CC BY
17
Научная статья
УДК 664.2:577.15
DOI:10.52653/PPI.2021.12.12.013
О получении мальтотетраозной крахмальной патоки с использованием препарата мальтотетраогидролазы Optimalt 4G
Александр Алексеевич Папахин1, Зинаида Михайловна Бородина2, Валентина Андреевна Гулакова3
'' 2' 3ВНИИ крахмалопродуктов - филиал ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН, д.п. Красково, Московская обл., papahin_aleksandr@mail.ru
Аннотация. Одним из направлений решения актуальной задачи по расширению ассортимента сахаристых крахмалопродуктов является разработка способов получения мальтоолигосахаридов с различным углеводным составом, имеющих большой потенциал для использования в качестве пищевых добавок и ингредиентов продуктов здорового питания. Целью работы было изучение возможности получения нового вида крахмальной патоки с высоким содержанием мальтотетраозы с применением препарата мальтотетраогидролазы Optimalt 4G. Объектами являлись кукурузный крахмал, препараты альфа-амилазы Liquazyme Supra 2.8X и пуллуланазы Promozyme D6 (Novozymes), мальтотетраогидролазы Optimalt 4g (Du Pont), а также продукты гидролиза крахмала. Использованы методы определения массовой доли редуцирующих веществ (РВ), сухого вещества (СВ), углеводного состава, динамической вязкости гидролизатов и другие стандартные методы анализа. При осахаривании частично гидролизованной суспензии крахмала с концентрацией СВ 33 % и содержании РВ 7,9 % мальтотетраогидролаза наиболее активно действует в первые 3 ч осахаривания с резким снижением вязкости гидролизата с 197,6 до 20,0 мПа-с. При этом исчезали практически все олигосахариды с DP5-DP10, массовая доля ВМС снизилась на 60 %, увеличилось количество низкомолекулярных сахаров, а массовая доля мальтотетраозы составила 44,81 % против 2,38 % в исходном субстрате. Максимальное содержание мальтотетраозы 49,8 % в данных условиях наблюдалось в гидролизате после 8 ч инкубации, далее оно медленно снижалась. Установлена возможность получения крахмальной патоки с высоким содержанием мальтотетраозы до 45-48 % с использованием в качестве катализаторов гидролиза крахмала вышеуказанных ферментных препаратов. Использование композиции мальтотетраогидролазы с пуллуланазой увеличивает содержание мальтотетраозы на 1,5-2 %, снижает вязкость гидролизатов и позволяет сократить продолжительность гидролиза. Полученные данные являются актуальной основой для оптимизации технологических параметров процесса осахаривания с применением мальтотетраогидролазы с целью разработки технологии получения нового вида крахмальной патоки.
Ключевые слова: крахмал, гидролиз, редуцирующие вещества, мальтотетраогидролаза, осахаривание, углеводный состав, мальтотетраоза
Для цитирования: Папахин А. А., Бородина З. М., Гулакова В. А. О получении мальтотетраозной крахмальной патоки с использованием препарата мальтотетраогидролазы Optimalt 4G // Пищевая промышленность. 2021. № 12. С. 68-73.
Original article
Preparation of maltotetraose starch molasses using Maltotetraohydrolase Optimalt 4G
Alexander A. Papakhin1, Zinaida M. Borodina2, Valentina A. Gulakova3
2' 3All-Russian Scientific Research Institute for Starch Products - Branch of V. M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of RAS, Kraskovo, Moscow region, papahin_aleksandr@mail.ru
Abstract. One of the directions of solving the current problem of expanding the range of sugar starch products is the development of methods for producing maltooligosaccharides with a different carbohydrate composition, which have great potential for use as food additives and ingredients of healthy foods. The aim of the work was to study the possibility of obtaining a new type of starch syrup with a high content of maltotetraose using the preparation Maltotetraohydrolase Optimalt 4G. The objects were: corn starch, alpha-amylase preparations Liquazyme Supra 2.8X and pullulanase Promozyme D6 (Novozymes), maltotetraohydrolase Optimalt 4G (Du Pont), as well as starch hydrolysis products. Methods were used to determine the weight fraction of reducing substances (RS), dry solid (DS), carbohydrate composition, dynamic viscosity of hydrolysates and other standard methods of analysis. When a partially hydrolyzed suspension of starch with a concentration of DS 33 % and RS 7.9 % is saccharified, maltotetraohydrolase is most active in the first 3 hours of saccharification with a sharp decrease in the viscosity of the hydrolysate from 197.6 to 20.0 mPas. At the same time, almost all oligosaccharides with DP5-DP10 disappeared, the weight fraction of WMS decreased by 60 %, the number of low-molecular sugars of DP1-3 increased, and the weight fraction of maltotetraose was 44.81 % versus 2.38 % in the original substrate. The maximum maltotetraose content of 49.8 % under these conditions was observed in the hydrolysate after 8 hours of incubation, then it slowly decreased. It has been found that in order to obtain hydrolysates with a low DP1-3 content and increased (more than 45 %) maltotetraose, the degree of preliminary hydrolysis must be maintained within the range of RS 8-15 % by DS at an enzyme dosage of 0.06-0.08 units WMC/g DS starch and duration of saccharification up to 20 h. Use of maltotetraohydrolase composition with pullulanase during saccharification increases degree of hydrolysis and content of maltotetraose by 1.5-2 %, reduces viscosity of hydrolysates and reduces duration of hydrolysis. It is possible to produce starch syrup with high content of maltotetraose (up to 45-48 %) using the above enzyme preparations. The obtained data are the current basis for optimization of technological parameters of saccharification process with application of maltotetraohydrolase in order to develop technology of production of new kind of starch syrup.
Keywords: starch, hydrolysis, reducing substances, maltotetraohydrolase, saccharification, carbohydrate composition, maltotetraose
For citation: Papakhin A. A., Borodina Z. M., Gulakova V. A. Preparation of maltotetraose starch molasses using Maltotetraohydrolase Optimalt 4G // Food processing industry. 2021;(11):68-73 (In Russ.).
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта Conflict of interest: the authors declare that there is no conflict of interest.
Автор, ответственный за переписку: Александр Алексеевич Папахин, papahin_aleksandr@mail.ru Corresponding author: Alexander A. Papakhin, papahin_aleksandr@mail.ru
© Папахин А. А., Бородина З. М., Гулакова В. А., 2021 68 12/2021 ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ISSN 0235-2486
Введение. Расширение ассортиментной линейки сахаристых крахмалопродуктов, обладающих востребованными функциональными свойствами для применения в различных отраслях пищевой промышленности РФ, является актуальной задачей крахмалопаточной отрасли. Одним из важнейших направлений решения данной задачи является разработка способов гидролиза крахмала с использованием в качестве биокатализаторов амилолитич-ских ферментов, обладающих специфичной способностью образовывать мальто-олигосахариды с различной степенью полимеризации (ОР), обуславливающие основные востребованные функциональные свойства получаемых продуктов. Мальтоолигосахариды представляют собой углеводные полимеры, состоящие из 2-10 мономерных а-О-глюкопиранозных единиц, связанных а-1,4-гликозидными связями [1]. С начала 60-х годов прошлого века предметом интенсивных исследований являются гидролитические ферменты, способные расщеплять крахмал до олиго-сахаридов, обладающих высокой функциональностью и огромным потенциалом для промышленного использования. Свойства мальтоолигосахаридов определяются степенью полимеризации, углеводным составом и характеризуются умеренной сладостью, относительно низкой осмоляльностью, высокой водоудерживающей способностью, подходящей вязкостью, некристаллизуе-мостью и повышенной температурой замерзания, что обуславливает их широкое использование в пищевой промышленности в качестве пищевых ингредиентов, пребиотических добавок, в производстве кормов для животных и агрохимикатов, в фармацевтике в качестве средств доставки лекарств и косметике [2, 3].
В результате многочисленных исследований ученых обнаружено, получено и рекомендовано к применению большое число глюканогидролаз, обладающих различной специфичностью действия на крахмал при получении мальтоолигоса-харидов с определенной степенью полимеризации: мальтотриозообразующая G3-амилаза (ЕС 3.2.1.116) [4], мальтотетра-озообразующая G4-амилаза (ЕС 3.2.1.60) [5, 6], мальтопентаозообразующая G5-амилаза [7] мальтогексаозообразую-щая G6-амилаза [8], мальтогептаозообра-зующая G7-амилаза [9].
вышеперечисленные амилазы характеризуются специфичностью действия на крахмал - в процессе гидролиза они отщепляют с нередуцирующего конца молекул олигосахариды с определенной степенью полимеризации (ОР 3-7). Анализ публикаций показал, что наибольшее число работ посвящено исследованиям по получению и использованию мальто-тетраогидролазы - амилазы, обеспечивающей получение мальтоолигосахаридов, основной составляющей которых является мальтотетраоза [10-14].
Систематическое название фермента -4-а^-глюканмальтотетраогидролаза, ЕС 3.2.1.60, тривиальное - мальтотетраоги-дропаза, 4G-амилаза. В зависимости от микроорганизма-продуцента, условий получения данный фермент может обладать экзо- и/или эндодействием на крахмал и его производные. Согласно химико-технической оценке (СТА), проведенной продовольственной и сельскохозяйственной Организацией Объединенных Наций (ФАО) [15], препарат мальтотетраогидро-лазы получают путем глубинного культивирования генетически модифицированного штамма Bac. licheniformis, содержащего ген вышеуказанного фермента, выделенный из Pseudomonas stutzeri. По данным ФАО, штамм Bac. licheniformis считается непатогенным и нетоксичным. Он широко используется в производстве коммерческих препаратов ферментов, в том числе ферментов из генно-инженерных штаммов микроорганизмов. Фермент маль-тотетраогидролаза при культивировании выделяется в культуральную жидкость и затем очищается, концентрируется и стандартизируется с помощью сорбата калия или других ингредиентов до желаемой активности и стабильности. Полученные препараты в сухом или жидком виде соответствуют общим требованиям для использования их в пищевой промышленности. Коммерческий препарат указанного фермента Optimalt 4G был предоставлен ВНИИ крахмалопродуктов для испытаний представительством компании DuPont (США).
Цель работы - изучение возможности получения мальтотетраозной крахмальной патоки с использованием препарата мальтотетраогидролазы Optimalt 4G.
Объекты и методы исследований.
Объектами исследования в данной работе являлись кукурузный крахмал высшего сорта стандартного качества по ГОСТ 32159-2013, препарат термостабильной бактериальной альфа-амилазы Liquazyme Supra 2.8X (Novozymes, Дания) с активностью 2000 ед. АС/г, препарат мальтотетраогидролазы Optimalt 4G (Du Pont, США) с активностью 38 BMK/г и препарат пуллуланазы Promozyme D6 (Novozymes, Дания) с активностью 4060 NPUN/г, а также продукты, полученные в процессе гидролиза крахмала. Указанные активности ферментов были представлены производителями данных препаратов. Все реактивы, используемые для анализов, были аналитического качества.
Экспериментальные исследования проводили в лабораторных условиях по традиционной технологической схеме производства сахаристых продуктов из крахмала, включающей следующие операции:
- приготовление крахмальной суспензии с концентрацией СВ 32 % и доведение рН до оптимального значения;
- дозирование термостабильной бактериальной альфа-амилазы, нагревание смеси до 90...95 °С для клейстеризации и разжижения с последующей обработкой при 115.130 °С для достижения полноты клейстеризации крахмала и термической инактивации альфа-амилазы;
- охлаждение и доведение рН гидро-лизатов до значений, оптимальных для действия осахаривающих ферментов, их дозирование и проведение процесса осахаривания при продолжительности, контролируемой путем отбора проб и определения необходимой степени гидролиза по содержанию редуцирующих сахаров (РВ, в % по сухому веществу в пересчете на глюкозу);
- механическая очистка полученных гидролизатов от взвешенных примесей (жир, белок и др.) путем фильтрования или сепарирования;
- адсобрционная очистка сиропов от растворимых примесей активным углем и/или ионообменными смолами и концентрирование сиропов увариванием или распылительным высушиванием до получения готовых продуктов с требуемой концентрацией сухого вещества согласно нормативной документации (НД).
Проведение опытов в настоящей работе осуществляли с использованием лабораторного оборудования: клейсте-ризация и разжижение крахмала - на разжижающей установке изготовления опытно-экспериментального завода ВНИ-ИК, осахаривание - на термошейкере IKA KS4000i control (Германия), фильтрование гидролизатов - на вакуум-фильтровальной установке, включающей колбу Бунзена и воронку Бюхнера, соединенные вакуум-насосом, выпаривание и уваривание сахаров на вакуум-выпарной установке UL-2000E (Китай), высушивание - на распылительной сушилке Biorus BL8000.
В ходе проведения экспериментов использовали общепринятые и стандартные методы анализа. степень гидролиза крахмала в процессе разжижения и оса-харивания оценивали путем определения массовой доли редуцирующих веществ методом Лейна-Эйнона (ГОСТ Р 5054993). Углеводный состав гидролизатов определяли методом ВЭЖХ на анализаторе углеводов Bischoff 8120 (Германия) с рефрактометрическим датчиком и колонкой Resex RSO Oligosaccharide. Динамическую вязкость гидролизатов и готовой продукции измеряли на ротационном вискозиметре Reotest-2. определение показателей величины рН среды, сухого вещества и других - методами технохимического контроля производства крахмала и крах-малопродуктов [16]. Опыты проводили не менее чем в 2 повторностях. Полученные результаты обрабатывали с использованием методов математической статистики. В статье представлены данные с доверительной вероятностью не менее 95 %.
Таблица 2
Характеристика гидролизатов, полученных в процессе осахаривания разжиженного крахмала с применением мальтотетраогидролазы
Время осахаривания, ч Углеводный состав гидролизатов, % по СВ РВ, % по СВ Вязкость, мПа^с
DP1 Глюкоза DP2 Мальтоза DP3 DP4 DP5 DP6 DP7 DP8 DP9 DP10 ВМС
0-разж. крахмал 0,0 1,55 4,73 2,38 2,66 4,80 5,76 6,21 5,05 0,0 65,96 7,9 197,6
3 1,34 3,62 5,89 44,81 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 41,73 25,18 20,0
8 1,82 4,23 7,08 49,80 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 37,07 26,90 14,3
20 2,79 5,61 8,78 48,34 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 34,48 30,54 14,2
30 3,31 6,22 9,82 47,25 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,40 33,20 14,1
48 4,81 7,90 11,96 44,07 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 31,96 34,7 12,9
Таблица 3
Влияние дозировки мальтотетраогидролазы на характеристику гидролизатов, получаемых в процессе осахаривания разжиженного крахмала
Доза G4-амилазы т оса- Характеристика гидролизатов
№ ед. ВМК /г СВ мг/г СВ хари- РВ, % по СВ Углеводный состав, % по СВ Вяз-
оп. вания, ч DP1 DP2-DP3 DP4 DP5-DP10 ВМС кость, мПа^с
Субстрат после разжижения 0 16,80 0,0 10,65 4,48 30,08 54,79 93,86
3 26,50 1,54 16,56 35,43 5,50 40,97 11,05
1 0,038 1,0 8 29,80 2,00 18,21 44,22 0,0 35,57 8,4
1 20 32,40 2,71 20,26 44,28 0,45 32,31 7,4
48 34,60 4,04 22,47 42,72 0,53 30,65 7,3
3 26,90 1,43 16,70 35,10 7,61 39,15 10,5
2 0,057 1,5 8 30,80 2,21 18,81 45,08 0,0 37,89 8,3
20 32,90 2,62 20,21 43,50 0,0 33,68 7,3
48 35,80 4,45 21,24 42,83 0,0 31,48 7,1
3 29,60 1,85 27,96 42,96 0,0 37,22 9,4
3 0,076 2,0 8 31,80 2,62 20,19 45,26 0,0 31,93 7,8
20 33,90 3,65 21,59 43,37 0,82 30,58 6,8
48 37,50 5,53 24,58 39,72 1,11 29,06 6,7
Таблица 1
Характеристика ферментного препарата Optimalt 4G
Показатели
Фермент Мальтотетраозообразующая амилаза (ЕС 3.2.1.60, глюкан 1,4-альфа-мальтотетраогидролаза) экзо- и эндодействия
Продуцент Генетически модифицированный штамм из Bacillus licheniformis
Рекомендуемые условия действия на крахмал рН среды 5,0-5,5, температура 60-65 °С
Специфическая активность 38 ВМК/г
Сопутствующие активности Глюкоамилазная - 14,0 ед. ГлС/г, альфа-амилазная - 112,5 ед. АС/г
Результаты и их обсуждение. Как
указывалось ранее, испытуемый препарат мальтотетраогидролазы Optimalt 4G был предоставлен компанией Du Pont (США). В сопровождающей документации на препарат приведены данные, характеризующие происхождение фермента, его активность, предельные величины оптимальных условий (рН, температура, дозирование) при использовании в качестве катализатора процесса гидролиза крахмала. В дополнение к представленным данным в испытуемом препарате мальтотетраогидролазы были определены имеющие место сопутствующие активности амилаз: глюкоамилазы и альфа-амилазы методами, изложенными в ГОСТ 34440-2018 (табл. 1). На первых этапах исследований в настоящей работе рекомендуемые данные использованы при варьировании условий разжижения и осахаривания разжиженного крахмала с целью получения мальтотетраозной патоки (крахмальной патоки с повышенным содержанием мальтотетраозы).
В первой серии опытов осахарива-нию препаратом Optimalt 4G подвергали гидролизат клейстеризованного и разжиженного крахмала с концентрацией СВ 33 % и массовой долей редуцирующих веществ (РВ) 7,9 % по СВ в пересчете на глюкозу. Условия осахаривания: рН субстрата 5,4±0,1 (без изменения величины рН разжиженного продукта), температура инкубации 61±1 °С, при постоянном перемешивании при 130 об/мин, доза фермента 1,5 мг/г СВ крахмала, что составляло 0,057 ед. ВМК/г сухого вещества (СВ) крахмала. В опытах варьировали продолжительность осахаривания, прекращая процесс гидролиза через 3, 8, 20, 30, 48 ч путем инактивации ферментов нагреванием гидролизатов на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После инактивации ферментов гидролизаты фильтровали для очистки от взвешенных примесей. В полученных бесцветных и прозрачных сиропах определяли концентрации СВ, массовую долю РВ (% по СВ), углеводный состав (% по СВ) и динамическую вязкость. Результаты анализов представлены в табл. 2.
При обсуждении полученных результатов выявлено, что мальтотетраогидрола-за, катализируя процесс осахаривания частично гидролизованного (РВ 7,9 % по СВ) крахмала, эффективно действует в первые 3 ч инкубации при заданных условиях, что можно объяснить как экзо- так и эндо-механизмом ее действия. В гидролизате наблюдалось резкое изменение углеводного состава: исчезали практически все олигосахариды с DP5-DP10, массовая доля ВМС снизилась на 60 %, увеличилось количество низкомолекулярных сахаров, а массовая доля мальтотетраозы составила 44,81 % (против 2,38 % в исходном субстрате). При этом резко возросла степень гидролиза крахмала (от 7,90 % до 25,18 % РВ по СВ) и, соответственно, снизилась
вязкость гидролизатов - важный технологический параметр производства сахаристых крахмалопродуктов. При увеличении продолжительности процесса осахаривания степень гидролиза повышалась медленнее, и возрастание обусловлено в основном повышением массовой доли моно-, ди- и трисахари-дов в процессе гидролиза ВмС. максимальная доля мальтотетраозы (49,8 % по СВ) в данных условиях наблюдалась в гидролизате после 8 ч инкубации, далее она медленно снижалась, что, очевидно, свидетельствовало о снижении действия мальтотетраогидролазы, возможно, из-за изменения структуры субстрата или
конкурентного действия сопутствующих ферментов.
Анализ углеводного состава гидролизатов позволил предположить, что механизм действия мальтотетраогидролазы на частично гидролизованный крахмал подобен бета-амилазе, которая расщепляет а-1,4-гликозидные связи с нередуцирую-щего конца молекул только по линейной цепи и приостанавливается на предпоследней а-1,4-связи, граничащей с а-1,6-связью. Бета-амилаза обладает сродством к высокомолекулярным субстратам, образуя при действии на клейстеризованный крахмал 54-58 % мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстри-
ны, содержащие а-1,6-связи - так называемые конечные декстрины [17]. В отличие от бета-амилазы, мальтотетраогидролаза, видимо, обладает сродством к олигосаха-ридам с DP 5-10, так как их содержание в углеводном составе гидролизатов уже через 8 ч осахаривания не наблюдалось.
Снижение вязкости гидролизатов в процессе осахаривания также обусловлено изменениями их углеводного состава. Резкое снижение наблюдалось в первые 3 ч (со 197,6 до 20,0 мПа^с), плавное - от 3 до 8 ч (с 20,0 до 14,4 мПа^с), далее вязкость снижалась незначительно, что важно для оптимизации технологических параметров процесса осахаривания.
Известно, что на действие ферментов в различных реакциях оказывает влияние множество факторов, в том числе химический состав, физико-химические и структурные свойства субстратов, а также концентрация фермента в реакции. На основании полученных результатов и анализа публикаций по данной проблеме следующим этапом исследований было изучение влияния степени предварительного гидролиза крахмала при разжижении и дозирования фермента на действие мальтотетраогидролазы в процессе осахаривания. с этой целью процесс разжижения крахмала проводили в аналогичных условиях, но с повышенной дозировкой а-амилазы Liquazyme Supra 2,8 перед обработкой под давлением. Массовая доля РВ гидролизата перед осахариванием составляла 16,8 % по СВ. Процесс осахаривания осуществляли при тех же условиях, что и в предыдущем опыте, и действие мальтотетраогидролазы оценивали определением принятых показателей. В опытах варьировали дозировку препарата Optimalt 4G: в единицах ВМК она составляла 0,038, 0,057 и 0,076 на грамм СВ крахмала, расход препарата при этом составил 1,0, 1,5 и 2,0 мг/г СВ крахмала и продолжительность процесса 0, 3, 8, 20, 30, 48 ч.
В ходе анализа углеводного состава гидролизатов (табл. 3) выяснено, что с увеличением дозировки мальтотетраоги-дролазы в 2 раза накопление массовой доли мальтотетраозы, достигая максимального значения при продолжительности осахаривания в пределах 8-20 ч, в процентном отношении незначительно возрастало (с 44,28 до 45,26 %), а после 20 ч снижалось.
При этом с увеличением продолжительности наблюдалось стабильное возрастание массовой доли низкомолекулярных сахаров (DP1-3), в частности глюкозы, что обуславливало повышение степени гидролиза крахмала (РВ, % по СВ) и, следовательно, снижение количества ВМС и вязкости гидролизатов. Полученные данные могут быть связаны с замедлением или прекращением действия мальтотетроги-дролазы из-за отсутствия олигосахаридов с DP5-10 и/или действием сопутствующих
ферментов (альфа-амилазы и глюкоами-лазы) на ВМС. Для оптимизации дозировки препарата Ор^таК 4G исследования необходимо продолжить в направлении разработки оптимальных технологических параметров процесса осахаривания для получения нового вида крахмальной патоки.
Влияние степени предварительного гидролиза крахмала на стадии разжижения на процесс осахаривания мальтотетрао-гидролазой оценивали путем сравнения результатов опытов, проведенных в аналогичных условиях с использованием в качестве субстратов полученные при разжижении гидролизаты крахмала с РВ 7,9 % и 16,8 % по СВ соответственно. При сравнении данных углеводного состава субстратов (см. рисунок) отмечено, что при содержании РВ 16,8 % по СВ в субстрате наблюдалось большее содержание низкомолекулярных сахаридов 0Р1-3: 11,65 % по сравнению с 6,28 % в субстрате с РВ 7,9 %, которые в ходе осахаривания перешли в гидролизаты, повышая степень гидролиза и снижая содержание мальтотетраозы. Максимальная доля мальтотетраозы при использовании субстрата с РВ 7,9 % через 8 ч осахаривания составила 49,8 %, а при РВ субстрата 16,8 % - 44,9 %. В целом при необходимости получения продуктов с низким содержанием низкомолекулярных сахаров (глюкозы, мальтозы, мальто-триозы) и повышенным - мальтотетраозы (более 45 % по СВ) следует процесс разжижения проводить до содержания РВ более 8 %, но менее 16 %.
Известно, что использование пуллула-назы, фермента, расщепляющего а-1,6-гликозидные связи в крахмале и его полисахаридах, в композиции с бета-амилазой и глюкоамилазой на стадии осахаривания при получении высокомальтозной патоки и кристаллической глюкозы повышает выход готовой продукции, снижает продолжительность процесса и расход осаха-ривающих ферментов.
Следующим этапом исследований было изучение влияния пуллуланазы на действие мальтотетраогидролазы в процессе осахаривания разжиженного крахмала.
В качестве субстрата использовали разжиженный крахмал с РВ 16,8 %, доза Ор^таИ 4G составила 0,057 ед. ВМК/г СВ, доза препарата пуллуланазы Promozyme 06 - 1,0 NPUN/г СВ, рН субстрата, температура осахаривания 60 °С, продолжительность 48 ч с отбором проб 3, 8, 20, 48 ч. Результаты сравнивали с данными, полученными в аналогичных условиях предыдущего опыта с индивидуальной дозой мальтотетраогидролазы 0,057 ед. ВМК/г СВ. Результаты сравнения показали, что добавление пуллуланазы на 1,5-2,0 % увеличило степень гидролиза и показатели углеводного состава гидро-лизатов, в частности мальтотетраозы, при осахаривании до 20 ч (табл. 4).
При 48 ч осахаривания содержание мальтотетраозы в опыте с композицией ферментов снизилось на 3,8 % по сравнению с индивидуальной мальтоте-траогидролазой, содержание сахаридов с 0Р1-3 при этом увеличилось на 16,5 %, а степень гидролиза - на 4,8 %. Отмечено, что при включении пуллуланазы в процесс осахаривания наряду со снижением ВМС в гидролизатах наблюдалось увеличение присутствия олигосахаридов с 0Р5-10, в отличие от индивидуального применения мальтотетраогидролазы. Вероятно, пуллуланаза высвобождает большое количество линейных олигосахари-дов, а мальтотетраогидролаза не успевает их гидролизовать, что указывает на необходимость оптимизации соотношения мальтотетраогидролаза : пуллуланаза при использовании их композиции.
на основании результатов проведенных исследований, согласно вышеприведенной традиционной технологической схеме получения крахмальных паток, были выработаны опытные образцы мальтотетра-озной крахмальной патоки в порошковом и жидком виде с использованием на стадии осахаривания разжиженного крахмала с РВ 12 % испытуемого препарата мальтотетраогидролазы Ор^таК 4G. Технологические параметры процесса осахаривания: рН 5,4, Т 61 ±1 °С, дозировка фермента 0,057 ед. ВМК/г СВ крахмала, продолжительность процесса 20 ч. По-
ПРодолжительность осахаривания, ч Продолжительность осахаривания, ч
Влияние степени предварительного гидролиза крахмала на процесс осахаривания с применением мальтотетраогидролазы: А - РВ субстрата 7,9% по СВ, Б - РВ субстрата 16,8% по СВ
Таблица 4
Влияние добавки пуллуланазы на процесс осахаривания крахмала с применением
мальтотетраогидролазы
Доза ферментов Характеристика гидролизатов
№ оп. Углеводный состав, % по СВ
Optimalt 4G, ед. ВМК/г СВ крахмала Promozyme D6, ед. NPUN/г СВ крахмала т осахаривания, ч РВ, % по СВ DP1 DP2-DP3 DP4 DP5-DP10 ВМС Вязкость, мПа^с
0 16,8 0,0 10,65 4,48 30,08 54,79 93,9
3 26,90 1,43 16,70 35,10 7,61 39,15 10,5
1 0,057 - 8 30,80 2,21 18,81 44,98 0,0 34,00 8,3
20 32,40 2,62 20,21 44,50 0,0 32,68 7,3
48 35,80 5 ,4 4, 21,24 42,83 0,0 31,48 7,2
0 16,8 0,0 10,65 4,48 30,08 54,79 93,9
3 28,90 1,82 18,25 40,01 1,46 38,46 9,1
2 0,057 1,0 8 31,96 2,41 19,45 45,61 1,25 31,30 7,8
20 34,30 3,33 21,58 45,40 2,50 27,19 6,8
48 37,60 5,16 25,58 41,23 2,91 25,13 6,7
Таблица 5
Сравнительная характеристика низкоосахаренной и мальтотетраозной патоки
Вид патоки DP1-3 DP4 DP5 DP6 DP7-10 ВМС РВ, % по СВ Вязкость, мПа^с
Низкоосахаренная 32,7 8,85 13,81 18,49 3,61 21,04 34,6 30,2
Мальтотетраозная 28,1 45,46 0,0 0,0 1,71 27,16 35,2 31,5
лученный гидролизат с концентрацией СВ 33 % и РВ 35,2 % по СВ подвергали механическому фильтрованию для удаления взвешенных примесей, увариванию до СВ 50 %, очистке активированным углем с последующим фильтрованием и увариванием до 78 % СВ при получении патоки в жидком виде и до 70 % СВ перед высушиванием на распылительной сушилке. В полученных опытных образцах патоки определяли углеводный состав и динамическую вязкость 50 %-ных растворов (табл. 5). Для сравнения в таблице представлены результаты анализа промышленного образца стандартной низкоосахарен-ной патоки, получаемой с применением для осахаривания бактериальной альфа-амилазы. Как видно из таблицы, опытный образец мальтотетраозной патоки по степени гидролиза находится практически на одном уровне с низкоосахаренной патокой (РВ 35,2 % против 34,6 % соответственно), однако значительно отличается по углеводному составу. Более низкое содержание низкомолекулярных сахаридов, повышенное содержание мальтотетраозы и ВМС обуславливает повышенную вязкость мальтотетраозной патоки по сравнению с низкоосахаренной.
По опубликованным данным других исследователей [18,19], мальтотетраозная патока (maltotetraose syrup, DP4 syrup) обладает улучшенными функциональными свойствами, к которым относятся: термо-и кислотоустойчивость, низкая реакция Майларда, низкая цветность, средняя степень сладости (1/3 от сахарозы), высокая прозрачность и усвояемость, устойчивость гелей к ретроградации, сохранение влаги
при низкои влажности окружающей среды и более низкая влагопоглощаемость при высокой влажности среды по сравнению с сахарозой, повышенная точка замерзания, хорошее третичное свойство - ин-гибирование роста гнилостных кишечных бактерий. На основании указанных свойств мальтотетраозная патока рекомендуется к широкому использованию в различных пищевых производствах, а также в медицинской, косметической промышленности и т. д.
Заключение. В результате проведенных исследований установлена возможность получения нового вида крахмальной патоки, обладающей улучшенными функциональными свойствами, по традиционной технологии с применением в качестве катализатора процесса гидролиза на стадии осахаривания специфичной амилазы -4-а - О-глюканмальтотетраогидролазы (ЕС 3.2.1.60). Установлено, что основным компонентом углеводного состава продуктов осахаривания в течение процесса является мальтотетраоза: от 35% до 43% при продолжительности процесса 3-48 ч с максимальным значением 45-49% в период 8-20 ч. выявлено влияние на действие мальтотетраозогидролазы степени частичного гидролиза разжиженного крахмала: для получения мальтотетраозной патоки с массовой долей мальтотетраозы не менее 45%, содержание РВ в субтрате не должно превышать 15% по св крахмала. Отмечено, что использование при осахаривании композиции мальтотетраозы с пуллуланазой увеличивает степень гидролиза, снижает вязкость гидро-
лизатов и продолжительность процесса. Полученные данные являются актуальной основой для оптимизации технологических параметров процесса осахаривания с применением мальтотетраогидролазы с целью разработки технологии получения нового вида крахмальной патоки.
Список источников
1. Pan S., Ding N., Ren J. Y., Gu Z. B., Li C. M., Hong Y. MaLtooLigosaccharide-forming Amylase: Characteristics, Preparation and Application // Biotechnology Advances. 2017. Vol. 35. No. 5. P. 619-632. https://doi.org/10.1016/]. biotechadv.2017.04.004
2. Barreteau, H., DeLattre C., Michaud P. Production of oligosaccharides as promising new food additive generation // Food technology and biotechnology. 2006. Vol. 44. No. 3. Р. 323-333.
3. MaaLej H., Ben Ayed, Hanen GhorbeL-BeLLaaj O., Nasri M., Hmidet N. Production and Biochemical Characterization of a High Maltotetraose (G4) Producing Amylase from Pseudomonas stutzeri AS22 // Biomed research international. 2014. Vol. 2014. https://doi. org/10.1155/2014/156438
4. Kamon M., Sumitani J., Tani S., Kawaguchi T., Kamon M., Sumitani J. Characterization and gene cloning of a maLtotriose-forming exo-amyLase from Kitasatospora sp. MK-1785 // AppLied microbioLogy and biotechnoLogy. 2015. VoL. 99. P. 4743-4753. https://doi. org/10.1007/s00253-015-6396-5
5. Robyt J. F., Ackerman R. J. IsoLation, purification, and characterization of a maLtotetraose-producing amyLase from Pseudomonas stutzeri // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1971. VoL. 145. P. 105-114.
6. Nakada T., Kubota M., Sakai S., Tsujisaka Y. Purification and characterization of two forms of maLtotetraose-forming amyLase from Pseudomonas stutzeri // AgricuLturaL and BioLogicaL Chemistry. 1990. VoL. 54. P. 737780. https://doi.org/10.1080/00021369.199 0.10870010
7. Auh J. .H, Lee S. Y., Seung S. Y., Son H. J., Lee J. W., Lee S. J. A noveL maLtopentaose producing amyLase as a bread antistaLing agent // Food Science and BiotechnoLogy. 2005. VoL. 14. No. 5. P. 681-684.
8. Ben A. M., Mhiri S., Mezghani M., Bejar S. Purification and sequence anaLysis of the atypicaL maLtohexaose-forming a-amyLase of the B. stearothermophiLus US100 // Enzyme and MicrobiaL TechnoLogy. 2001. VoL. 28. No. 6. P. 537-542. https://doi.org/10.1016/S0141-0229(01)00294-0
9. Messaoud E. B., Ben A. M., ELLeuch N., Masmoudi N. F., Bejar S. Purification and properties of a maLtoheptaose- and maLtohexaose-forming amyLase produced by BaciLLus subtiLis US116 // Enzyme and MicrobiaL TechnoLogy. 2004. VoL. 34. No. 7. P. 662-666. https://doi.org/10.1016/j. enzmictec.2004.03.002.
10. Su L., Yang Y., Wu J. Recombinant expression, characterization and appLication
of maltotetraohydrolase from Pseudomonas saccharophila // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2020. Vol. 100. No. 8. P. 3456-3464. https://doi.org/10.1002/ jsfa.10381
11. Production of maltotetraose syrup using a pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase variant: U.S. patent № 20130288309A1 / G. Duan [et al.]; publ. date 31.10.2013. 29 p.
12. Reduced sugar syrups and methods of making reduced sugar syrups: U.S. patent No. 9540668 B2 / R. Medhekar, A. J. Hoffman; publ. date 10.01.2017. 14 p.
13. A kind of preparation method of high-purity maltotetraose coproduction limit dextrin: CN patent No. 109234329 A / Shandong Bailong Park Biological Polytron Technologies Inc.; publ. date 18.01.2019. 9 p.
14. Qian Y., Duan G. Maltotetraose syrup production and process optimization // Journal of Food Science and Technology. 2013. Vol. 32. P. 100-104.
15. Maltotetraohydrolase from Pseudomonas stutzeri expressed in bacillus licheniformis: Chemical and Technical Assessment (CTA) / Prepared by J. R. Srinivasan, I. Meyland. FAO JECFA Monographs 17, 2015. 7 p.
16. Технологический контроль производства сахаристых крахмалопродуктов: методическое пособие / под редакцией Н. Д. Лукина, В. В. Ананских, Т. В. Лапидус, Л. С. Хворовой. М.: Россельхозакадемия, 2007. 261 с.
17. Технология ферментных препаратов / под редакцией И. М. Грачевой, А. Ю. Криво-вой. 3-е издание, переработанное и дополненное. М.: Элевар, 2000. 512 с.
18. Kimura T., Nakakuki T. Maltotetraose, a new saccharide of tertiary property // Starch-Starke. 1990. Vol. 42. No. 4. P. 151-157. https://doi.org/10.1002/star.19900420407.
19. Nakakuki T. Oligosaccharides: Production, Properties and Applications // Japanese technology reviews. Switzerland: Gordon and Breach, 1993. Vol. 3. No. 2. P. 175-203.
References
1. Pan S., Ding N., Ren J. Y., Gu Z. B., Li C. M., Hong Y. Maltooligosaccharide-form-
ing Amylase: Characteristics, Preparation and Application. Biotechnology Advances. 2017;35(5):619-632. https://doi. org/10.1016/j.biotechadv.2017.04.004
2. Barreteau H., Barreteau C., Delattre P. Mi-chaud Production of oligosaccharides as promising new food additive generation. Food Technology and Biotechnology. 2006;44(3):323-333.
3. Maalej H., Ben Ayed, Hanen Ghorbel-Bellaaj O., Nasri M., Hmidet N. Production and Biochemical Characterization of a High Maltotetraose (G4) Producing Amylase from Pseudomonas stutzeri AS22. Biomed research international. 2014. https://doi. org/10.1155/2014/156438
4. Kamon M., Sumitani J., Tani S., Kawaguchi T., Kamon M., Sumitani J. Characterization and gene cloning of a maltotriose-forming exo-amylase from Kitasatospora sp. MK-1785. Applied Microbiology and Biotechnology. 2015;99:4743-4753. https://doi.org/10.1007/ s00253-015-6396-5
5. Robyt J. F., Ackerman R. J. Isolation, purification, and characterization of a malto-tetraose-producing amylase from Pseudomonas stutzeri. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1971;145:105-114.
6. Nakada T., Kubota M., Sakai S., Tsuji-saka Y. Purification and characterization of two forms of maltotetraose-forming amylase from Pseudomonas stutzeri. Agricultural and Biological Chemistry. 1990;54:737-780. https://doi.org/10.1080/00021369.1990. 10870010
7. Auh J. H., Lee S. Y., Seung S. Y., Son H. J., Lee J. W., Lee S. J. A novel maltopentaose producing amylase as a bread antistaling agent. Food Science and Biotechnology. 2005;14(5):681-684.
8. Ben A. M., Mhiri S., Mezghani M., Bejar S. Purification and sequence analysis of the atypical maltohexaose-forming a-amylase of the B. stearothermophilus US100. Enzyme and Microbial Technology. 2001;28(6):537-542. https://doi.org/10.1016/S0141-0229(01) 00294-0
9. Messaoud E. B., Ben A. M., Elleuch N., Masmoudi N. F., Bejar S. Purification and properties of a maltoheptaose- and malto-
hexaose-forming amylase produced by Bacillus subtilis US116. Enzyme and Microbial Technology. 2004;34(7):662-666. https://doi. org/10.1016/j.enzmictec.2004.03.002
10. Su L., Yang Y., Wu J. Recombinant expression, characterization and application of maltotetraohydrolase from Pseudomonas sac-charophila. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2020;100(8):3456-3464. https:// doi.org/10.1002/jsfa.10381
11. Production of maltotetraose syrup using a pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase variant: U.S. patent No. 20130288309A1 / G. Duan [et al.]; publ. date 31.10.2013. 29 p.
12. Reduced sugar syrups and methods of making reduced sugar syrups: U.S. patent No. 9540668 B2 / R. Medhekar, A. J. Hoffman; publ. date 10.01.2017. 14 p.
13. A kind of preparation method of high-purity maltotetraose coproduction limit dextrin: CN patent № 109234329 A / Shandong Bailong Park Biological Polytron Technologies Inc.; publ. date 18.01.2019. 9 p.
14. Qian Y., Duan G. Maltotetraose syrup production and process optimization. Journal of Food Science and Technology. 2013;32:100-104.
15. Maltotetraohydrolase from Pseudomonas stutzeri expressed in bacillus licheniformis: Chemical and Technical Assessment (CTA) / Prepared by J. R. Srinivasan, I. Meyland. FAO JECFA Monographs 17, 2015. 7 p.
16. Lukin N. D. Technological control of the production of sugary starch products: a methodological guide / edited Lukin N. D. with the participation of Ananskih V. V., Lapidus T. V., Hvorova L. S. M.: Rossel'hozakademiya, 2007. 261 p. (In Russ.)
17. Gracheva I. M., Krivova A. Yu. Enzyme preparation technology. Third edition, revised and supplemented. Moscow: Elevar, 2000. 512 p. (In Russ.)
18. Kimura T., Nakakuki T. Maltotetraose, a new saccharide of tertiary property. Starch-Starke. 1990;42(4):151-157. https://doi. org/10.1002/star.19900420407.
19. Nakakuki T. Oligosaccharides: Production, Properties and Applications. Japanese technology reviews. Switzerland: Gordon and Breach, 1993. Vol. 3 (2). P. 175-203.
Информация об авторах
Папахин Александр Алексеевич, канд. техн. наук, Бородина Зинаида Михайловна, канд. техн. наук, Гулакова Валентина Андреевна
ВНИИ крахмалопродуктов - филиал ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН, 140051, Московская обл., г.о. Люберцы, д.п. Красково, ул. Некрасова, д. 11, papahin_aleksandr@mail.ru, borodina7292@yandex.ru, VGulakova@mail.ru
Information about the authors
Alexander A. Papakhin, Candidate of Technical Sciences, Zinaida M. Borodina, Candidate of Technical Sciences, Valentina A. Gulakova
All-Russian Scientific Research Institute for Starch Products - Branch of V. M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of RAS, 11, Nekrasova str., Kraskovo, Lyubertsi, Moscow region, 140051, papahin_aleksandr@mail.ru, borodina7292@yandex.ru, VGulakova@mail.ru
Статья поступила в редакцию . 07.09.2021; принята к публикации 18.11.2021. The article was submitted . 07.09.2021; accepted for publication 18.11.2021.
