CC BY
205
УДК 577/23^581/132 (045)
О.В. Шлык-Кернер, С.В. Овечкин, А.С. Гасников
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ К ПОВЫШЕННЫМ ТЕМПЕРАТУРАМ: ПЛАТФОРМА ДЛЯ СОЗДАНИЯ СТРЕССОУСТОЙЧИВЫХ ПРОДУЦЕНТОВ БИОВОДОРОДА1
Существует проблема промышленного производства биоводорода, являющегося экологически чистой альтернативой ископаемому топливу. Производство водорода в таких масштабах требует получения цианобактерий, которые устойчивы к загрязнению другими видами микроорганизмов и производящими большие количества биомассы и водорода в современных условиях глобального потепления. Ранее нами был получен штамм цианобактерий, содержащий термостабильную фотосистему 2. В статье приведены результаты изучения адаптации этого штамма к повышенным температурам и циклическим изменениям температуры и света на уровне целых клеток и различных белков, а также предложена тест-система для качественной оценки производства водорода при повышенных температурах. Получено первое подтверждение производства водорода при повышенной температуре у мутанта АС. Впервые были получены предварительные результаты культивирования штамма Synechocystis 6803 АС в условно открытых системах.
Ключевые слова: биоводород, цианобактерии, фотосинтез, мутагенез, адаптация к стрессу.
Резкое уменьшение запасов традиционных энергоносителей и отрицательные побочные эффекты потребления этого сырья - составная часть проблемы истощения природных ресурсов и деградации природной среды [1]. Например, сжигание ископаемого топлива ведет в масштабах Земли к значительному увеличению содержания диоксида углерода (СО2) в атмосфере. По данным Международной группы экспертов по вопросам глобального потепления (International Panel on Climate Change), содержание СО2 увеличивается ежегодно на 80 % с 1970 по 2004 г. [2]. С увеличением концентрации СО2 в атмосфере происходит сдвиг динамического равновесия в сторону глобального потепления на Земле. В связи с этим в настоящее время учеными многих стран ведется активный поиск альтернативных источников энергии, которые могут решить проблему. Многие из них высказываются в пользу водорода. Преимуществом водорода перед прочими энергоносителями являются неограниченные возможности его получения, неисчерпаемость запасов и экологическая безопасность при его использовании. Использование водорода как топлива сопровождается выделением воды и при этом не происходит вредных выбросов в атмосферу и ее нагревания. Существующие в настоящее время промышленные способы получения водорода, такие как фотоэлектролиз и электролиз воды, неэкономичны и невозобновляемы [3]. Поэтому нужно найти эффективный и не загрязняющий окружающую среду метод продукции водорода.
Практически чистым возобновляемым источником водорода являются его биологические генераторы, такие как микроводоросли и цианобактерии (сине-зеленые водоросли), способные к фотосинтетической конверсии солнечного света в молекулярный водород. Светозависимое образование биоводорода этими двумя группами фотосинтетических организмов достаточно хорошо изучено и привлекает к себе внимание в связи с неисчерпаемостью и возобновляемостью как солнечной энергии, так и субстрата - воды, а также нетоксичностью побочного продукта - кислорода [4]. Фотосинтез - это комплекс биохимических реакций превращения физической энергии света в энергию химических связей углеводородов. Фотосинтез происходит в тилакоидных мембранах фотосинтезирую-щих организмов, которые содержат реакционные центры, известные как фотосистемы. Эти сложные белковые комплексы используют фотоны света для создания электрон-восстанавливающего потенциала [3]. В процессе фотосинтеза электроны из воды переносятся по цепи белково-пигментных комплексов на ферменты цикла Кальвина, утилизируя углекислый газ, из которого синтезируются сахара [5]. При обычных условиях освещения, температуры и питания микроскопические водоросли не образуют больших количеств водорода. Они способны к разложению воды и выделению кислорода при участии двух трансмембранных фотосистем: фотосистемы 1 (ФС1) и фотосистемы 2 (ФС2), трансформирующих энергию света в химическую энергию АТФ и НАДФН. Восстановление НАДФ происходит при переносе электронов от восстановленного за счет фотосинтеза ферредоксина (Фд) к НАДФ
1 Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №13-04-00198А.
при участии Фд НАДФ-оксидоредуктазы. Активность ФС2 не является необходимым условием фотовыделения водорода, хотя электроны, поступающие в электрон-транспортную цепь тилакоидов при фоторазложении воды, могут акцептироваться гидрогеназой или нитрогеназой.
При определенных (стрессовых) условиях Фд может направлять электроны к ферментам гидро-геназе или нитрогеназе [3], которые способны восстанавливать протоны для получения молекулярного водорода. Это приводит к тому, что в течение непродолжительного времени в клетках микроводорослей накапливается водород. Известно также, что в анаэробных условиях и в темноте цианобакте-рии и зеленые микроводоросли выделяют водород при ферментативном брожении [4]. Причем растения не способны к производству биоводорода, так как у них отсутствуют ферменты гидрогеназа и/или нитрогеназа, найденные в зеленых водорослях и цианобактериях.
Таким образом, в природе определенные виды цианобактерий и микроводорослей используют фотосинтетический аппарат для производства очень незначительных количеств водорода. Поэтому одним из актуальных направлений водородной энергетики является поиск объектов, продуцирующих водород в больших концентрациях в открытых водоемах и закрытых биореакторах [6], и разработка режимов, стимулирующих выход водорода. Среди таких многообещающих «зеленых» объектов находятся наиболее перспективные: автотрофные зеленые (Chlorophyta, например Chlamydomonas) микроводоросли [7] и синезеленые (Cyanophyta, например АпаЬаепа varaiabilis и Synechocystis РСС 6803) циано-бактерии [8]. Эти организмы производят водород из воды, используя солнечный свет в качестве источника энергии. Способность к выделению водорода зелеными водорослями была обнаружена Гаффро-ном и Рубиным около 65 лет назад [9]. В течение долгого времени способность к выделению водорода микроводорослями рассматривалась как курьезный факт, не имеющий особой практической значимости: большинство водорослей выделяли водород в меньшем количестве, чем другие микроорганизмы. Однако в последнее время интерес к производству биоводорода с помощью фотосинтезирующих организмов повысился благодаря заметному прогрессу в данной области исследований. Ведутся работы по получению мутантов зеленых водорослей с нечувствительной или малочувствительной к кислороду гидрогеназой. Более того, мутагенез проводится для того, чтобы направить поток электронов по пути светозависимого производства водорода, а не для синтеза углеводов [7].
Основная технологическая трудность производства биоводорода заключается в том, что у водорослей и цианобактерий реакцию выделения водорода катализируют ферменты гидрогеназа или нитрогеназа, но оба этих фермента чувствительны к кислороду. В особенности кислород подавляет активность основного водород-производящего фермента гидрогеназы, а также выключает гены, ответственные за экспрессию этого фермента. Таким образом, изолированная из клеток гидрогеназа не работает на воздухе, а в клетках одноклеточных микроводорослей и цианобактерий работает кратковременно [10]. Поэтому для получения биоводорода из культуры клеток, например Synechocystis РСС 6803 или Chlamydomonas, необходимо поместить их клетки в атмосферу инертного газа: аргона или азота (т.е. создать анаэробные условия). Более того, необходимо постоянно удалять кислород, который синтезируется клетками в процессе фотосинтеза [4]. Поэтому работы в лабораториях мира направлены на преодоление проблемы чувствительности нитрогеназы и гидрогеназы к кислороду. Большой прогресс по преодолению этой проблемы, в частности, сделан для микроводорослей СЫа-mydomonas, и этот объект считается некоторыми учеными самым перспективным для дальнейших исследований в данной области [11].
Что касается цианобактерий, то по новым данным около 14 видов цианобактерий способны к производству биоводорода в небольших количествах [12]. Среди этих видов особенно большое внимание уделяется филаментным цианобактериям, которые используют фермент нитрогеназу для производства водорода в условиях недостатка азота. При этом водород производится как побочный продукт фиксации азота и превращения его в мочевину, кроме того, нитрогеназа использует АТФ как субстрат для этой реакции [13]. У цианобактерий, которые используют этот фермент, нитрогеназа находится в специализированных клетках - гетероцистах. Нитрогеназа в гетероцистах защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Гетероцисты имеют очень толстую оболочку, слабо пропускающую кислород, к тому же гетероцисты обладают активным дыханием (поглощением) и в отличие от остальных клеток (вегетативных) не выделяют кислород. Описанные черты делают гетероцистные цианобактерии единственными организмами, способными выделять водород в присутствии молекулярного кислорода в воздушной атмосфере [14]. Однако использование для промышленного производства водорода филаментных цианобактерий энергетически неэффективно, так как количество ге-тероцист в филаментах ограничено и они используют АТФ для работы нитрогеназы, поэтому предпочтительнее использовать виды цианобактерий, содержащих гидрогеназу.
Однако другая технологическая трудность производства биоводорода заключается в том, что фотосинтезирующие организмы чувствительны к изменению температуры, которая вследствие этого должна поддерживаться на определенном уровне (резкие суточные колебания недопустимы), а также подвержены заражению чужеродными микроорганизмами. В настоящее время интерес к решению этой проблемы вновь появился в связи с развитием методов генной инженерии, то есть возможностью управлять метаболизмом организмов.
Современные технологии еще не так успешны в преодолении всех проблем. Однако уже есть возможность увеличивать эффективность биологического производства водорода при определенных стрессовых условиях, таких как:
1) изменение содержания состава питательной среды (удаление серы) в культурах микроводорослей Chlamydomonas reinhartdii или Gloeocapsa alpicola [15];
2) повышение температуры в культурах Anabaena variabilis [16];
3) смена светового и темнового режимов освещения в клетках Spirulina platensis и Anabaena cylindrica [17].
В этой работе мы исследовали одноклеточный организм Synechocystis PCC 6803, который содержит двунаправленную (поглощающую) гидрогеназу на предмет адаптации к стрессовым температурам [14]. Кроме того, этот модельный организм используется для улучшения свойств многих собственных ферментных систем с помощью методов генной инженерии. Мы использовали линию цианобактерий Synechocystis PCC 6803 дикого типа (WT или AKS) и мутантную линию (AC), несущую генетическую модификацию в участке белка D1 фотосистемы 2, где аминокислота серин в участках 209\212 замещена на аланин и цистеин [18]. Мы предположили, что эта генетическая модификация обеспечивает термостабильность мутанту, таким образом, что организм остается функциональным, и производит большее количество биомассы при повышенной температуре и циклах температуры и света, чем дикий тип. Последняя особенность этого мутантного штамма является самой важной, так как скорость производства водорода зависит от концентрации активной биомассы в лабораторной колбе или промышленном биореакторе. Более того, мы предлагаем использовать повышенную температуру как фактор, увеличивающий продукцию водорода. Наконец, мутант АС, обладающий широким диапазоном температур активности, может быть устойчивым к заражению другими видами микроорганизмов, при использовании открытых систем (пруды или открытые биореакторы) для производства водорода, в условиях глобального потепления климата.
В качестве контроля для измерения количества биомассы при стрессовых температурах мы использовали филаментную линию цианобактерий Anabaena PCC 7120, которая содержит гетероцисты и может выделять водород с высокой скоростью, являясь нечувствительной к кислороду.
Материалы и методика исследования
Условия культивирования и рост. Линии культур дикого типа AKS, мутанта АС Synechocystis РСС 6803 и Anabaena хранились на агаризованной среде BG 11, как описано ранее [19]. Жидкие культуры этих линий были выращены в колбах объемом 250 мл, содержащих питательную среду в условиях стандартной 50 цто1 (фотоны)^т-2^-1 интенсивности света при стандартной (30 °С) или повышенной (40 °С) температуре и постоянном перемешивании в инкубаторе ES-20 Biosan.
Получение кривых роста при воздействии цикла температур (высокая - низкая - высокая) и цикла «12 часов свет - 12 часов темнота». Цианобактерии линии дикого и мутантного типа Synechocystis PCC 6803, а также клетки линии Anabaena PCC 7120 выращивались в условиях:
1) меняющихся температур с 42 °С до 30 °С каждые двое суток при постоянном перемешивании в инкубаторе ES-20 Biosan и низкой 5 цто1 (фотоны)^т-2^-1 интенсивности света;
2) циклов 12 часов свет - 12 часов темнота при постоянном перемешивании в инкубаторе и стандартной 50 цто1 (фотоны)-т-2^-1 интенсивности света и повышенной температуре (42 °С).
Для построения кривых роста цианобактерии трех штаммов забирались аликвотами объемом 3 мл каждый день в одно и то же время и помещались в кюветы для спектрометрического измерения оптической плотности клеток при длине волны 750 нм.
Определение жизнеспособности клеток. Клетки трех линий цианобактерий, выращенные при нормальных условиях температуры (30 °С), освещения и перемешивании, отбирались аликвотами объемом 100 мкл, помещали на предметное стекло и изучали в люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse E 200 при увеличении х40. Подобным образом изучались и клетки, выращенные при повышенной температуре (40 °С) в течение 5 дней и 8 дней.
ДСН-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле) и иммуноблоттинг. Тилакоиды были получены, как описано ранее [20]. Тилакоидные белки были растворены в буферном растворе (0,5 М Трис-HCl pH 6,8; 1 % додецилсульфата натрия (ДСН); 24 % глицерина и 4 % 2-меркаптоэтанола), оставлены при комнатной температуре на один час и разделены при помощи 4-15 % градиентного ПА-АГ (готовые гели, Bio-Rad). Эквивалент белка, равный 1 мкг хлорофилла, помещался в лунку геля. Белки переносились на поливинилиден дифлуоридную мембрану (Hybond-P, Amersham) и затем проводилась иммунная детекция с использованием усиленной хемолюминесцентной реакции (Pierce). Был проведен блоттинг с первичными кроличьими антителами против белков D1, Hsp16.6, ClpB1 и KatG1 (Agrisera, Sweden). Вторичные антикроличьи тела, конъюгированные с пероксидазой хрена, закупались у компаний Promega и Sigma.
Сборка и использование тест-системы для аналитического выявления водорода. Система для аналитического исследования производства водорода собиралась из стеклянной бутыли с резиновой пробкой, стеклянного капилляра и сосуда с резиновой крышкой меньшего объема. Для определения производимого клетками цианобактерий водорода использовался водный раствор катализатора Wilkinson's [21; 22] (то есть Трис(трифенилфосфин) родиум хлорид) и цветной индикатор метилено-вый синий в соотношении (1:1). Вся собранная система помещалась в термостатируемый инкубатор с качалкой и источниками света, где происходил процесс культивирования клеток при температуре 40 °С. Освещение инкубатора регулировалось с помощью таймера, который включал циклы 15 мин свет и 3 ч темнота.
Сравнительный анализ последовательностей. Структурные модели реакционного центра (РЦ) ФС2, полученные из Thermosynechococcus elongatus [24], были проанализированы с помощью программы визуализации белковых структур Swiss-pdb-viewer [25] для обнаружения белок-белковых взаимодействий в трансмембранной области. Было выполнено множественное выравнивание полной аминокислотной последовательности белков D1 и D2 РЦ ФС2. Причем было обращено особое внимание на анализ D1 и D2 белков тех организмов, которые обитают в условиях экстремальных температур и сильного света.
Культивирование цианобактерий в условно открытой системе. Клетки цианобактерий Synechocystis 6803 мутантного типа АС инокулировали нестерильно в питательную среду BG-11 в емкости открытого и закрытого типа и культивировали на экспериментальной площадке ботанического сада УдГУ. Затем аликвоты объемом 3 мл забирались из обеих емкостей, и измерялась оптическая плотность клеток при длине волны 750 нм.
Результаты и их обсуждение
1.1. Кривые роста при нормальной и высокой температурах. Мы провели измерения скоростей роста для линий дикого типа AKS и мутанта АС одноклеточного организма Synechocystis PCC 6803 и филаментного Anabaena 7120. В результате эксперимента мы убедились, что нет значительной разницы в скоростях роста между тремя линиями цианобактерий при температуре, равной 30 °C, и нормальном освещении (50 мМ m-2s-1 света) (рис. 1, А). В то время как при повышенной температуре (40 °С) мутант АС показал самые высокие скорости роста в течение 7 дней (рис. 1, Б) по сравнению с диким типом AKS и Anabaena 7120. Мы можем сказать, основываясь на этих данных, что мутантная линия АС производит при повышенной температуре 40 °C на 20 % и на 80 % больше биомассы, чем линия AKS и Anabaena соответственно.
1.2. Кривые роста при температурном цикле 42 - 30 - 42 °С и цикле «12 часов свет - 12 часов темнота». Как видно на графике кривых роста бактерий (рис. 2, А), при температурных циклах начиная с 42 °С и низкой интенсивности света мутантная линия АС показала повышенные скорости роста по сравнению с линиями AKS и Anabaena. Мы можем сказать, основываясь на этих данных, что линия АС быстрее адаптируется к скачкообразным изменениям температуры и низкому свету и производит больше биомассы на 14 % и на 90 %, чем линии AKS и Anabaena соответственно. Подобным образом проводились измерения для этих же линий мутантов при цикле «12 часов свет - 12 часов темнота» (стандартная интенсивность освещения) и постоянно повышенной температуре 42 °С. Как видно на графике кривых роста цианобактерий (рис. 2, Б), мутантная линия АС, как и во всех предыдущих измерениях, которые проводились при стрессовых условиях, показала однозначно повышенные скорости роста. Взяв во внимание полученные результаты, мы можем сказать, что линия АС может использоваться как платформа для производства биоводорода в условиях открытых систем.
(А)
(Б)
1 -♦-АС 1
0,9 - -OAKS 0,9
0,8 - Anabaena 0,8
0,7 - 0,7
о «л 0,6 - по ^¿^^ 0,6
о M 0,5 M 0,5
G с
О 0,4 - о 0,4
0,3 0,3
0,2 С 0,2
од - 0,1
о - .... 0
3 4
Время, дни
Рис. 1. Скорости роста цианобактерий при нормальной и высокой температурах. Линии одноклеточных водорослей AC и AKS (ромб и квадрат) соответственно и Anabaena (треугольник) были выращены в жидкой питательной среде в течение 7 дней при 30 °C (А) и 40 °C (Б), при постоянном перемешивании и освещении
(А)
о,5 п -♦-АС -OAKS
Q 4 J x4iiabaena
0,5 л
(Б)
-♦-АС ^AKS Anabaena
од
3 4 5
Время, дни
од
3 4 5
Время, дни
Рис. 2. Адаптация цианобактерий к циклам температуры и света. Линии одноклеточных водорослей AKS и AC (квадрат и ромб соответственно) и Anabaena (треугольник) были выращены в жидкой среде в течение 7 дней при температурном цикле 42-30-42°C и низком освещении (А); при цикле «12 часов свет - 12 часов темнота», температуре 42 °С и стандартном освещении (Б)
2. Определение жизнеспособности клеток цианобактерий в стрессовых условиях. Жизнеспособность клеток определялась с помощью изучения морфологии и агрегации клеток под люминесцентным микроскопом с использованием автофлюоресценции пигментов (рис. 3).
В результате анализа полученных снимков можно наблюдать укорачивание филаментов у клеток нитчатой водоросли Anabaena (рис. 3, Аа). Также заметно уменьшение количества клеток и увеличение самих клеток в размере у этой линии бактерий, выращенной при нормальной температуре, а затем перенесенной в условия повышенной температуры и выращиваемой при стрессе в течение 5 (рис. 3, Аб) и 8 (рис. 3, Ав) дней. Подобным образом изучались клетки двух линий Synechocystis АС и AKS. Как видно на фотографиях, полученных с помощью люминесцентного микроскопа, клетки AKS, выращенные при 30 °C (рис. 3, Ба) находятся на расстоянии друг от друга, тогда как выращенные при 40 °C в течение 5 дней (рис. 3, Бб) образуют парные агрегаты клеток. Те же самые клетки, выращенные при 40 °C течение 8 дней (рис. 3, Бв), образуют крупные агрегаты из многих клеток. Для подтверждения результатов агрегации AKS мы сделали фотографии также при обычном световом режиме (рис. 3, Гб). В отличие от предыдущих образцов клетки АС (рис. 3, Ва) не образуют агрегаты ни после выращивания в течение 5 дней (рис. 3, Вб), ни после выращивания в течение 8 дней (рис. 3, Вв; 3, Га) при 40°C.
Таким образом, клетки AKS, образуя агрегаты (способ уменьшить поверхность поглощения света клетками и взаимодействия со стрессовыми факторами), находятся в состоянии стресса и имеют сниженную жизнеспособность, тогда как клетки АС остаются в жизнеспособном состоянии без агрегации в условиях температурного стресса.
А. Anabaena PCC 7120
а) 30 °C б) 40 °C 5 дней в) 40 °C 8 дней
Б. Synechocystis PCC 6803 AKS
а) 30 °C б) 40 °C 5 дней в) 40 °C 8 дней
В. Synechocystis PCC 6803 AC
а) 30 °C б) 40 °C 5 дней в) 40 °C 8 дней
Г. Synechocystis PCC 6803 AC и Synechocystis PCC 6803 AKS
а) 40 °C 8 дней (АС) б) 40 °C 8 дней (AKS)
Рис. 3. Морфология и жизнеспособность клеток Synechocystis АС и AKS и Anabaena 7120, выращенных при 30 °C и 40 °C по данным люминесцентной (А, Б, В) и световой (Г) микроскопии
3. Синтез белка по данным электрофореза (ДСН-ПААГ) и иммуноблоттинга. Далее мы проводили эксперименты без участия филаментного организма Anabaena PCC 7120, так как этот штамм не показал увеличение скорости роста при повышенной температуре (40 °С) и циклах температур и света. Количество мутантного полипептида D1 в клетках линий AC и AKS в условиях роста при нормальной температуре (30 °С), низкой интенсивности (5мМ) света сравнивалось с таковым в условиях роста при повышенной температуре (42 °С) и такой же интенсивности света. Концентрация белка определялась в тилакоидных мембранах двух линий цианобактерий с помощью иммуноблот-тинга (рис. 4, А). Обе линии (AC и AKS), выращенные при стандартной температуре (30 °С), показали одинаковое количество полипептида D1. Тогда как выращенные при повышенной температуре в течение двух дней клетки дикого типа (AKS) показали уменьшение количества белка D1 на 50 % по сравнению с уменьшением такового на 20 % у мутантной линии AC в тех же условиях.
А. Количество белка D1 Б. Количество белка Hspl6.6
30°С 42°С 30°С 42°С
AKS АС ДК8 АС ДК8 АС ДК8 АС
1 1 0,5 0,8 0 0 1 0,6
В. Количество белка ClpBl Г. Количество белка KatGl
30°С 42°С 30°С 42°С
ДК8 АС ДК8 АС ДК8 АС ДК8 АС
1 0,2 1,2 1,4 1 0,2 0,8 0,7
Рис. 4. Иммуноблоттинг, демонстрирующий содержание: (А) полипептида D1 в мембранной фракции; белков (Б) Hsp16.6, (В) ClpBl, (Г) KatGl в цитозольной фракции мутанта АС и дикого типа
AKS, после культивирования клеток при 30 °С и 42 °С
Далее, для подтверждения факта термостабильности было измерено количество белка Hsp16.6. Белок Hsp16.6 принадлежит семье класса I малых белков теплового шока (БТШ). БТШ индуцируются в клетках, которые подвергаются воздействию повышенных температур. Белок Hsp16.6 в клетках Synechocystis PCC 6803 отвечает за развитие термотолерантности и стабильности тилакоидов. Возможно, что Hsp16.6 вовлечен в функционирование белков-шаперонов, то есть защиту других белков от необратимой денатурации. Количество белка Hsp16.6 было измерено в цитозольной фракции клеток AC и AKS (рис. 4, Б), выращенных в описанных для белка D1 условиях. Как видно на рис. 4, Б, при концентрации хлорофилла 1 мкг белок Hsp16.6 не определяется (возможно, не экспрессируется) в культуре клеток AC и AKS при 30 °С. Экспрессия этого белка индуцируется после 2 дней роста при 42 С (рис. 4, Б), причем в AC на 40 % меньше, чем в AKS.
Также было определено количество АТФ-зависимого шаперона ClpB1 и каталазы-пероксидазы KatG1 у тех же линий цианобактерий AC и AKS в тех же условиях. Белок ClpB1 необходим для устойчивости к высокотемпературному стрессу. Его функция заключается в растворении неактивных белковых агрегатов, которые накапливаются при высоких температурах. В результате роста клеток (рис. 4, В) при 30 °С линия AC содержит на 80 % меньше ClpB1, чем AKS, однако в условиях повышенной температуры количество ClpB1 повышается в обеих линиях. Пероксидаза-каталаза KatG1 -бифункциональный антиокислительный фермент, который кодируется геном katG. Он проявляет и каталазную и пероксидазную функции одновременно, которые обеспечивают защиту против окислительного стресса, нейтрализуя перекись водорода. В нашем случае белок KatG1 демонстрирует ту же динамику, что и ClpB1, т.е. при 30 °С линия AC содержит KatG1 меньше, чем AKS, однако в условиях повышенной температуры количество KatG1 повышается в обеих линиях (рис. 4, Г). В результате мы можем сказать, что мутант АС является устойчивым не только к высокотемпературному, но и к окислительному стрессу, однако нужно провести дополнительные эксперименты, подтверждающие это наблюдение.
4. Производство биоводорода. Культура клеток цианобактерий Synechocystis дикого и мутант-ного типа при оптической плотности ОП750~0,7 помещалась в стеклянную бутыль с резиновой пробкой (рис. 5.1). Перед закрытием бутылей резиновыми пробками воздух из бутылей вытеснялся аргоном. Из бутыли вырабатываемый цианобактериями водородный газ выходил через стеклянный капилляр, вставленный в резиновую пробку, в малый сосуд № 1 также с резиновой пробкой. В малом сосуде № 1 содержался водный раствор голубого цвета, состоящий из катализатора Wilkinson's и цветного индикатора метиленового синего в соотношении (0,6 мМ : 0,025 мМ). Из малого сосуда № 1 поступающий газ вытеснял раствор индикатора через второй стеклянный капилляр в малый (пустой) сосуд № 2 без пробки (рис. 5.2). Таким образом, выделяемый клетками водород должен вытеснять некоторый объем раствора индикатора из малого сосуда № 1 в малый сосуд № 2, при этом должно происходить изменение цвета индикатора с голубого на желтый под воздействием выделяемого водорода в малом сосуде № 1.
Вся система помещалась в шейкер-инкубатор, где происходил процесс культивирования клеток сначала при температуре 30 °С, а затем при 42 °С. Освещение инкубатора регулировалось с помощью таймера, который включал цикл «15 мин свет / 45 мин темнота», необходимый для производства водорода. После эксперимента с клетками, проведенного при нормальной температуре, мы не увидели изменение цвета индикатора. Затем клетки выдерживались двое суток при температуре 42 °С. Факт выделения водорода подтверждался наличием объема вытесненного раствора и изменением цвета индикатора (при выделении водорода происходит реакция восстановления индикатора метиленового синего и он становится желтоватого цвета). Как видно на рис. 5.2, в одном из двух малых сосудов с пластмассовыми крышками (в которые мы перелили раствор индикатора для лучшего представления результатов) цвет индикатора, взятого из культуры клеток AKS, подвергнутых температурному стрессу 42 °С, остался голубым без изменений (метиленовый синий остался окисленным); в то же время в другом малом сосуде раствор индикатора, взятый из культуры клеток АС, выращенных при 42 °С, имеет желтоватый оттенок (метиленовый синий стал восстановленным). То есть, возможно, происходит выделение водорода клетками АС при условиях адаптации культуры к повышенным температурам, но требуется проведение количественного анализа, подтверждающего этот результат.
5. Биоинформатический анализ белков реакционного центра (РЦ) ФС2. Мы выполнили множественное выравнивание полной аминокислотной последовательности белков D1 и D2 РЦ ФС2, чтобы на его основе обозначить перспективы и возможности направленного мутагенеза для дальнейшего получения термостабильных белков. Причем мы обращали особое внимание на анализ D1 и D2 белков тех организмов, которые обитают в условиях повышенной или высокой температур. Для множественного выравнивания белковых последовательностей мы выбирали последовательности белков D1 и D2 организмов-представителей: мезофилов и экстремофилов. В результате анализа множественного выравнивания последовательностей мы нашли в белке D1 пять сайтов, которые являются неконсервативными (то есть не сохраненными в процессе эволюции).
Этими сайтами являются:
1) D1-46, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Тре или Сер, тогда как в термофильных организмах встречается Иле;
Рис. 5. Сборка и использование тест-системы для аналитического выявления водорода. 1 - система для сбора газа; 2 - малые сосуды с раствором катализатора и индикатора, после эксперимента с клетками, подвергнутыми температурному стрессу
2) D1-116, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Вал, тогда как в термофильных организмах встречается Иле;
3) D1-309, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Сер, а в термофильных организмах встречается Ала.
Также мы обнаружили, что в области контакта белков D1 и D2 консервативные изменения по группам организмов-представителей экстремофилов и мезофилов несут только два сайта D1-209 и D1-212.
Подобным образом в результате множественного выравнивания последовательностей белка D2 мы обнаружили три сайта, которые также являются неконсервативными.
Этими сайтами являются:
1) D2-224, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Глу, тогда как в термофильных организмах встречается Глн;
2) D2-230, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Асн, а в термофильных организмах встречается Сер;
3) D2-300, где в мезофильных и термостойких организмах встречается аминокислота Вал, тогда как в термофильных организмах встречается Иле.
Но в отличие от белка D1 мы не нашли сайтов, несущих консервативные изменения по группам организмов-представителей экстремофилов и мезофиллов, а только в соответствии с их принадлежностью к низшим таксонам (бактерии) и высшим (водоросли / высшие растения).
т
И
I
1 а
3
Рис. 6. Структурный анализ ФС2 [25]. Выбранные аминокислотные остатки белков D1 (светло-серый): 1 - D1-S270, 2 - D1-R269 и D2 (темно-серый): 3 - D2-S230; кофактор ^в) представлены как «палочки».
Также мы выполнили структурный анализ всех АК-остатков, которые являются неконсервативными в белках РЦ ФС2 [25]. Многие из них не представляют структурной значимости. То есть они не находятся в структурно важных участках относительно их предполагаемой функциональной роли. Исключениями являются D1 - G208, А209, С212, S270; D2 - S230, Е224. Как уже было показано ранее [18], двойная мутация по сайтам D1-209\212 придает ФС2 термотолерантность. Эффект одиночной мутации на функцию ФС2 в сайтах D1-G208 и D1-S212 также был исследован нами, однако мы не проводили работ по исследованию структурно-функциональной роли D1-A209 в организме Synechocystis РСС 6803. Также, как видно на рис. 6, АК-остаток D2-S230 находится в непосредственной близости от участка связывания гербицидов QB и АК остатков, предположительно вовлеченных в функцинальное окружение сайта QB - Я269, S270). В будущем было бы интересно провести мутагенез сайта D2-S230 и выяснить его роль в отношении стрессовых температур.
6. Культивирование цианобактерий в условно открытой системе. Основываясь на полученных результатах, мы поставили эксперимент по культивированию клеток мутанта в открытой системе наподобие открытого биореактора. Клетки цианобактерий Synechocystis 6803 АС инокулировали нестерильно в питательную среду BG-11 в емкости открытого типа и культивировали на экспериментальной площадке ботанического сада УдГУ (рис. 7). Объем питательной среды составлял 5 л, объем инокулята 250 мл, период культивирования 5 суток, температура культивирования 30 °С при постоянном перемешивании и освещении. Экспериментальное оборудование помещалось под тентом для защиты блока управления от осадков. Определение оптической плотности культуры проводили в начальной и конечной точках: для открытой емкости получили возрастание ОП 750 с 0,01 до 0,15 и для закрытой емкости - с 0,01 до 0,3.
Рис. 7. Общий вид и устройство емкости для культивирования цианобактерий.
1 - электрощит/блок управления; 2 - поликарбонатная крышка со светодиодным осветителем;
3 - нагревательный элемент и циркуляционный насос (в емкости); 4 - емкость для культивирования;
5 - культура цианобактерий
Выводы
На основе наших результатов мы можем сказать, что:
1) получен положительный результат адаптации мутанта АС к условиям повышенных температур при нормальной интенсивности света и скачкообразных (циклических) температур при низкой интенсивности света без добавления углекислого газа, а также при циклах «12 часов свет - 12 часов темнота»;
2) обнаружено увеличение выхода биомассы клеток у мутанта АС по сравнению с диким типом и гетероцистосодержащей линией цианобактерий АпаЬаепа в условиях, приближенных к открытым системам (пруды) при биотехнологическом производстве биомассы;
3) увеличение выхода биомассы сопровождается повышенной устойчивостью мутанта АС к условиям культивирования, что подтверждается тестами на жизнеспособность (флуоресцентная микроскопия) и термотолерантность (иммуноблоттинг с антителами против БТШ, каталаз и пероксидаз) клеток, выращенных в условиях физиологических и стрессовых температур;
4) проведен биоинформатический анализ полной последовательности белков РЦ ФС2 у фото-синтезирующих организмов и выявлены перспективные сайты для генетической инженерии важных белков фотосинтеза;
5) получено первое подтверждение производства водорода при повышенной температуре у мутанта АС;
6) впервые были получены предварительные результаты культивирования штамма Synechocystis 6803 АС в условно открытых системах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гольцов В.А., Везироглу Т.Н., Гольцова Л.Ф. От водородной экономики к водородной цивилизации: планетарные и региональные аспекты трансформации // International Scientific J. for Alternative Energy and Ecology (ISJAEE). 2002. № 4. С. 7-14.
2. Greenwell H.C., Laurens L.M.L., Shields R.J., Lovitt R.W., Flynn K.J. Placing microalgae on the biofuels priority list: a review of the technological challenges // J. R. Soc. Interface. 2010. № 7. Р. 703-726.
3. Allakhverdiev S.I., Kreslavski V.D., Thavasi V., Zharmukhamedov S.K., Klimov V.V., Nagata T., Nishihara H., Ramakrishna S. Hydrogen photoproduction by use of photosynthetic organisms and biomimetic systems // Photochem. Photobiol. Sci. 2009. № 8. P. 148-156.
4. Марков С.А. Биоводород: Возможное использование водорослей и бактерий для получения молекулярного водорода // Альтернативная энергетика и экология. 2007. № 1(45). С. 30-34.
5. Govindjee, Krogmann D. Discoveries in oxygenic photosynthesis (1727-2003): a perspective // Photosynthesis Research. 2004. №80. Р. 15-57.
6. Li Y, Horsman M., Wu N., Lan C.Q., Dubois-Calero N. Biofuels from Microalgae // Biotechnol. Prog. 2008. № 24. Р. 815-820.
7. Winkler M., Kuhlgert S., Hippler M., Happe T. Characterization of the key step for light-driven hydrogen evolution in green alga // J. Biol. Chem. 2009. № 284(52). Р. 26620-26627.
8. Iwuchukwu I.J. Protein engineering for the Enhanced Photo-production of Hydrogen by Cyanobacterial Photosystem I: PhD dissertation. - Knoxville: The University of Tennessee, 2011. 191 p.
9. Gaffron H., Rubin J. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae // J. Gen. Physiol. 1942. № 26. Р. 219-240.
10. Pinto F.L., Troshina O., Lindblad P. A brief look at three decades of research on cyanobacterial hydrogen evolution // International Journal of Hydrogen Energy. 2002. № 27 (11-12). Р. 1209-1215.
11. Hydrogen production by Cyanobacteria / Dutta D., De D., Chaudhuri S., Bhattacharya S.K. // Microbial Cell Factories. 2005. № 4(36). Р. 1-11.
12. Angermayr S.A., Hellingwerf K.J., Lindblad P., Teixeira de Mattos M.J. Energy biotechnology with cyanobacteria // Current Opinion in Biotechnology. 2009. № 20. Р. 257-263.
13. Tamagnini P., Axelsson R., Lindberg P., Oxelfelt F., Wunschiers R., Lindblad P. Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. № 66(1). Р. 1-20.
14. Yu J., Takahashi P. Biophotolysis-based Hydrogen Production by Cyanobacteria and Green Microalgae // Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Formatex, 2007. P. 79-89.
15. Antal T.K., Lindblad P. Production of H2 by sulphur-deprived cells of the unicellular cyanobacteria Gloeocapsa alpicola and Synechocystis sp. PCC 6803 during dark incubation with methane or at various extracellular pH // Journal of Applied Microbiology. 2005. № 98. Р. 114-120.
16. Tsygankov A.A., Fedorov A.S., Kosourov S.N., Rao K.K. Hydrogen production by cyanobacteria in an automated outdoor photobioreactor under aerobic conditions // Biotechnology and Bioengineering. 2002. № 80. P. 777-783.
17. Zhang L., Happe P., Melis A. Biochemical and morphological characterization of sulfur-deprived and H2-producing Chlamydomonas reinhardtii (green alga) // Planta. 2002. № 214. P. 552-561.
18. Dinamarca J., Shlyk-Kerner O., Kaftan D., Goldberg E., Dulebo A., Gidekel M., Gutierrez A., Scherz A. Double Mutation in Photosystem II Reaction Centers and Elevated CO2 Grant Thermotolerance to Mesophilic. Cyanobacte-rium // PLoS One. 2011. № 6(12). Р. 1-13.
19. Шлык О.В., Кафтан Д., Шерц А. О роли глицина в регуляции скорости переноса электронов в реакционном центре фотосистемы II // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о земле. 2013. №1 С.52-59.
20. Shlyk-Kerner O., Samish I., Kaftan D., Holland N., Sai M., Kless H., Scherz A. Modulation of Protein Flexibility Acclimatizes Photosynthetic Energy Conversion to the Ambient Temperature // Nature. 2006. № 442. P. 827-830.
21. Schrader P.S., Burrows E.H., Ely R.L. High-Throughput Screening Assay for Biological Hydrogen Production // Anal. Chem. 2008. №80. P. 4014-4019.
22. Katsuda T, Ooshima H, Azuma M, Kato J. New detection method for hydrogen gas for screening hydrogen-producing microorganisms using water-soluble Wilkinson's catalyst derivative // J. Biosci. Bioeng. 2006. № 102(3). Р. 220-226.
23. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. № 22. P. 4673-4680.
24. Umena Y., Kawakami K., Shen J.R., Kamiya N. Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II at a resolution of 1.9 A // Nature. 2011. № 473. Р. 55-60.
25. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. № 18. Р. 2714-2723.
Поступила в редакцию 02.08.14
O. V. Shlyk-Kerner, S. V. Ovechkin, A.S. Gasnikov
REVEALING OF ADAPTATION MECHANISMS TO ELEVATED TEMPERATURES IN CYANOBACTERIA: A PLATFORM FOR CREATING STRESS RESISTANT PRODUCERS OF BIOHYDROGEN
There exists a problem of industrial production of biohydrogen which is ecologically clean alternative to fossil fuels. Hydrogen production on such a scale requires obtaining cyanobacteria species which are resistant to contamination by other types of microorganisms and producing large amounts of biomass and hydrogen under the current conditions of global warming. Earlier we were able to get the cyanobacterial strain containing thermostable photosystem 2. This time we examined the adaptation of the organism to elevated temperatures and cyclic temperature/light changes at a level of whole cells and other proteins. Also we offered a test system for the quantitative evaluation of hydrogen production at elevated temperatures. The first confirmation of hydrogen production at elevated temperature in the mutant AC was received. The preliminary results of the cultivation of a strain of Synechocystis 6803 AC in conditionally open systems were first obtained.
Keywords: biohydrogen, cyanobacteria, photosynthesis, mutagenesis, stress adaptation.
Шлык-Кернер Оксана Владимировна,
кандидат биологических наук, доцент
E-mail: [email protected]
Овечкин Сергей Владимирович, технолог
учебно-научной лаборатории молекулярной биологии
E-mail: [email protected]
Гасников Андрей Семенович, магистрант E-mail: [email protected]
Shlyk-Kerner O.V.,
Candidate of Biology, Associate Professor E-mail: [email protected]
Ovechkin S.V.,
Process Engineer at laboratory of molecular biology E-mail: [email protected]
Gasnikov A.S., master degree student E-mail: [email protected]
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» Udmurt State University
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1) 462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
