CC BY
5
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1989
УДК 615.285.7.099.015.4.07
А. П. Шицкова, С. Е. Демина, Е. Г. Чхвиркия О БИОЛОГИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ БОТРАНА-75В
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
В соответствии с Продовольственной программой СССР , и Комплексной программой химизации народного хозяйства страны на период до 2000 года предусматриваются производство и внедрение высокоэффективных средств защиты растений в условиях интенсификации сельскохозяйственного производства.
В наших исследованиях изучались токсические свойства и особенности биологического действия на организм фунгицида ботрана-75В (производство США) для гигиенического нормирования остаточных количеств его в продуктах питания. Препарат предназначен для применения против возбудителей грибных заболеваний растений (типа ботритис, монилия, ризопус, склеротиния), находящихся в почве, на листьях, в посевах моркови, чеснока, на плантациях черешни, персиков, а также при хранении указанных плодов. Действующим началом ботрана-75В является 2,6-дихлор-4-нитроанилин, который составляет 75% препарата, остальное — пассивный компонент. Препарат практически нерастворим в воде и слабо растворим в большинстве органических растворителей, устойчив к гидролизу и относительно устойчив к окислению, не испаряется.
Сведения о характере действия ботрана на животный организм в литературе немногочисленны. Проявления токсического действия препарата отечественного производства сходны с таковыми нитроанилинов, оказывающих политропное действие с преимущественным влиянием на красную кровь, функциональное состояние паренхиматозных органов и нервной системы. В отличие от хлорнитроанилинов ботран сильнее поражает печень, вызывая дистрофические изменения, а также кровь, что проявляется в снижении уровня гемоглобина, числа эритроцитов, повышении содержания метгемоглобина и появлении телец Гейнца. ЬО50 для теплокровных животных колеблется в зависимости от вида животного от 2,5 до 7,8 г/кг [1, 2]. Изменения в печени при поступлении в организм животных больших доз ботрана отмечались также зарубежными авторами [4]. Эти данные были приняты нами во вни-
мание при выборе показателей состояния органов и систем для оценки действия испытуемого фунгицида на организм животного.
В соответствии с методической схемой были выполнены острые, подострые, краткосрочные и хронические эксперименты. Поскольку ботран-^ 75В не вызывал летальных исходов у крыс в острых опытах, кумулятивные свойстза препарата определяли по тесту субхронической токсичности на мышах-самцах [5]. Действие больших доз пестицида на крысах было изучено в 2-месячном подостром эксперименте. Крысы-самцы (24 животных) получали препарат перорально ежедневно натощак в виде масляных растворов (подсолнечное масло) в дозах 1000, 500 и 200 мг/кг.
Перед постановкой хронического эксперимента была проведена проверка предполагаемых пороговой (4,4 мг/кг) и неэффективной (0,22 мг/кг) доз хронического действия пестицида, полученных расчетным методом, в краткосрочном одно^ месячном эксперименте по схеме, разработанной1 С. М. Павленко и соавт. [3]. Учитывая имеющиеся в литературе указания на высокую чувствительность микросомальной монооксигеназной системы печени к воздействию пестицидов, мы сочли целесообразным провести в условиях краткосрочного эксперимента также оценку состояния данной системы с помощью амидопириновой нагрузки по мочевой экскреции продуктов демети-лирования и ацетилирования амидопирина. Последний вводили животным внутрибрюшинно в виде 4 % раствора из расчета 2 мг амидопирина на 100 г массы животного. Мочу собирали через 6 и 24 ч после нагрузки.
Влияние бортана-75В на организм при дл^ тельном пероральном поступлении исследовали Щ. условиях 6-месячного хронического эксперимента на 80 белых крысах-самцах, которые были разделены на 4 группы (одна из них служила контролем) и получали масляный раствор препарата в дозах 0,22, 4,4 и 88 мг/кг. В ходе хронического эксперимента изучали общетоксическое действие препарата (динамика массы тела, суммационно-пороговый показатель, работоспособность, коли-
чество гемоглобина, метгемоглобина, число эритроцитов, лейкоцитов, содержание гистамина, натрия, калия в крови). Кроме того, для оценки со-, стояния биомембран при действии ботрана-75В определяли активность ферментов: К+, Ыа+-АТФ-азы и Л^2+-АТФазы в эритроцитах; кислых фос-фатазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, а ^ также гистидазы, аспарагиновой и аланиновой аминотрансфераз в сыворотке крови и холинэсте-разы крови. По окончании эксперимента в гомо-генатах печени животных определяли общую активность ферментов гистидазы, аминотрасфераз, цитохромоксидазы, кислых фосфатазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, а также неседи-ментируемую активность этих ферментов.
Результаты всех экспериментальных исследований обработаны статистическим методом малой выборки по Е. Л. Ноткину и Р. Н. Бирюковой.
Проведенные исследования показали, что препарат является малотоксичным пестицидом: ЬОбо для мышей-самок 8400±470 мг/кг, для мышей-* самцов 4490±470 мг/кг. Клиническая картина острого отравления животных ботраном-75В характеризовалась кратковременным возбуждением, нарушением координации движений, судорогами, неопрятностью, боковым положением. Коэффициент кумуляции, рассчитанный по тесту субхронической токсичности, равен 3,93 к указывает, что препарат обладает умеренно выраженными кумулятивными свойствами.
При действии ботрана-75В в условиях подост-рого эксперимента у крыс наблюдались изменения некоторых гематологических (повышение уровня метгемоглобина, уменьшение количества гемоглобина, числа эритроцитов) и биохимических (увеличение активности холинэстеразы, ^ аминотрансфераз) показателей крови. Отмечена ^ зависимость выраженности метгемоглобинемии от количества (дозы) поступившего в организм препарата. Уровень метгемоглобина в крови животных, получавших ежедневно ботран-75В в дозах 1000, 500 и 200 мг/кг, через 2 мес эксперимента достигал соответственно 15,2±1,1 % (р<0,01), 11,9+1,1% (р<0,01) и 6,4±1,2 % (/>.<0,05) при 4,7±0,3 % в контроле.
Хроническое шестимесячное поступление препарата в организм подопытных крыс не вызывало существенных отклонений в поведении, внешнем виде, массе тела и работоспособности животных, а также изменений величины суммационно-порогового показателя. Однако при изучении состояния метаболических процессов был выявлен 'ряд изменений, находившихся в зависимости от дозы вводимого пестицида.
Наиболее отчетливыми были изменения при действии дозы 88 мг/кг, они выражались в повышении в крови крыс активности органоспеци-фического фермента печени гистидазы на протяжении всего опыта, а также кислых фосфатазы, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, аспарагиновой аминотрансферазы и холинэстеразы в раз-
%
&ю 620 ЗбО 340 160 140 120 100 во 60 40 20
К
1234 5676
/2345676
. / 2345676
Рис. 1. Биохимические показатели сыворотки крови крыс при действии ботрана-75В в хроническом эксперименте через 1 мес воздействия в дозах 0,22 мг/кг (/), 4,4 мг/кг (//) и 88 мг/кг (III).
Здесь и на рис. 2: / — аланиновая аминотрансфераза; 2 — аспара-гнновая аминотрансфераза; 3 — холинэстераза; 4 — гнстидаза; 5 — кислая фосфатаза: 6 — кислая РНКаза; 7 —кислая ДнКаза; 8 — К+, Ыа+-АТФаза; К — контроль. * — различия по сравнению с контролем статистически достоверны.
личные сроки эксперимента и угнетении активности аланиновой аминотрасферазы. В течение 3 мес от начала эсперимента в крови животных наблюдалось умеренное повышение уровня метгемоглобина (не более 9,3±0,36 %; р<0,05) и уменьшение числа эритроцитов (на 0,5—1,1 млн; р<0,05), не выходившее за пределы физиологических колебаний. В этот же период (со 2-го по 4-й месяц) наблюдений было отмечено снижение активности К+, Ма+-АТФазы эритроцитов (на 47% по сравнению с контролем; р<0.01) —показателя функционального состояния мембраны эритроцитов. К моменту окончания эксперимента (через 6 мес) наиболее существенными изменениями в крови были повышение активности гистидазы, кислой рибонуклеазы, холинэстеразы и
%
480 460 440
180 -160 140У 120 ЮО
во 60 40 20
К
Ж
/234 567 в
12345678
1234 567 8
Рис. 2. Биохимические показатели сыворотки крови крыс при действии ботрана-75В в хроническом эксперименте через 6 мес воздействия в дозах 0,22 мг/кг (/), 4,4 мг/кг (II), 88 мг/кг (III).
%
2Ю 2DO 1вО 160 J40 1ZO
too во 60 40 20
.К
Рис. 3. Мочевая экскреция продуктов биотрансформа-цин амидопирина при дейст-I • вии ботрана-75В в кратко-* срочном эксперименте через Я 30 дней воздействия в до-" зах 0,22 мг/кг (/) и 4,4 мг/кг (//). К — контроль.
еч
24ч
угнетение активности аланиновой аминотрансфе-разы (р<0,01; >2 о). Отмеченные в этот срок достоверные изменения активности кислых фос-фатазы и дезоксирибонуклеазы сыворотки крови не выходили за пределы физиологических границ (рис. 1 и 2).
При поступлении в организм животных ботра-на-75В в дозе 4,4 мг/кг количественные изменения ферментного спектра крови выражались в однократном на протяжении эксперимента повышении активности холинэстеразы (через 3 мес) на 30% по сравнению с контролем (р<<0,01), аспа-рагиновой аминотрансферазы (через 5 мес) на 75% (р<0,01), а также в многократном повышении активности гистидазы в сыворотке крови. В конце эксперимента в крови животных, получавших ботран-75В в указанной дозе, изменения, выходившие за пределы физиологических колебаний (>2а), были зафиксированы по трем показателям: обнаружено повышение активности гистидазы и кислой рибонуклеазы (^<0,01) и снижение активности аланиновой аминотрансферазы (р<0,01).
В гомогенатах печени подопытных крыс после 6-месячного воздействия фунгицида наблюдалось только достоверное снижение активности гистидазы.
Учитывая характер выявленных изменений, можно полагать, что причиной повышения в крови активности исследованных ферментов при поступлении пестицида в организм животных служили в первую очередь нарушения проницаемости плазматической мембраны гепатоцитов, а также плазматических мембран клеток других органов.
Необходимо отметить, что после восстановительного периода, продолжительность которого равнялась 1 мес, ранее отмеченные изменения не были обнаружены.
У животных, полчавших ежедневно 0,22 мг/кг ботрана-75В, существенные отклонения изучавшихся показателей на протяжении всего эксперимента не выявлены.
Изучение активности гидроксилирующей мо-нооксигеназной системы печени в условиях крат-
косрочного эксперимента, когда животные получали ежедневно фунгицид в дозах 0,22 и 4,4 мг/кг, показало, что ботран-75В ускорял по сравнению с контролем превращение амидопирина в организме крыс, стимулируя процессы де-метилирования и ацетилирования (рис. 3). Это свидетельствует об усилении процессов обезвреживания (детоксикации) в печени, что в известной мере можно, по-видимому, рассматривать как положительное явление, если учесть способность более высоких доз ботрана (10 мг/кг и выше) снижать функции микросомальных оксидаз печени [6].
Согласно результатам электронно-микроскопического исследования ультраструктурной организации клеток миокарда и его микроциркулятор-ного русла, препарат не обладает кардиотокси-ческими свойствами (исследования проведены М. В. ВендИло).
Морфологический анализ состояния внутренних органов животных не выявил выраженных патологических изменений при хроническом поступлении ботрана-75В в дозах 88, 4,4 и 0,22 мг/кг (исследования проведены Е. Н. Зайцевой).
На основании результатов выполненных исследований мы сочли возможным считать, что доза ботрана-75В, равная 4,4 мг/кг, является пороговой, а доза 0,22 мг/кг — неэффективной при хроническом воздействии. Полученные материалы использованы для обоснования гигиенического норматива ботрана-75В в продуктах питания. При этом необходимо отметить, что зыявленная стимуляция процессов биотрансформации амидопирина данными дозами препарата была учтена при выборе коэффициента запаса для расчета максимально допустимого уровня. ^
Таким образом, ботран-75В относится к малотоксичным соединениям, обладает умеренно выраженной кумуляцией (Ккум 3,93). При длительном поступлении в организм препарат вызывает изменение некоторых гематологических показателей, влияет на проницаемость и функциональное состояние биомембран и внутриклеточных структур, а также ферментативные процессы. Наблюдается снижение стабильности плазматической мембраны гепатоцитов.
Литература
1. Вредные вещества в промышленности. — Л., 1976. — Т. 2. — С. 303—307. if
2. Смосарь М. П., Звездай В. И., Колодуб Ф. А. // Гиг. и* сан. — 1972. — № 4. — С. 35—37.
3. Установление ориентировочных пороговых уровней веществ неэлектролитов при разных путях поступления в организм: Метод, рекомендации / Павленко С. М., Юдина Т. В., Гусева В. А. и др. —М„ 1978.
4. Johnston С. D., Woodard ]., Cronin M. Т. /.//Toxicol, appl. Pharmacol.— 1968,— Vol. 12, — P. 314—315.
5. Lim R. К-, Rink К. G., Glass H. G., Soaje-Schague Е.Ц Arch, int, Pharmacodyn. — 1961,— Vol. 130. — P. 336.
6. Mate Colleen, Ryan A. I., Wright S. E. // Food Gosme-tic. Toxicol. — 1967,— Vol. 5, P. 657.
Поступила 18:04.88
Summary. Study results on acute and chronic toxicity
allowed us to attribute bortran-75B fungicide to low-toxic compounds with moderately expressed cumulation. Under long-term pesticide exposure changes in,,-activity of a number of blood enzymes were noted. Its threshold and non-active doses were determined.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1989
УДК 616.419-018.1-092:575.224.231-092.9-02:613.31:546.761-07
И. Р. Гольдина, С. П. Сайченко, В. Г. Надеенко, О. 3. Дьяченко
ИЗМЕНЕНИЕ ЧАСТОТЫ СЕСТРИНСКИХ ХРОМАТИДНЫХ ОБМЕНОВ И ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИИ В КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ, ПОЛУЧАВШИХ ХРОМ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ
Свердловский НИИ гигиены труда и профзаболеваний
Особенности изменения генетических процессов в клетках животных и человека при воздействии хрома представляют большой научный интерес. К настоящему времени уже показано, что этот довольно широко распространенный в окружающей среде металл, поступая в организм с питьевой водой, атмосферным воздухом или пищей, способен вызывать мутагенные и канцерогенные эффекты [1, 3].
Для оценки генетического эффекта хрома в эксперименте и натурных исследованиях использовали различные тесты: учет частоты хромосомных аберраций (ХА), доминантных летальных мутаций, репаративный синтез ДНК [1, 3—5]. При этом показано, что результаты, полученные в этих тестах, позволяют отнести хром к числу слабых мутагенов, проявляющих генотоксический эффект в токсичных дозах. Вместе с тем характер неблагоприятного действия хрома на организм ^диктует необходимость дальнейшего изучения ^ его биологических эффектов, в частности влияния на генетический аппарат клеток.
В свете существующего представления тест частоты ХА регистрирует эффект сильных мутагенов, в связи с этим влияние металлов на генетический аппарат клеток, в том числе хрома, выявляется преимущественно при воздействии на экспериментальных животных их токсичных доз. В последние годы з генетике стал широко использоваться тест учета частоты сестринских хрома-тидных обменов (СХО). В отличие от ХА СХО совместим с выживанием клетки, а не с ее гибелью [10], и при генетической оценке ряда химических веществ этот показатель оказался бо-^лее чувствительным, чем учет изменения частоты ТХА.
Настоящие исследования предусматривали изучение изменения частоты СХО и ХА в клетках костного мозга мышей, получавших хром с питьевой водой.
В эксперименте использовали белых беспородных мышей с исходной массой 20—25 г, которые в течение 6 мес получали питьевую воду, содер-
жащую ионы Сг6+. Шестивалентный хром вводили в питьевую воду в виде бихромата калия в концентрациях, соответствующих дозам металла 0,0025, 0,05 и 0,5 мг на 1 кг массы животного в сутки. Минимальная из изученных доз была на уровне принятой в настоящее время предельно допустимой концентрации. Контрольная группа животных получала дехлорированную водопроводную воду.
Для изучения СХО животным по окончании затравки имплантировали под кожу 5-бромдезок-сиуридин в виде таблеток по 50 мг на 24 ч. Колхицин в дозе 1 мг на 1 кг массы вводили за 2 ч до забоя, после чего общепринятым методом [8] готовили препараты метафазных хромосом клеток костного мозга.
Хромосомы для анализа СХО окрашивали по модифицированному методу А. Н. Чеботарева и соавт. [7]. СХО анализировали в метафазах второго деления, в которых все хромосомы уже достигли определенного расхождения хроматид, но не более чем под углом 45°. При анализе препаратов замечено, что в метафазах, находящихся на «ранних» и «поздних» стадиях расхождения и конденсации хромосом, средняя частота СХО различна. В связи с этим отбор метафаз по указанному признаку требовался для стандартизации условий анализа препаратов. Выявленные обмены разделяли на терминальные (в дисталь-ной половине хроматид), околоцентромерные (в верхней трети) и интеркалярные (двухразрыв-ные) [6].
В число ХА включали геномные нарушения (гипер- и полиплоидии), а также все структурные нарушения хроматидного и хромосомного типа, за исключением «пробелов». При наличии в клетках двух и более независимых друг от друга нарушений их относили к группе «множественные нарушения».
Результаты исследований подвергали статистической обработке, рекомендованной в специальных руководствах [2, 6].
Исследованиями установлено, что поступление
