный институт им. Вайцмана 76100, Израиль, г. Реховот, ул. Герцель

Shlyk-Kerner O.V.,

candidate of biology, associate professor Udmurt State University

462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]

Kaftan D., Ph.D, associate professor E-mail: [email protected]

Scherz A., Ph.D, full professor E-mail: [email protected]

Weizmann Institute of Science 76100, Israel, Rehovot, Herzl St.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.