CC BY
4
УДК 613.2:615.285.7|-07
А. П. Шицкова, С. М. Павленко, В. А. Гусева, С. Е. Демина, Т. В. Юдина
МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ ПЕСТИЦИДОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
В настоящее время в связи с интенсификацией народного хозяйства страны требуется оперативное внедрение новых эффективных химических средств защиты растений, в то же время сроки выполнения работ по установлению гигиенических нормативов, согласно принятым методическим рекомендациям, достаточно длительны (один норматив в среднем разрабатывается 2 года). Поэтому перед гигиенистами страны стоит ответственная задача по разработке надежных способов ускоренного определения гигиенических регламентов для новых соединений.
Одно из важнейших мест в комплексе исследований при гигиенической оценке пестицидов занимает хронический эксперимент, результаты которого имеют существенное значение и при обосновании МДУ остаточных количеств ядохимикатов в продуктах питания. Однако довольно значительная продолжительность хронического эксперимента, составляющая 10—12 мес, сказывается на сроках выполнения всей работы.
В Московском НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана была поставлена задача изучить возможность ускорения исследований по гигиеническому нормированию пестицидов в пищевых продуктах. Основными направлениями исследований являлись разработка способа ускоренного определения ориентировочных пороговых и недействующих уровней длительного перорального воздействия пестицидов с целью более точного выбора доз для хронического эксперимента и установления ориентировочных нормативов, а также изучение возможности сокращения длительности хронических 12-месячных экспериментов при разработке МДУ остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах.
Отличительная особенность разработок по первому направлению состоит в органическом сочетании расчетных методов математического моделирования с краткосрочным биологическим экспериментом на животных, что позволяет определять пороги длительного токсического действия пестицидов в достаточно короткие сроки (7— 8 мес от начала острых опытов).
Математическое моделирование успешно зарекомендовало себя, поскольку оно дает практический эффект в различных областях гигиенической науки. Позволяя обнаружить общие черты и закономерности в различных конкретных явлениях, математический метод способствует решению вопросов гигиенической регламентации пестицидов. В настоящее время такой подход дал возможность ускорить установление ориентировочных значений пороговых и подпороговых доз пестицидов различной химической природы по физико-химическим параметрам, показателям острой и подострой токсичности [9]. Вместе с тем следует отметить, что полученные расчетным путем пороговые и неэффективные дозы пестицидов, являющихся, как правило, сложными химическими соединениями, могут определить лишь порядок данных величин, отличающихся от экспериментально установленных в 5—10 раз. Поэтому для корректировки расчетных доз необходимо проведение биологического эксперимента. Для этой цели в институте разработана схема краткосрочного токсикологического эксперимента. Теоретической основой создания модели такого эксперимента явились работы, показавшие, что ранним признаком интоксикации служит напряжение защитных механизмов. Для выявления данного состояния в экспериментальных условиях отобран комплекс методов, позволяющий оценить биологическую реакцию организма животных на различных структурно-функциональных уровнях: организмепном (системном), органном, клеточном и субклеточном. Изменения на системном уровне (в нервной системе) выражаются суммационно-пороговым показателем при аноди-зации головного мозга и показателями поведенческих реакций животных. Проницаемость гисто-гематических барьеров клеток внутренних органов и желез служит показателем их функционального состояния и в определенной мере характеризует защитно-приспособительные реакции организма. Сорбционные свойства протоплазмы клеток внутренних органов и желез внут-
ренней секреции позволяют судить о ее физико-химическом состоянии [7, 12]. - Результаты исследования функционального состояния организма подопытных животных по всем перечисленным показателям в экспериментально определенные «критические» сроки [10] дают возможность прогнозировать степень влияния на организм расчетных (ориентировочных) действующих, пороговых и недействующих доз пестицидов. Анализ показателей, полученных с помощью предложенных методов исследования в «критические» сроки, позволил оценить состояние некоторых регуляторных систем организма и выявить действующую' дозу полихома на уровне 10 мг/кг, пороговую— 1 мг/кг и недействующую— 0,1 мг/кг, тогда как расчетная недействующая доза соответствовала величине 1 мг/кг (т. е. на порядок выше).
Многие новые пестициды часто являются представителями мало изученных в токсикологическом отношении классов соединений, и поэтому для повышения надежности разрабатываемых ги-^ гиенических нормативов проводятся длительные ^ хронические эксперименты. При разработке нормативов остаточных количеств пестицидов в продуктах питания (МДУ) длительность хронического эксперимента принята равной 12 мес. Опыт нашей работы показывает, что в данном случае для выявления порога хронического действия можно ограничиться 6-месячным экспериментом. При этом наряду с исследованием показателей общетоксического и специфического действия пестицидов особое внимание следует уделять изучению действия пестицидов на биологические мембраны организма, изменение функционального состояния которых при действии ксенобиотиков может привести к дезорганизации ферментативных процессов в клетке, снижению, а в ряде случаев к утрате внутриклеточными органеллами способности выполнять биоэнергетическую и защитную функции, регуляцию содержания стероидов в тканях, детоксикацию ксенобиотиков и др.
Щ [5].
Для оценки стабильности мембраны и выявления ее ранних изменений применяется дифференцированное определение общей и неседименти-руемой (неосаждаемой) активности индикаторных (маркерных) ферментов лизосом (кислой фосфатазы, кислых РНКазы и ДНКазы), митохондрий (цитохромоксидазы) печени. Состояние проницаемости плазматической мембраны гепа-тоцитов определяли с помощью гистидазного теста в сыворотке крови.
Большое значение при оценке порога вредного действия пестицидов мы придавали также исследованию активности оксидаз смешанной функции (ОСФ), локализованных на эндоплазматиче-ском ретикулуме клеток печени и осуществляющих детоксикацию ксенобиотиков. Наблюдаемое при действии пестицидов в зависимости от химической природы препарата повышение или угне-
тение активности микросомальных оксигеназ рассматривается как ранний, предшествующий другим проявлениям патологии гепатобилиарной системы биохимический показатель реакции организма на неблагоприятное воздействие. Это соответствует положениям ряда авторов [2—4] и свидетельствует о значимости изучения состояния активности ОСФ при решении вопросов ускоренного гигиенического нормирования. Оценка активности гидроксилирующей монооксигеназ-ной системы в наших исследованиях проводилась по мочевой экскреции метаболитов амидопирина [8].
Наряду с указанными определяли ряд других показателей, позволяющих разносторонне оценить состояние различных функциональных систем организма и выявить возможные специфические воздействия пестицидов (кардиотоксическое, атерогенное, гетерогенное). При этом необходимо отметить, что при выборе методов исследования мы стремились не перегружать эксперимент излишним объемом тестов, используя преимущественно наиболее информативные, не требующие дефицитных реактивов и доступные для выполнения в лабораториях, оснащенных аппаратурой отечественного производства.
Известно, что обоснование гигиенических нормативов для новых соединений требует обязательного учета их возможного влияния на развитие бластомогенных и генетических заболеваний. По-
Таблица 1
Характер действия сумилекса, ромуцида, ботрана на уровне надпороговых доз в хроническом эксперименте
Показатели Пестициды
сумнлскс ромуцнд ботрзн
Гематологические _ _ \ 1
Ферменты крови: 1 ! \ 111 1 ! \
гистидаза
кислая фосфатаза + + 11 \ +
кислая РНКаза + 1 I
кислая ДНКаза + | 11
К+, № + -АТФаза эритро-
цитов 4 4 4 — 4 {
аланинаминотрансфераза I 1 1 — 4
аспа ртатам и нот рансфераза 1 \ 1 11
холинэстераза 4 4 1 11
Ферменты печени
Общая активность: 1
гистидаза — —
цитохромоксидаза 1 1
ДНКаза — — 4
Неседнментнруемая актив-
ность:
кислая фосфатаза \ + —
кислая РНКаза 1 1 1
кислая ДНКаза |
цитохромоксидаза 1 — !
Активность ОСФ 4 4 4 I
Иммунологические 1 + 4 4
Физиологические 4~4 4 4
Примечание. | достоверное увеличение (р < 0,05); | достоверное уменьшение (р < 0,05).
Таблица 2
Некоторые показатели общетоксического действия ацетохло-ра в хроническом 12-месячном эксперименте при дозе 0,8 мг/кг
Показатель Сроки воздействия, мес
1 - 6 7 — 12
Метгемоглобин ± + +
Пировиноградная кислота (С) ±
Молочная кислота (С) ±
Сахар крови ±
Фосфолипнды ± +
Триглицериды +
Натрий сыворотки крови + ±
Натрий эритроцитов
Калий сыворотки крови
Калий эритроцитов
Гистидаза ± + +
Холинэстераза ±
Аланинаминотрансфераза
Аспартатаминотрансфераза + +
АТФаза эритроцитов
Пероксидаза
Цитохро.чоксидаза
Сукцинатдегидрогеназа
Комплемент +
Лизоцнм
Т-лимфоциты +
РС АЛ +
Примечание. + достоверные изменения (р < 0,05); ± тенденция; С — сердечная мышца.
этому параллельно с хроническим экспериментом выполняли скрининговые исследования по изучению онкогенного, гонадо-, эмбрнотоксиче-ского и тератогенного влияния исследуемых соединений [1,6, 11].
Указанные выше методические приемы были использованы в экспериментальных исследованиях при изучении действия 8 пестицидов (нитро-хлор, изофос-3, дианат, полихом, ацетохлор, су-милекс, ромуцид, ботран), принадлежащих к различным классам химических соединений. В ходе этих работ наряду с указанными выше методическими приемами в сравнительном плане использовали комплекс других методов исследования: физиологических, иммунологических, па-томорфологических (в том числе гистохимические и электронно-микроскопические), что показано в табл. 1 на примере изучения действия пестицидов сумилекса, ромуцида и ботрана. Это позволило не только выявить общетоксическое действие, но и изучить отдельные стороны специфического действия изучаемых пестицидов, в частности определить кардио- и гепатотоксическое, мутагенное, онкогенное и аллергенное влияние. Анализ полученного материала дал возможность установить, что основные признаки интоксикации формируются к 6-му месяцу воздействия. К этому сроку достаточно четко могут быть определены пороговые и недействующие дозы токсического агента. Проведение дальнейших исследований (до 12 мес), как правило, не вносит су-
'Габлица 3
Величины ПД и МИД (в мг/кг) пестицидов, полученные различными способами
По результатам По результатам
краткосрочного хронического
Препарат опыта опыта
ПД МИД ПД МИД МД МИД
Нитрохлор 22,4 2,24 22,4 2,24 22,4 2,24
Изофос-3 4,0 1,0 4 0,4 4 0,25
Дианат 4,4 0,44 4,4 0,44 4,4 0.44
Полихом 10,0 1,0 1,0 0,1 — —
Ацетохлор 8,0 0,8 0,8 0,08 0,8 0,08
Омнлекс 14 1,4 1,4 0,14 1,4 0,14
Ромуцид 2,0 0,2 2,0 0,1 2,0 0,1
Ботран 4.4 0.22 4,4 0,22 4,4 0,22
щественных коррективов в результаты, полученные в течение первых 6 мес эксперимента. По-видимому, развитие в организме животных компенсаторно-приспособительных реакций несколько сглаживает картину интоксикации в период после 6 мес эксперимента и делает ее менее выраженной. Обобщенные результаты исследова ний с 1-го по 6-й и с 7-го по 12-й месяцы показаны на примере ацетохлора в табл. 2. Полученные материалы свидетельствуют о том, что традиционный хронический эксперимент продолжительностью в 12 мес для определения пороговых и недействующих доз пестицидов при установлении МДУ их остаточных количеств в продуктах питания может быть ограничен 6 мес исследования.
Ориентировочные величины пороговых и недействующих доз изучаемых пестицидов, выявленные расчетными методами и откорректированные в краткосрочном эксперименте, совпали с результатами длительных 6-месячных опытов (табл. 3). Это показывает достаточно высокую чувствительность разработанного подхода к ускоренному гигиеническому нормированию для пестицидов различных классов.
Применение изложенных подходов позволяет уже в течение первого года работы рекомендовать ориентировочные значения гигиенических нормативов пестицидов в продуктах питания, приближающиеся к установленным в хроническом эксперименте. Это способствует ускоренному решению вопроса о включении нового пестицида в план государственных испытаний. Сокращение общей продолжительности исследования по разработке норматива по полной схеме составляет примерно 35 % и дает определенный экономический эффект.
Литература
1. Иванов 10. В., Доброславская Т. Л.//Гиг. и сан.— 1979, —№ 2, —С. 19—24.
2. Каган Ю. С. // Проблемы гигиены и токсикологии пестицидов,— М„ 1981. —Ч. 2, —С. 3—8.
3. Кузьминская У. А. //Там же. — С. 14—19.
4. Леоненко О. Б., Каскевич J1. И. // Врач. дело. — 1983, —№ 2, —С. 103—105.
5. Меркурьева Р. В. //Вопр. мед. химии.— 1982.— № 2.— С. 35—39.
6. Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования: Метод, рекомендации.— М., 1978.
7. Павленко С. М„ Юдина Т. В., Гусева В. А. //Гиг. и сан. — 1975. — № 10. — С. 55—60.
8. Попов' Т. А., Леоненко О. В. //Там же.— 1977. — № 9. — С. 56—59.
9. Применение математических методов для оценки и прогнозирования реальной опасности накопления пестицидов во внешней среде и организме.— Киев, 1978.
10. Установление ориентировочных пороговых уровней веществ — неэлектролитов при разных путях поступления в организм: Метод, рекомендации: Павленко С. М., Юдина Т. В., Гусева В. А. и др. —М„ 1978.
11. Шицкова А. /7.//Вести. АМН СССР. — 1984. —. № 4. — С. 90—94.
12. Шицкова А. П.. Павленко С. М., Юдина Т. В. и др.// Актуальные вопросы токсикологии в гигиенических исследованиях,— М., 1978, —С. 2—12.
Поступила М.04.88
Summary. On the basis of a significant amount of experimental studies of toxic effect of pesticides attributed to different groups of chemical substances a rapid calculating and experimental technique for hygienic standardization of pesticide content in foodstuffs has been set forth. The proposed technique enables one to define quickly and safely the threshold and inert pesticide doses and to reduce general duration of toxicologic experiments by 35 %.
УДК 613.632-07+6!5.9.0!5.12.015.3.071519.24
В. H. Павлов
УРАВНЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ДОЗА- ВРЕМЯ —ЭФФЕКТ ДЛЯ СЛУЧАЯ ОДНОКРАТНОГО ПОСТУПЛЕНИЯ КСЕНОБИОТИКА
В ОРГАНИЗМ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Ранее нами [2, 3, 5] было получено уравнение зависимости концентрация — время — эффект для случая непрерывного поступления ксенобиотика на постоянном уровне. В случае однократного перорального (внутривенного, подкожного и т. д.) поступления ксенобиотика в организм необходимо учитывать изменение концентрации ксенобиотика в критическом органе с течением времени. Полное описание этого процесса весьма сложно [6], однако возможно в терминах токси-кокинетики [1,6].
В настоящей работе получено уравнение зависимости доза — время — эффект в предположении одного компартмента (одночастевая модель). Для этого случая известна зависимость изменения концентрации ксенобиотика в критическом органе (X) от дозы и времени [1]:
[Х]=-
D%1
%ь — X)
(e-*/'_e-V),
(О
сичного метаболита, пренебрежительно мала, получим с учетом уравнения (I) после интегрирования при начальных условиях ¿ = 0. Р = Р0 и последующего логарифмирования
In (I — Е/а) =
I
DkXf
Xb — Xf
%ье
V
\ Хъ xt )
И
С.2)
где О — доза; х/. Хь — константы скоростей поступления и выведения ксенобиотика соответственно; /— время от момента введения ксенобиотика.
Такая зависимость справедлива для вещества, которое достаточно хорошо растворимо в тканях организма, т. е. имеет достаточно высокий коэффициент распределения организм/среда, в противном случае необходимо учитывать предел насыщения по данному ксенобиотику в критическом органе.
Используя закономерности химической и биологической кинетики, на основе разработанного метода [2—5], а также исходя из предположения, что скорость метаболической реакции «дезактивации», приводящей к образованию неток-
где к, а — константы, учитывающие специфичность рецептора и скорость. Проверка уравнения (2) с использованием правила размерности, а также с учетом начальных условий показывает его корректность. В самом деле, если /=0, то экспоненциальные члены уравнения превращаются в единицу, а второй член в квадратных скобках становится равным первому члену в квадратных скобках; разность этих членов равна нулю, т. е. правая часть уравнения (2) обращается в нуль, что возможно лишь при Е=0. Также и при 0=0 правая часть уравнения обращается в нуль.
Проанализируем это уравнение. Если время достаточно велико, т. е. при »-оо, то второй член в квадратных скобках стремится к нулю и при дальнейшем увеличении времени наблюдения после введения ксенобиотика в организм становится величиной пренебрежительно малой по сравнению с первым членом в квадратных скобках. Другими словами, кривая зависимости эффекта (выраженного в виде функции 1 п (1—Е/а) от времени будет представлять кривую, асимптотически приближающуюся к пределу. Этот предел можно вычислить. В самом деле, уравнение (2) после исчезновения правого члена в квадратных скобках при /-»-оо можно преобразовать в
