CC BY
26
О некоторых факторах патогенности Helicobacter pylori
Х.М.Алиева, А.С.Самедов, Э.М.Агаева
Азербайджанский медицинский университет, г.Баку
В настоящее время патогенность бактерий определяется как полидетерминантный признак, который реализуется при участии многих факторов [1, 2, 7]. Роль этих факторов в становлении инфекционного процесса, а также степень их вовлечения в патогенез заболевания сейчас интенсивно исследуются с помощью различных методов.
Имеются многочисленные сообщения о способности Helicobacter pylori (НР) вести себя как сапрофит или патоген, что обусловлено, с одной стороны, его генетической трансформацией и в итоге - разнообразием его штаммов, а с другой стороны - генетическими и фенотипи-ческими особенностями конкретного человека и влиянием на него факторов окружающей среды [15, 16, 17]. В то же время, большинство существующих литературных данных свидетельствует о признании патогенной роли НР в возникновении и развитии гастродуоденальных заболеваний (ГДЗ).
По данным многих исследователей, важная роль в развитии ГДЗ принадлежит уреазной активности и токсинообразованию НР [12, 13, 18, 20]. В частности, за последние годы накопилось достаточно большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о токсиген-ных свойствах НР [4, 6, 15, 18]. Имеется также большое количество работ, в которых показано, что важным фактором патогенности НР является высокая уреазная активность, так как уреаза считается вирулентной детерминантой, опосредующей как бактериальную адгезию, так и цито-токсическое действие НР (14, 6, 22).
Несмотря на определенные успехи в борьбе с хеликобактериозными заболеваниями, научно обоснованные подходы к их диагностике, лечению и профилактике недостаточны и требуют дальнейшего разрешения. Это объясняется неполным представлением о природе патоген-ности НР.
Исходя из этого, целью нашей работы стало изучение уреазы и цитотоксина, как факторов патогенности НР, особенностей их взаимодействия и влияния на макроорганизм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Обследовано 79 человек в возрасте от 18 до 83 лет. Проведенные исследования (эзофагогастро-дуоденоскопия, морфологические, биохимические,
серологические и др) позволили разделить обследованных пациентов на пять групп:
- 1-я группа - больные язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки - 36 чел,
- 2-я группа - больные язвой желудка - 14чел,
- 3-я группа - больные гастритом - 17 чел,
- 4-я группа - больные гастродуоденитом - 7 чел,
- 5-ю группа - практически здоровые (контрольная группа) - 5 чел..
Диагноз на хеликобактериоз был поставлен на основании прицельной биопсии из 3-4 участков слизистой оболочки, эндоскопической внутриже-лудочной и дуоденальной рН-метрии с забором тощаковой порции желудочного сока, бактериологическим, морфологическим методом, уреазным тестом и определением специфических IgG к НР методом иммуноферментного анализа (ELISA).
Для выделения НР использовали эритрит-агар, сердечно-мозговой экстракт или кампило-агар с гемолизированной кровью, затем культивировали в микроаэрофильных условиях при 37°С в течение 35-7-10 сут.
Биоптат помещали в пробирку с реактивом, содержащим 6% мочевины. рН желудочного сока измеряли аппаратом "Checker by HANNA".
С целью получения цитотоксина суспензию, приготовленную из биоптата, контаминирован-ного НР, обрабатывали амфотеррицином В и поли-миксином В для подавления сопутствующей микрофлоры и центрифугировали в течение 60 мин при 6000 об/мин. Затем к надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония (1мл на 20мл жидкости), перемешивали, через 60 мин сульфат аммония удаляли. Прозрачную жидкость, не содержащую бактерий, использовали как токсин.
Цитотоксическое действие (ЦТД) определяли путем внесения стерильных фильтратов тестируемых штаммов микробов в объеме 0,2 мл в пробирку с 2-ух суточной культурой клеток Hep-2 или Hela и инкубацией в термостате при 37°С в течение 2-3 сут. Выраженность ЦТД учитывали по изменению характера монослоя в виде отслоения клеток, изменения их морфологии и наличия деструкции.
С целью изучения молекулярной однородности цитотоксина проводили гель - фильтрацию на колонке с сефадексом G - 200 (выборочно по 1 пробе из каждой группы больных). Использовали ряд буферных растворов (фосфатный, боратный и трис- буфер) с различными рН, с целью подбора оптимального режима. Режим фильтрации составлял -1 капля в 30сек. Содержание белка в токсинах и полученных фракциях до и после их диализа против по-лиэтиленгликоля определяли по О.Лоури (1951г).
Таблица. Результаты изучения цитотоксичности токсинов Helicobacter pylori, выделенных от
больных с ГДЗ
Диагноз Количество Разведения токсина Результаты заражения клеток
культур 1:8 1:16 1:32 1:64 ЦТД+ цтд-
Язва ДПК 5 1 2 1 1 5 -
Язва желудка 6 2 2 1 1 6 -
Гастриты 10 2 - - - 2 8
Гастродуодениты 4 1 - - - 1 3
Контроль 5 - - - - - 5
Примечание: «+» показывает наличие ЦТД, «-» показывает отсутствие ЦТД., цифры показывают количество штаммов, обладающих цитотоксической активностью
Цитотоксины дозировали по количеству белка в 1мл.
В дальнейших исследованиях применяли трис-НС1-буфер рН 7,4. Активность фракций вычисляли по изменению оптической плотности на спектрофотометре (СФ-16А) и выражали в условных единицах активности на 1 мг белка гомогената (19).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Результаты серологического исследования первой группы (36 чел) больных показали, что у них в крови специфические 1дО имеются в титре 3,2±0,27. У 30 из них в результате проведенных цитологических, биохимических и бактериологических исследований были обнаружены НР. У больных второй группы (14 чел) титр 1дО составлял в среднем 3,6 ±0,27, при этом НР обнаружен у всех 14-ти больных. В третьей группе (17 чел) титр 1дО составлял в среднем 2,4±0,16, а НР обнаружен у 13 больных. У больных четвертой группы (7 чел) титр 1дО в среднем составлял 2,2±0,05, и НР обнаружен у 5 больных. У представителей пятой группы (практически здоровые - 5 чел) 1дО и НР не обнаружены.
При бактериологическом исследовании из биоптатов, полученных от 62 пациентов, были выделены культуры НР и изучены их биологические свойства. При этом наилучшей питательной средой для культивирования НР оказалась среда эритрит-агар. Выделенные из биоптатов культуры НР на указанной питательной среде образовывали мелкие, круглые, блестящие колонии диаметром от 0,5-1,0 до 2 мм. В мазках, окрашенных по Граму, просматривались грамотрицательные палочки изогнутой формы. Изучение подвижности НР в темном поле микроскопа показало стремительное движение микробных клеток. Все изученные штаммы не росли в аэробных условиях и при 42°С, были каталаза- и уреаза-положитель-ными, а также устойчивыми к налидиксовой кислоте. Изучение культурально-морфологических, тинкториальных и ферментативных свойств выделенных культур позволило отнести их к виду НР.
В следующей серии опытов были изучены факторы патогенности НР, важнейшим из кото-
рых, как уже отмечалось, является продукция уреазы и токсинов. В этих исследованиях установлено, что уреаза продуцируется всеми культурами НР, выделенными от больных 1, 2, 3 и 4 групп.
Анализ секреторной и кислотообразующей функций желудка показал, что в развитии ГДЗ кислотный фактор играет существенную роль. У больных показатели желудочного кислотообра-зования варьировали по сравнению со здоровыми людьми, и эта вариабельность была обусловлена продукцией НР уреазы. Уреаза, взаимодействуя с мочевиной, разлагает ее на углекислый газ и аммиак, что в итоге приводит к изменению рН желудочного сока, а повышенная концентрация аммиака вызывает некротические повреждения слизистой оболочки желудка. Таким образом, уреаза НР оказывает прямое деструктивное влияние на слизистую оболочку желудка и участвует в патогенезе гастрита и язвенной болезни.
Так, при гастрите рН желудочного содержимого составляет 1,7±0,6 (против 2,0±0,05 в контрольной группе). При гастродуодените - 1,2±0,8, при язве ДПК - 1,4±2,0. Однако, при переходе гастрита в язву желудка, рН возрастает и составляет 2,28±2,0. Сдвиг реакции желудочного сока в щелочную сторону защищает НР от действия кислоты и способствует ее колонизации.
Таким образом, уреаза бактерий, разлагающая мочевину с выделением ионов аммония, приводит к защелачиванию микроокружения бактерий, предохраняющего ее от действия соляной кислоты желудочного сока. Наличие внеклеточной уреазы имеет большое значение для приживления НР и усиливает воспалительные реакции, стимулируя секрецию цитокинов, образование радикалов кислорода и окиси азота, что, на наш взгляд, является предрасполагающим фактором в образовании язвы желудка, гастрита, язвы двенадцатиперстной кишки и гастроду-оденита.
Нами была изучена также цитототоксичность культур НР, выделенных при различном течении НР-инфекции. Активность полученных токсинов и их фракций определяли путем титрования в культуре клеток Hela. Зараженные культуры клеток инкубировали при 37°С и ежедневно просматривали, отмечая цитотоксическое действие (ЦТД). За титр токсина принимали наивысшее его разведение, вызывающее дегенерацию в культуре клеток. Полученные данные представлены в таблице.
Как видно из таблицы, токсины, полученные из
всех 6-ти культур НР, выделенных от больных язвой желудка, обладали цитотоксическими свойствами в различных разведениях. Так, по 2 пробе были токсичны в разведениях 1:8 и 1:16 и по одной пробе - в разведениях 1:32 и 1:64. Из проб, полученных из 5-ти биоптатов больных язвой двенадцатиперстной кишки, по одной были токсичны в разведениях 1:8, 1:32 и 1:64, а две пробы - в разведении 1:16. В отличие от них, из 10 проб, полученных из биоптатов больных гастритом, только в двух случаях была обнаружена токсичность в разведении 1:8, а из 4 проб, полученных из биоптатов больных гастродуоденитом, токсичной оказалась одна в разведении 1:8. Таким образом, из 30 штаммов НР, выделенных от больных с ГДЗ, 14 были токсигенными. Токсигенные штаммы выделялись в основном при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Следующая серия исследований была посвящена изучению молекулярной однородности цитотоксина и его очистке, для чего токсины, полученные из суспензий биоптатов больных, были подвергнуты фракционированию по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Предварительно был отработан режим гель-хроматографии с использованием колонки размером 600х24 и фосфатного буфера с pH 7,4. На поверхность геля наслаивали 7мл жидкости, содержащей токсин (1мг белка в 1 мл р-ра). Скорость фильтрации составляла 1 каплю в 30 сек. Из каждой группы больных было выбрано по одной пробе цитотоксина (всего 4 пробы), которые были подвергнуты фракционированию. Результаты фракционирования представлены на рисунке 1, из которого видно, что цитотоксины элюировались двумя пиками. Полученная первая фракция после концентрирования полиэтиленг-
Рис 1. Результаты гель - фильтрации через сефадекс G-200 цитотоксина Helicobacter pylori, изолированных от больных 1, 2, 3 и 4 групп
ликолем была токсична для культур клеток Hep2 и Hela, а вторая - нетоксична, что свидетельствует об молекулярной неоднородности токсина.
Таким образом, в результате проведенных нами исследований установлено, что фактором, способствующим инвазии и колонизации HP, выделенных от наших больных, является продукция уреазы, которая расщепляет мочевину до аммиака и углекислоты, что является положительным для HP, так как образование щелочных продуктов предохраняет возбудитель от воздействия кислой среды и способствует его размножению, а длительное воздействие образующегося аммиака обусловливает некротическое повреждение слизистой оболочки желудка. Кроме того, размножение HP приводит к усилению его агрессии, так как увеличивается продукция сек-ретируемого HP цитотоксина белковой природы, ответственного за ЦТД в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, что подтверждается установленной нами корреляцией между продукцией HP токсина и развитием язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бельмер СБ, Гасилина Т.Б История открытия Helicobacter pylori РГМУ. - www.rambler. ru; 2. Бертиев Ю.Б. Токсин - опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний. - ЖМЭ-ИИ, 1987, N.3 с.86-93; 3. Галаев Ю.Б. Патогенные ферменты бактерий. - M.: Blaser, 1987, v.93, p.371-383; 4. Горячкина Ë.A, Бор-зова Е.Ю. Роль хеликобактерной инфекции в патогенезе хронической крапивницы. - Aллеpгология, 2004, N.1, c.25-26; 5. Давыдо-ва.СН, Басюра A.A, Боброва Б.И. Чувствительность клинических изолятов Helicobacter pylori и ассоциированной микрофлоры к противомикробным и противоязвенным препаратам. - Журнал микроб., 1999, N.3, с.81-82; 6. Домарадский И.Б. Бопросы пато-генности и Helicobacter pylori. www.rambler.ru; 7. Езепчук Ю.Б. Патогенность как функция биомолекул. - М., 1985; 8. Езепчук Ю.Б. Cтpyктypные свойства токсинов и молекулярный механизм взаимодействия их с эукориатической клеткой. - Бестник AMH. CCCP, 1985, N.10, с.73-78; 9. Ильченко A.A. Терапия - Язвенная
болезнь и Helicobacter pylori, проблемы диагностики и лечения. 2000, www.rambler.ru; 10. Исаков В.А, Домарадский Н.В. Хелико-бактериоз. - М.: Медпрактика, 2003, с.412; 11. Ломов С.Ю. Роль факторов патогенности в механизме хеликобактериозных поражений желудка. - ЖМЭИИ, 1997, N.6, с.108-111; 12. Рожавин М.А. Патогенные свойства Campylobakter pylori. - Клин. Микроб., 1989, N.3, с.20-24; 13. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Значение геномной гетерогенности штаммов Helicobacter pylori в развитии ассоциированной патологии гастродуоденальной зоны. - Росс. Журн. гастро-энт., 2001, N.3, с.7-11; 14. Чуков С.З., Пасечников В.Д. Особенности иммунологического ответа у Helicobacter pylori - инфицированных больных хроническим гастритом. - www.rambler.ru; 15. Червинец В.М, Бондоренко В.М, Базлов С.Н. Микрофлора слизистой оболочки ульцерозной зоны больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. - Журн. микроб., 2001, N.5, с.12-15; 16. Leunk R.D. Production of a cytotoxin by Helicobacter pylori. -Rev. Infect. Dis., 1991, v.13, p.686-689; 17. Jonson W.M., Lior H. American Society for Microbiology, 1986, p.63; 18. Leunk R.D., Jonson P.T. American Society for Microbiology, 1987, p.53; 19. Lowry O.H, Rosebrough N.J. - J. boil. Chem., 1951, v.193, p.265-275; 20. Mobley H, Fulkerson J. Expression of catalytically active urease by Helicobacter pylori. - Nasional University of Irland, 1997, p.58-66.
SUMMARY
About some factors of pathogenesity of Helicobacter pylori Kh.Aliyeva, A.Samedov, E.Agayeva
We studied some factors of pathogenicity of Helicobacter pylori (HP) and the mechanism of their action.
We studied cytotoxin s molecular uniformity. We have done the gel-chromatography of cytotoxin on Sefadex G 200 and established its heterogeneity and cytotoxicity of high-molecular fractions.
Presence of cytotoxicy genes allows to explain why HP infection in various cases is shown as a different clinical picture.
nocTynHJia 09.10.2006
Рецепторы эстрогенов у женщин, больных раком слизистой оболочки полости рта
А.Д.Алиев
Азербайджанский медицинский университет, г.Баку
В последние годы в большинстве стран мира наблюдается рост заболеваемости предопухо-левыми процессами и раком слизистой оболочки полости рта (СОПР). При этом наиболее частыми нозологическими формами предопухоле-вых процессов слизистой полости рта считаются лейкоплакия и красный плоский лишай.
Слизистая оболочка полости рта, вероятно, является мишенью для половых стероидов, в первую очередь для эстрогенов, при этом рецепторы эстрогенов (РЭ) обнаружены в клетках лейкоплакии и в клетках чешуйчатой карциномы, хотя содержание РЭ в большинстве клеток слизистой относительно невелико и данные разных авторов достаточно противоречивы.
Биосинтез эстрогенов из предшественников (4-андростендиона и тестостерона) происходит не только в стероидпродуцирующих железах внутренней секреции, но и во многих тканях организма - жировой ткани, мышцах, печени, поч-
ках, мозжечке (4). Внегонадное образование эстрогенов является основным у мужчин, а у женщин - в постменопаузе, а также у подвергшихся кастрации или при ожирении (2).
В крови ПСГ в основном находятся в виде комплексов с транспортными белками - специфическими и неспецифическими. Образование таких комплексов со специфическими белками является одним из факторов регуляции биологической активности и интенсивности обмена ПСГ (1).
В клетках-мишенях ПСГ действуют через ядерные рецепторы, причем в цитоплазме эст-радиол-17р (Э2) непосредственно связывается с РЭ.
Клинические, биохимические, цитоморфо-логические данные свидетельствуют о зависимости функционального состояния СОПР от воздействия ПСГ.
Важным подтверждением того, что СОПР и
