CC BY
164
© В. С. зотов1, Н. В. Пунина12, С. А. Хапчаева1, С. В. Дидович3, Т. Н. Мельничук3, А. Ф. Топунов1
1 ФГБУ науки Институт биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук, Москва, Россия; 2 ФГБУ Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, Россия; 3 Институт сельского хозяйства Крыма НААН Украины, Симферополь, АР Крым
Ш Предложен новый таксономический маркер (Ып-регион), позволяющий изучать разнообразие представителей рода Rhizobium на уровне вида — группы штаммов. С его помощью были выделены группы штаммов Rhizobium, которые невозможно было детектировать другими методами, что коррелировало с эволюционной близостью бактерий. Разработанный подход к созданию маркерных систем позволяет эффективно описывать внутри- и межвидовое генетическое разнообразие клубеньковых бактерий и давать их оценку на перспективность использования в сельскохозяйственной практике. С помощью предложенной маркерной системы описаны изоляты бактерий рода Rhizobium, выделенные из различных эколого - географических зон Украины.
Ш Ключевые слова: Rhizobium; филогения; таксономия; детекция; разнообразие; saAFLP; Ып-регион ПЦР; ПЦР-RFLP; 16S рибосомальная РНК; 16S-23S рибосомальная РНК
Поступила в редакцию 29.11.2011 Принята к публикации 05.06.2012
УДК 575.17:582.632.1:630*81 1.6
новый таксономический маркер клубеньковых бактерий рода йн^овшм и его эволюция
Известно, что клубеньковые бактерии разделяют на две большие группы — быстро- и медленнорастущие, отличающиеся по скорости роста, характеру метаболизма углеводов и азотистых соединений (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002), специфичности взаимодействия с различными бобовыми культурами (широ-ко-и узкоспецифичные) (Martínez-Romero, Caballero-Mellado, 1996).
В настоящее время, как правило, таксономию и эволюционные взаимоотношения порядка Rhizobiales изучают с помощью сравнения нуклеотид-ных последовательностей гена 16S рРНК. Однако такая оценка не всегда соответствует данным, полученным по другим локусам (Gaunt et al., 2001). Вследствие частых межвидовых рекомбинаций между различными аллелями таксономически важных генов (таких как 16S рРНК, dnaK, nod), не всегда удается адекватно классифицировать изоляты ризобий, что приводит к необходимости получения дополнительных генетических данных (Suominen et al., 2001; Eardly et al., 2005; Vinuesa et al., 2008). Особый интерес в качестве модельного объекта данного порядка представляет род Rhizobium (Frank, 1889), имеющий сложную таксономическую структуру, которую сложно изучать существующими в настоящее время методами.
Целью исследований являлась разработка специфических для клубеньковых бактерий рода Rhizobium генетических маркерных систем, позволяющих изучать их на уровне вида — группы штаммов.
С целью создания быстрого, дешевого и достоверного способа детекции и изучения биоразнообразия популяционной структуры клубеньковых бактерий нами были предложены методы: saAFLP (Zotov et al., 2010) и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей hin-региона (Зотов с соавт., 2011).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы. В работе были использованы 52 изолята клубеньковых бактерий рода Rhizobium из коллекций полезных микроорганизмов различных научных учреждений Украины и России: Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины (ИСХК НААН), г. Симферополь; Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства Национальной академии аграрных наук, г. Чернигов; института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного Национальной академии наук Украины, г. Киев; Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, ВНИИСХМ РАСХН, г. Санкт-Петербург. 9 штаммов из коллекции ВНИИСХМ РАСХН использовались в качестве типовых. Изоляты коллекции отдела микробиологии ИСХК НААН были выделены в разных эколого-географических зонах Украины: степи, лесостепи и Полесья (табл. 1).
Идентификация. Культуральные и физиолого-биохимические свойства изолятов Rhizobium sp. изучали согласно общепринятым методам микробиологии и биохимии (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Берджи, 1997) и методическим рекомендациям ВНИИСХМ РАСХН (Возня-ковская, Попова, 1985).
«
о
^
о
оо
а
А
съ
Г) «
а
00
Ж
съ
2
а «
а
н О
X
ю о
Исследуемые штаммы ризобий и их группировка с использованием различных молекулярных методов
Таблица 1
со
со 2
о со
ОО
ю
Штамм Род/Вид Сходство по 168 рРНК, % Растение-хозяин (источник) Географическое происхождение* 1Т8ПЦР-1*ГЬР генотип** Группа ваАГЬР Ып-регион (класс/генотип) Длина Ып-региона, п.о.
У-1 Я. 1ецит1П08агит 100 горох Украина (ВО) 6 1А.1 1/А 270 + 410
28 100 горох Украина (ЛО) 1 I А. 1 1/А 270 + 410
П-2 100 горох Украина (АРК) 1 I А. 1 1/А 270 + 410
Ч-14 100 горох Украина (ЛО) 1 I А. 1 1/А 270 + 410
К-29 100 горох Украина (ЛО) I А. 1 1/А 270 + 410
34 100 горох Украина (АРК) 1 1А.5 1/А 270 + 410
65 100 горох Украина (00) 1 1А.6 1/А 270 + 410
У-2 100 горох Украина (ВО ) 1 1А.7 1/А 270 + 410
У-4 100 горох Украина (ВО) 1 1А.З 1/А 270 + 410
У-5 100 горох Украина (ВО) 1 1А.З 1/А 270 + 410
32 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.З 1/А 270 + 410
32-2 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.З 1/А 270 + 410
682 100 фасоль Украина 1 1А.8.1 1/А 270 + 410
31 99,93 горох Украина (ЛО) 1А.4 1/А 270 + 410
261б5' 100 горох Украина 1А.2 1/А 270 + 410
Г-8 100 горох Украина (ХО) 1 1А.2 1/А 270 + 410
24 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.2 1/А 270 + 410
У-3 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 + 410
У-11 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 + 410
У-12 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 + 410
ФА-4 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.8.2 1/А 270 + 410
Ф-1 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.9 1/А 270 + 410
ФА-34 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.8.3 1/А 270 + 410
13265' 99,93 клевер Россия (ЛО) 13 1А.10 1/А 270 + 410
245а5' 100 горох Россия (МО ) 4 1В.1 1/В 320 + 470
24 8Ь 100 горох Украина 3 1В.2 1/В 320 + 470
У-9 100 горох Украина (ВО) 3 1В.2 1/В 320 + 470
У-7 100 горох Украина (ВО) 5 1В.З 1/В 320 + 470
965' 100 бобы Литва 7 1В.1 1/В 320 + 470
975' 100 бобы Латвия 8 1В.2 1/В 320 + 470
Б-6 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 + 470
i
а
§
1
i §
Со
с»
i
ел
Таблица 1 (окончание)
«
О
^
О
оо
а
А
Г) «
а ¿0 00
Ж
съ
2
а «
а
н О
X
ю о
ел ю
со со 2
о со
О0
ю
Штамм Род/Вид Сходство по 168 рРНК, % Растение-хозяин (источник) Географическое происхождение* 1Т8ПЦР-1*ГЬР генотип** Группа ваАГЬР Ып-регион (класс/генотип) Длина Ып-региона, п.о.
Б-8 Я. ^¿штпозагит 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 + 470
Б-17 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 + 470
Б-18 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/в 320 + 470
Б-9 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 + 470
Б-15 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 + 470
Б-16 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 + 470
Б-25 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 + 470
КП15 100 клевер Украина (АРК) 11 1В. 3.2 1/В 320 + 470
мк 100 клевер Украина (АРК) 12 1В.2 1/В 320 + 470
КК 100 клевер Украина (АРК) 12 1В.2 1/В 320 + 470
кпоп 100 клевер Украина (АРК) 13 1В.3.1 1/В 320 + 470
КП012 100 клевер Украина (АРК) 13 1В.3.1 1/В 320 + 470
КЛ-90 100 клевер Украина (АРК) 14 1В..З.З 1/В 320 + 470
КЛ-91 100 клевер Украина (АРК) 14 1В.3.1 1/В 320 + 470
ФК-0 100 фасоль Украина (ХО ) 15 IЬ.1.1 1/ь 320
ФК-4 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.2 1/ь 320
ФК-6 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.3 1/ь 320
108* 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.4 1/ь 320
105 100 фасоль Армения 16 II.1.1 п/с 470 + 655
108** 100 фасоль Украина (ХО ) 16 II.1.2 п/с 470 + 655
ФН 100 фасоль Украина (ХО ) 16 II.1.3 п/с 470 + 655
ФН-6 99,09 фасоль Украина (ХО ) 17 III.1 ш/о 250
ФС Я. ¿¡агсИпи 99,72 фасоль Украина (ХО ) 18 IV. 1 1У/Е 260
700" Я. еШ 99,93 фасоль Мексика 19 VI 370 + 520
912" Я. £г//е£г/е 99,86 козлятник Россия (ЛО) 20 VII У1/С 230
913" 99,86 козлятник Эстония 20 VII У1/С 230
916" 99,86 козлятник Россия (ЛО) 20 VII У1/С 230
926" 99,86 козлятник Украина 20 VII У1/С 230
К-3 99,86 козлятник Украина 20 VII У1/С 230
К-18 99,86 козлятник Украина 20 VI.! У1/С 230
* — Винницкая обл. (ВО ); Одесская обл. (00); АР Крым (АРК); Московская обл. (МО ); Ленинградская обл. (ЛО); Луганская обл. (ЛО); Харьковская область (ХО). ** — Генотипы по совокупности данных РРБР с использованием эндонуклеаз рестрикции А1и\, М$р\ и НаеIII
i
э
§
1
i §
Со
с» 1
Выделение ДНк. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК штаммы культивировали на агаризованной среде TY: дрожжевой экстракт — 1 г/л; пептон — 10 г/л; CaCl2—0,4 г/л; агар — 20 г/л (Beringer, 1974). ДНК была выделена из свежих культур на 1—2 сутки их роста с помощью метода сорбции на магнитных частицах (набор «Минипреп» , «Си-лекс», Россия).
Single adapter AFLp анализ (saAFLp) (zotov et al., 2010). Рестрикционный анализ проводили одновременно с лигированием в 10 мкл смеси, содержащей 80 нг образца ДНК, 1х лигазный буфер («Fermentas», США), 10 пкМ одноцепочечного адаптера (Ad.CTAG1: 5'-ctagCTGGAATCGATTCCAG-3'), 5 ед. Т4 ДНК ли-газы ("Fermentas", США) и 1 ед. рестриктазы XmaJI (Xbal). Полученную смесь инкубировали при 37 оС в течение 2 часов, после чего доводили реакционный объем до 100 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler gradient Eppendorf в 25 мкл смеси, содержащей 1х буфер для ПЦР, 2.8 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, в качестве ДНК-матрицы — 2 мкл рестрикци-онно-лигазной смеси, 0,4 мкМ праймера (Pr.CTAG1: 5'-CTGGAATCGATTCCAGctag-3'), комплементарного адаптеру и 1 ед. ДНК-полимеразы BioTaq («Диалат ЛТД», Россия). Для ПЦР амплификации был использован следующий температурно-временной профиль: первоначальная денатурация при 94 оС — 2 мин; последующие 30 циклов: 94 оС — 30 с, 40 оС — 30 с, 72 оС — 3 мин; окончательная элонгация — 5 мин при 72 оС.
ПцР-амплификация гена 16S рРНк и hin-ре-гиона. ПЦР анализ и последующее секвенирование (Sanger et al., 1977) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили с использованием прайме-ров FD1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и RD1: 5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3' (Weisburg et al., 1991). Амплификацию hin-региона проводили с использованием разработанных нами специфических для рода Rhizobium праймеров и следующего протокола: первоначальная денатурация при 94 оС — 2 мин; последующие 30 циклов: 94 оС — 30 сек, 55 оС — 30 сек, 72 оС — 1 мин; окончательная элонгация 5 мин при 72 оС. Амплифи-цированные фрагменты детектировались при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом сек-венаторе Genetic Analyzer 3130xl («Applied Biosystems», США).
Restriction fragment length polymorphism анализ (RFLp). Амплификацию межгенного региона рибосо-мального кластера (ITS) для последующего рестрикт-ного анализа проводили с использованием праймеров FGPS1490—72: 5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3' (Normand et al., 1992) и ITS_R: 5'-CGCAGCGTATCA-CGTCCTTC-3', адаптированных для бактерий рода Rhizobium. Рестрикционный анализ проводился с ис-
пользованием эндонуклеаз рестрикции AluI, HaelII и MspI («Fermentas», США) согласно инструкциям производителя. Обработанную рестриктазами ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4,0% агарозном геле.
Анализ нуклеотидных последовательностей. Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных Ген-Банка был проведен с помощью программы NCBI Blast (Altschul et al., 1990). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW 1.75v. (Thompson et al., 1994). Проверка и редактирование были осуществлены с помощью редактора «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Филогенетические деревья были построены в программе Mega 3.1 (Kumar et al., 2004) с помощью алгоритма Neighbor—Joining NJ (Nei and Kumar, 2000). Попарные генетические расстояния между последовательностями были определены по двухпа-раметрической модели Кимуры (Kimura, 1980). Уровень нуклеотидного полиморфизма вычислен в программе DnaSP 5.10 (Rozas et al., 2010).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Физиолого-биохимические свойства бактерий рода Rhizobium
Род Rhizobium традиционно классифицируют на основании фенотипических характеристик, таких как способность к образованию клубеньков и физиолого-биохимические свойства. По результатам проведенных анализов все изученные изоляты принадлежали роду Rhizobium и обладали специфичностью к инфицированию группы растений гороха, бобов, чины, вики, чечевицы (bv. viciae), а также растений фасоли (bv. phaseoli), клевера (bv. trifolii) и козлятника (R. galegae).
Изоляты клубеньковых бактерий коллекции отдела микробиологии ИСХК НААН показали высокую эффективность в симбиозе с современными сортами бобовых культур в почвенно-климатических условиях Украины. Это позволило повысить продуктивность растений на 10 — 30%, увеличить содержание белка в зерне на 2—6%, а в зеленой массе — на 1—3% даже при наличии в почве популяции аборигенных или ранее интродуцированных ризобий Rhizobium sp. (Дидо-вич, 2008).
Генетическое разнообразие бактерий рода Rhizobium
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S ррНК
Полные ДНК-последовательности гена 16S рРНК (1445 п. о. по геному R. leguminosarum bv. viciae 3841) были получены для всех исследуемых изолятов и штаммов Rhizobium sp. Для каждого вида клубеньковых бактерий родов Rhizobium, Sinorhizobium и Mesorhizobium
в базе данных NCBI были найдены последовательности гена 16S рРНК типовых штаммов (Kwon et. al., 2005), которые также были взяты для анализа. В качестве удаленного контроля была использована ДНК-последовательность 16S рРНК типового штамма Bradyrhizobium japonicum DSM30131T и построено филогенетическое дерево (рис. 1).
По результатам анализа все исследуемые изоляты были достоверно отнесены к 4 видам рода Rhizobium: R. leguminosarum (Frank, 1889), R. etli (Segovia et al., 1993), R. giardinii (Amarger et al., 1997) и R. galegae (Lindström, 1989) (табл. 1). Нуклеотидные последовательности вида R. leguminosarum имели одну внутривидовую замену G/A/C/T (1069 п. о. от начала гена по геному NC_008380). У штаммов R. giardinii, R. galegae и R. etli внутривидовой полиморфизм ДНК-последовательностей гена 16S рРНК обнаружен не был.
Однако, вследствие низкой разрешающей способности, частым рекомбинационным событиям и горизонтальному переносу, ген 16S рРНК не может быть применён для достоверного определения филогенетической структуры рода Rhizobium на видовом уровне (Willems, Collins, 1993; Gaunt et al., 2001; Eardly et al., 2005). По результатам построения филогенетического дерева видна полифилетичная природа ризобий, что было показано и ранее (Martinez, 1994; Новикова, 1996).
RFLP-анализ межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS)
Нами был проведен анализ ITS бактерий рода Rhizobium, который показал, что 22 из 61 штамма имеют 2 продукта ПЦР-амплификации, отличных не только по длине, но и по нуклеотидному составу (Laguerre et al., 1996; Palmer, Young, 2000; Vessey, Chemining'wa, 2006). С помощью рестрикции полученных продуктов ITS-ПЦР на внутривидовом уровне были достоверно выделены 20 ITS-RFLP генотипов (табл. 1). Также было проведено определение нуклеотидных последовательностей ITS 20 штаммов Rhizobium sp. (по одному штамму каждого ITS-RFLP генотипа), и в совокупности с нуклеотидными последовательностями референсных штаммов из ГенБанка (Kwon et al., 2005) было построено филогенетическое дерево (рис. 2). Высокий уровень нуклеотидной изменчивости ДНК-последовательности ITS-региона позволяет различать близкородственные штаммы, однако многокопийность ITS-регионов затрудняет интерпретацию филогенетических связей (Gürtler and Stanisich, 1996). Так, по данным сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей ITS-региона штаммы 105 и FA-4 (симбионты фасоли) с единичными продуктами ITS-ПЦР относились к виду R. etli. К этому же виду относились и штаммы KK, KP012 и KL91 (симбионты клевера). В то же время по ДНК-последовательностям гена 16S рРНК все эти
штаммы принадлежали к виду R. leguminosarum. Интересно, что геномы симбионтов клевера КК, КР012 и КЬ91 несут в своем составе 2 типа ITS-региона, при этом один принадлежит к виду R. leguminosarum (^-Ь — продукт ITS-ПЦР высокой молекулярной массы), другой — к R. etli (Н^^ — ITS-ПЦР продукт более низкой молекулярной массы). Вероятно, это указывает на горизонтальный перенос или частые реком-бинационные события, происходящие между ДНК-последовательностями различных видов бактерий данного рода (Terefework et а1., 1998).
saAFLP анализ
Для достоверного анализа внутривидового полиморфизма штаммов рода Rhizobium был использован saAFLP с применением эндонуклеазы рестрикции — ХтаИ (2оЬу et а1., 2010).
По данным saAFLP 23, штамма R. leguminosarum Ьу. юкеае, инокулирующие горох, были достоверно разделены на два генотипа, относящиеся к генетически разнородным группам А и В (рис. 3, а), имеющим меньше 15% общих фрагментов. С помощью данного анализа удалось установить генетическую неоднородность штаммов R. leguminosarum из Винницкой и Херсонской областей Украины (рис. 3, а, табл. 1). Таким образом, внутри однородной по последовательности гена 16S рРНК группы штаммов был показан значительный полиморфизм продуктов saAFLP и выявлено 4 генетические группы клубеньковых бактерий. Вероятно, данная вариабельность связана с определенными генетическими изменениями в процессе адаптации к различным эколого-географическим зонам и/или рас-тениям-хозяинам (Terefework et а1., 2001).
Шесть изолятов, симбионтов козлятника, отнесенных с помощью анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК к R. galegae, представляли собой генетически однородную группу штаммов с единым характерным для нее профилем saAFLR Штаммы, отнесенные по анализу ДНК-последовательности 16S рРНК к видам R. etli и R. giardinii, также имели свои уникальные saAFLP-профили.
Как известно, метод saAFLP является удобным инструментом для выбора таксонспецифичных маркеров. Одним из таких маркеров, найденных и изученных в данной работе, стал ^п-регион (от латинского Ып — уникальный, неповторимый) (Зотов с соавт., 2011. Заявка на патент рег. № 201 1 135461 от 25.08.201 1). Маркер был обнаружен экспериментально при saAFLP-анализе штаммов R. leguminosarum Ьу. viceae (рис. 3).
Анализ Ып-региона
В данной работе были амплифицированы и секвени-рованы полные нуклеотидные последовательности Ып-региона (2о^у et а1., 2010) 61 штамма бактерий рода
R. leguminosamm (44)
R. leguminosamm bv. hifolii 1326s1 R. leguminosamm ln\ viceae 31 R. leguminosamm bv.phaseoli 108* R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-6 R. leguminosamm bv. phaseoti ФН R. leguminosamm bv.pluiseoli 108** R. leguminosamm b\\ phaseoli ФК-4 R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-0 R. leguminosamm bv. phaseoli 105
-R. leguminosamm 1n\ phaseoli ФН-6
— Rhizobinm radiobacter K84 (CP000628) A , Rlu'zobium rhizogenes IFO 13257 T (D14501)
■ Rhizobinm lusitanum Pl-7 T (NR 043150)
• Rlu'zobium tropici CUT 899 T (EU4SS752) 99*-Rlu'zobium haiuanense 166 T (l~~10~S) Г Rlu'zobium etli CIA T 652 (NC 010994) »1R. etli 700-st
j—Rlu'zobium sullae IS 123 T (Y 10170) — Rlu'zobium intligoferae CCBAU 71042 T (AF36406S) Rlu'zobiumyanglingense SH22623 T (AF003375) r Rlu'zobium gallicum R602sp T (US6343) — Rlu'zobium mongolense USDA 1844 T (U89S17) ■ Rhizobinm loessense CCBAU 7190B T (AF364069) r Rhizobinm galegae ATCC43677 T (D11343) R. galegae K-3 R. galegae 926-st R. galegae 916-st R. galegae 913-st R. galegae K-18 R. galegae 912-st L Rhizobinm Imautlense S02 T (AF025S52) 931-Rhizobinm nndicola LMG11875 T (Yl~04~)
И I-
«I— Rhi:.
■ Rhizobinm vitis NCPPB3554 T (D0125S)
■ Rhizobinm mbilFO 13261 T (DO1259)
■ Rhizobinm tnmtfaciens ЖРРВ2437 T (DO1256) j- Rhizobinm giariliuii H152 T (U86344) ¡1R. giariliuii ФС
j- Mesorhizobium phirifarium LMG 11892 T (Y14158) 72 L Mesorhizobium amoiphae ACCC19665 T (AF041442) .Mesorhizobium liuakuiiIFO 15243 T (D13431) Mesorhizobium meditenaneum UPM-Ca36 T (L38825)
Mesorhizobium tianshanense USDA 3592 T (AF04144") — Mesorhizobium chacoense PR5 T (AJ278249)
Mesorhizobium ciceri UPM-C'a7 T (U07934) 991- Mesorhizobium lotiLMG 6125 T (X67229) Sinorhizobium meliloti LMG 6133 T (X67222) Sinorhizobium kummermviae CCBAU 71714 T (AF364067) Sinorhizobium mediane A 321 T (L39882) L- Sinorhizobium arboris HAMBI1552 T (Z78204) j— Sinorhizobium kostiense HAMBI 1489 T (Z'8203)
I-Sinorhizobium terangae LMG 6463 T (X68387)
|—Sinorhizobium saheli LMG 783 ~ T (X68390) T. Sinorhizobium fredii ATCC35423 (DO1272) 51 Sinorhizobium xinjiangense lAM 14142 T (D12 796) -Bradyrhizobium japonicum DSM30131 T (X87272)
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий рода Rhizobium c другими представителями Rhizobiaceaе c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 реплик. Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны. Исследуемые штаммы относятся к роду, имеющему сокращение «R.»
-С
100
R.leguminosamm Ъ\\ viciae 2486 R.leguminosamm b\\ viciae Б-8 (its-L) R. legi/ in in osamm bv. viciae K-29 R.leguminosamm &v. viciae 31 (its-L)
• R. leguminosamm bv. viciae 96-st R.leguminosamm bi\ phaseoli ФН-6 (its-L) R.leguminosamm b\\ phaseoli ФК-0 R.leguminosamm bv. pliaseoli ФН (its-L) R.leguminosamm bv. viciae 24Sa-st R.leguminosamm bv. trifoliiKK (its-L) R.leguminosamm b\\ trifoliiКП012 (its-L) R.leguminosamm ln\ trifoliiКЛ91 (its-L) R.leguminosamm bv. viciae У-l (its-S) Rhkobium leguminosamm LMG14904 T (AF345271) R.leguminosamm bv. phaseoli 6S2 R.leguminosamm bv. trifolii 1326-st ■ R.leguminosamm 1n\ viciae 2616-st 1 R.leguminosamm bv. viciae Б-9 (its-L) -R.leguminosamm bv. phaseoli 105
■ R.leguminosamm b\\ viciae Б-8 (its-S) J R.leguminosamm ln\ trifolii KK (its-S) |l R.leguminosamm bv. viciae 31 (its-S) I— R.leguminosamm bv. viciae 97-st
f- R. leguminosamm bv. viciae У-7 R.leguminosamm bv. tiifoiiiK~I91 (its-S) R.leguminosamm bv. trifoliiКПО12 (its-S) • R.leguminosamm bv. viciae Б-9 (its-S)
91_* Rhizobium gallicum R 602 T clone 1 (AF34S267)
96 П Rhizobium gallicum R 602 T clone 2 (AF345266)
I-Rhizobium mongolense USDA 1844 T (AF345273)
R.leguminosamm bv. phaseoli ФН-6 (its-S) q - R.leguminosamm bv. phaseoli ФА-4 П R.leguminosamm bv. phaseoli ФН (its-S) I - Rhizobium etli LMG 17827 T (AF.U1974) 9tI Rhizobium etli CUT 656 (NC 010994)
Rhizobium hainanense USDA 358S T (AF345269) Rhizobium tropici LMG 9503 T (A F3452 78) Rhizobium radiobacter LMG 140 T (AF541973) — Rhizobium rhizogenes DSM3014S T (AF345275)
■ Rhizobium tnsitanum PI-7 T (AY943641)
-Rhizobium tuuticola LMG 11875 T (AF345280)
.Rhizobium vitisLMG S'50 T (AF345279) -R.giartlinii ФС
■ Rhizobium gianliniiHI52 T (AF345268)
iool Rhizobium mbi DSM 6"72 T clone 2 (AF345277) ■ Rhizobium huautlense LMG 18254 T (AF345270) ■ R.galegae 926st П j
iool Rhizobium galegae LMG 6124 T (AF345265)
0.05
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей ITS бактерий рода Rhizobium c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 реплик. Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны. Исследуемые штаммы относятся к роду, имеющему сокращение «R.»
А. Б
Рис. 3. А. saAFLP-анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции XmaЛ для бактерий рода И. leguminosarum. Буквами А и В на рисунке обозначены генотипы И. ^иттвБатт по ^¿п-региону (I класс);
Б. Амплификация ^¿п-региона исследуемых штаммов И. leguminosarum с использованием специфичных для бактерий рода Rhizobium праймеров. Буквами А и В на рисунке обозначены генотипы И. leguminosarum по h¿n-региону (I класс) Дорожки: 1 — маркер молекулярной массы 1кЬ, 2 — штамм 245 а, 3 — 248 б, 4 — 261 б, 5 — К-29, 6 — П-2, 7 — Г-8, 8 — Ч-14, 9 — 24, 10 — 28, 11 — 31, 12 — 32, 13 — 32-2, 14 — 34, 15 — 65, 16 — У-1, 17 — У-2, 18 — У-3, 19 — У-4, 20 — У-5, 21 — У-7, 22 — У-9, 23 — У-11, 24 — У-12
« ■■ I
тш **** »»у»
В
С D Е F G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Рис. 4. Амплификация h¿n-региона с использованием специфичных для бактерий рода Rhizobium праймеров. Буквами на рисунке обозначены генотипы бактерий рода Rhizobium по h¿n-региону (табл. 1). Дорожки: 1 — маркер молекулярной массы 100-1000 п. о., 2 — И. leguminosarum 28, 3 — И. leguminosarum К-29, 4 — И. leguminosarum 261 б, 5 — И. leguminosarum ФК-0, 6 — И. leguminosarum 9681, 7 — И. leguminosarum 245а, 8 — И. leguminosarum У-9, 9 — И. leguminosarum КП15, 10 — И. leguminosarum У-7, 11 — И. leguminosarum МК, 12 — И. leguminosarum ФН,13 — И. leguminosarum ФН-6, 14 — И. giardinii ФС, 15 — И. вШ 70 081,16 — И. galegae К-3, 17 — маркер молекулярной массы 100 п. о.
Rhizobium (табл. 1). Полученные последовательности были выровнены с помощью программы CLUSTALW (Thompson et al., 1994) и сравнены с 5 нуклеотидными последовательностями штаммов Rhizobium sp., взятыми в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) США. Длина нуклеотидных последовательностей после выравнивания у различных
видов составила от 230 п. о. (И. вШ 926-81) до 650 п. о. (И. leguminosarum Ы. phaseoli 105). При этом все штаммы, за исключением представителей вида И.
и трех групп изолятов И. leguminosarum Ы. phaseoli, давали 3 продукта ПЦР-амплификации, что указывало на наличие 3 копий генов тРНК (Глю) (рис. 4).
На основании проведенного нами анализа 54 исследованных штамма были отнесены к трем биоварам: R. leguminosarum bv. viceae, R. leguminosarum bv. trifolii и R. leguminosarum bv. phaseoli. 1 штамм относился к виду R. etli 700st (V класс hin-региона) и 6 штаммов к R. galegae (VI класс hin-региона). По данным hin-регион ПЦР-изоляты из клубеньков гороха представляли собой 6 групп штаммов, а изоляты из клубеньков бобов — 2 группы, относящиеся к I классу hin-региона (рис. 5). Симбионты клевера были разделены на 5 групп штаммов I класса hin-региона, две из которых выделены из почв Украины (рис. 5), а изоляты из клубеньков фасоли принадлежали к пяти генетически удаленным группам: R. leguminosarum (генотипы A, B, b, C, D) и R. etli (генотип G) (V класс hin-региона). Таким образом, на исследуемой выборке штаммов рода Rhizobium, выделенных из различных эколого-геогра-фических зон Украины, было выявлено 7 генотипов, каждый из которых отличался длиной и ДНК-последовательностью hin-региона. Всего в исследуемой выборке штаммов по ДНК-последовательности hin-региона было выделено 8 генотипов (табл. 1).
Разделение исследуемой выборки штаммов на генотипы по последовательности hin-региона совпадало с группированием штаммов по saAFLP. Однако корреляции между растением-хозяином, происхождением штамма и генотипами обнаружено не было. Некоторые штаммы, объединенные в один генотип, являлись симбионтами различных биоваров растений (например, бобов и клевера — генотип B, гороха и фасоли — генотип А). Штаммы, выделяемые одновременно с одной и той же посевной площади (например, симбионты гороха Ула-довского района Херсонской области), представляли собой генетически удаленные по данным hin-регион ПЦР и saAFLP популяции, при этом большинство изолятов относились к генотипу А, что могло быть связано как с конкурентоспособностью штаммов данного генотипа, так и с численностью представителей этого генотипа в почве. Отсутствие данной корреляции было ожидаемым фактом, подтвержденным в исследованиях других ученых (Wernegreen et al., 1997). Оно связано с тем, что у бактерий рода Rhizobium все гены, определяющие его симби-отическую природу, как правило, находятся на плазмиде и способны переноситься от одного вида к другому, делая его сапрофитным или способным к симбиозу (Sullivan et al. 1995; Sullivan, Ronson, 1998). Мы же фокусируемся на изучении таксономической структуры рода, т. е. на изучении специфических генов и межгенных регионов хромосомной ДНК.
Далее, для выровненных секвенированных последовательностей hin-региона I класса R. leguminosarum был построен график, отражающий уровень ДНК-полиморфизма между тремя одноименными сайтами рестрикции AvrII со смещением 50-нуклеотидного окна с шагом в 1 п. о. (рис. 6). Исследования общего полиморфизма
нуклеотидных последовательностей на примере I класса hin-региона вида R. leguminosarum показали, что данный регион обладает высоким уровнем полиморфизма (до 15%) между штаммами разных биоваров. Таким образом, информативность предложенного нами локуса на два порядка выше, чем гена 16S рРНК, сопоставима по своей разрешающей способности с методом секвени-рования ITS и составляет 22 нуклеотидных замены на 100 п. о., что позволяет изучать бактерии на внутривидовом уровне.
Следует отметить, что полученные результаты для hin-региона коррелируют с результатами saAFLP и анализа сравнения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и ITS. Однако предложенный нами таксономический маркер обладает существенным преимуществом — он является хромосомным, обладает большей разрешающей способностью и представлен в геноме единичной копией. Таким образом, ПЦР-анализ hin-региона является достоверным диагностическим инструментом для изучения внутривидового генетического полиморфизма популяции клубеньковых бактерий рода Rhizobium.
По результатам проведенного анализа структуры hin-региона были выявлены специфические нуклео-тидные замены, в т. ч. протяженные вставки и делеции, характерные для видов и групп штаммов, выделенных c помощью анализа saAFLP. Эти данные позволят подбирать таксон специфичные праймеры отдельно на каждую группу штаммов, обладающих идентичной последовательностью hin-региона.
заключение
Таким образом, нами была разработана маркерная система, специфическая для клубеньковых бактерий рода Rhizobium, позволяющая разделить их на уровне вида и группы штаммов (табл. 2). Родоспецифичная ПЦР hin-регионов позволяет идентифицировать бактерии рода Rhizobium, а определение их нуклеотидных последовательностей дает информацию о внутривидовом разнообразии. Применение же анализа hin-регионов совместно с другими методами, представленными в таблице 2, дает полную картину о таксономии рода Rhizobium на любом уровне.
Данные, полученные с помощью анализа hin-регио-нов, согласуются с результатами традиционных техник, рассмотренных выше, но значительно превосходят их по своей информативности. Так, на основании проведенных нами исследований при сравнительном анализе ДНК последовательностей hin-регионов было выявлено 8 генотипов ризобий, выделенных из различных эколого-географических зон Украины, Разделение штаммов на группы совпадало с филогенией, полученной по последовательности гена 16S рРНК, и группированием штаммов по результатам анализа saAFLP. Однако вариабельность
R. leguminosamm bv hifolii КП15 R. leguminosamm bv. hifolii КПО11 R. leguminosamm bv. hifolii КП012 R. leguminosamm bv. trifolii КЛ-91 R. leguminosamm bv. hifolii КЛ-90 R. leguminosamm bv. viceae E-17 R. leguminosamm bv. viceae Б-9 R. leguminosamm bv. viceae Б-16 R. leguminosamm bv. hifolii KK R. leguminosamm bv. viceae E-S R. leguminosamm bv. hifolii MK R. leguminosamm bv. viceae Б-6 R. leguminosamm bv. viceae Б-25 R. leguminosamm bv. viceae E-18 R. leguminosamm bv. viceae Б-15 R. leguminosamm bv. viceae У-7 731R. leguminosamm bv. viceae 2486
Пл. leguminosamm bv. viceae У-9 ili— R. leguminosamm bv viceae 245a-st
55I— Rhizobinm leguminosamm bv. hifolii WSM1325 (NC 012850)
чг
Rhizobinm etli 700-st
Rhizobinm etli CL4T652 (NC 010994)
-Rhizobinm leguminosamm bv. trifolii WSM2304 (NC_011S69)
R. leguminosamm bv. phaseoli 108"" R. leguminosamm bv. phaseoli 105 R. leguminosamm bv. phaseoli ФН R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-0 - 1/b
R. leguminosamm bv. phaseoli 108 * - l b
R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-6 - l b
R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-4 - l b
Rhizobinm leguminosamm bv. viceae 3841 (NC_008380) • R. leguminosamm bv. viceae 96-st 1R. leguminosamm bv. viceae 97-st
-R. leguminosamm bv. viceae 2tilb-st
99 1Ä. leguminosamm bv viceae 31 Lä. leguminosamm bv viceae K-29
R. leguminosamm bv hifolii 1326-st R. leguminosamm bv. viceae У-1 R. leguminosamm bv viceae У-2 R. leguminosamm bv. viceae 32 R. leguminosamm bv. viceae 34 R. leguminosamm bv. viceae 65 R. leguminosamm bv. viceae 28 R. leguminosamm bv viceae У-5 R. leguminosamm bv. viceae У-11 R. leguminosamm bv phaseoli 682 R. leguminosamm bv. viceae 4-14 R. leguminosamm bv. phaseoli ФА-4 R. leguminosamm bv. viceae 24 R. leguminosamm bv viceae 32-2 R. leguminosamm bv. viceae П-2 R. leguminosamm bv phaseoli ФА-34 R. leguminosamm bv. viceae Г-8 R. leguminosamm bv. viceae У-12 R. leguminosamm bv phaseoli -Ф1 R. leguminosamm bv viceae У-3 R. leguminosamm bv. viceae У-4 ■ R. leguminosamm bv. phaseoli ФН-6
-R. giarHinii bv phaseoli ФС
R. galegae 913-st
R. galegae 926-st R. galegae K-18 R. galegae 916-st R. galegae 912-st R. galegae K-3
l/B
V/F
ll/C
l/B
l/A
lll/D IV/E
Vl/G
Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей hin-региона Rhizobium sp. c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа (1000 реплик). Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны
Рис. 6. График, построенный с помощью программного обеспечения DnaSP 5.10 (Rozas et al., 2010), показывает уровень полиморфизма hin-региона I класса для бактерий R. leguminosarum (по оси x указаны позиции среднего значения 50-нуклео-тидного скользящего окна, по оси y — S — число сегрегирующих сайтов). Hin-регион представляет собой суммарную нуклеотидную последовательность из Rt и R2. Специфические для рода Rhizobium праймеры обозначены PF и PR. Зелеными стрелками показаны гены тРНК (Глю)
нуклеотидной последовательности hn-регионов внутри отдельных генотипов была выше и составляла от 3,3 до 77,5% (по сравнению с 0,1-1,2% для 16S рРНК и 3,219,2% для saAFLP).
Хотя пока остается до конца неясным происхождение и значение hin-региона для ризобий, на основании проведенных исследований можно предположить, что он является необходимым для их жизнедеятельности. Известно, что данная последовательность, аналогов которой не найдено ни в одном секвенированном геноме про- и эукариот, располагается между повторами генов тРНК (Глю), которые, в свою очередь, являются предшественниками на начальной стадии биосинтеза тетрапирролов (гемоглобинов и хлорофилла) в растениях, археях и бактериях (Jahn et. al., 1992).
В клубеньках бобовых растений синтезируется ле-гоглобин (леггемоглобин, Lb), симбиотический гемоглобин, который играет первостепенную роль в процессе азотфиксации: способствует переносу кислорода в сим-биосомы, снабжая азотфиксирующих микросимбионтов связанным кислородом. С другой стороны, Lb выполняет буферные функции, связывая избыточный кислород, подавляющий каталитическую активность нитрогеназы (Топунов, Петрова, 2001; Космачевская, Топунов, 2009). Количество генов тРНК (Глю) и тип антикодона влияют на интенсивность биосинтеза Lb и возможность участия в биосинтезе других белковых соединений С5 метаболического пути (Levican et al., 2005).
Таблица 2
Разрешающая способность фенотипических и генетических методов, используемых в данной работе для изучения биоразнообразия бактерий рода Rhizobium
Метод Род Rhizobium Вид Био-вар Группа штаммов
Фенотипические методы
Биохимический анализ + +/- - -
Тест на инокуляцию растений-хозяев + +/- + -
Генотипические методы
hin-регион ПЦР + + - +
saAFLP - + + +
ITS ПЦР-RFLP - +/- - +/-
секвенирование 16S рРНК + + - -
Секвенирование 16S-23S рРНК (ITS) + + - +
Нами был проведен предварительный поиск наличия транскрипционных факторов и промоторных областей в данном регионе (Reese, 2001). По результатам исследования регион R2 содержал консервативную область длиной 46 п. о., которая со 100% вероятностью для растений и 90% вероятностью для бактерий являлась промотором, содержащим GATA-и GCGC-мотивы и необходимым для распознавания белковыми молекулами сигнальной (иммунной) системы растений. Исследования региона R1 не выявили характерных промоторных областей и мотивов, кроме TATA-бокса. Однако вторичная структура данного региона была аналогичной у всех классов ДНК-последовательностей R1 и образовывала двухшпилечную пространственную конформацию в позициях, примерно, —30 и -60 п. о.
Учитывая вышесказанное, можно предположить, что hin-регион является промотором генов тРНК (Глю), а его уникальная последовательность, возможно, является следствием совместной адаптации (эволюции) бактерий и растений-хозяев друг к другу.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (12-04-01809), совместного гранта РФФИ (10-0490043 Бел_а) — БРФФИ (Б10 Р-211) и Целевой программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых» и Программе научных исследований НААН Украины «Научные основы управления микробиологическими процессами в технологиях высокопродуктивного сельскохозяйственного производства (Сельскохозяйственная микробиология)».
литература
1. Возняковская Ю. М., Попова Ж. П. 1985. Методические указания по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений. Л.: ВНИИСХМ. 48 с.
2. Д1дович С. В., Толкачов М. З., Бутв1на О. Ю. 2008. Ефективнють симбютично! азотфксацп в агроценозах Укра!ни // Сшьськогосподарська мжробюлопя. Мiжвiдомчий тематичний наук. зб. 1СГМ УААН. Чернтв. Вип. 8. С. 117-125.
3. Зотов В. С., Пунина Н. В., Топунов А. Ф. Способ идентификации и дифференциаци и прокариотических организмов. Заявка на патент. Рег. № 2011135461 от 25.08.2011.
4. Космачевская О. В., Топунов А. 2009. Гемоглоби-ны — разнообразие структур и функций // Прикл. биохимия и микробиология. Т.45, № 6. С. 627653.
5. Методы почвенной микробиологии и биохимии. / Под ред. Звягинцева Д. Г. — М.: изд-во МГУ, 1991. 303 с.
6. Новикова Н. И. 1996. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий // Микробиология, Т. 65, № 4. С. 437-450.
7. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Хоул-та Дж., Крига Н., Снита П.; перевод с англ., в 2 т. М.: Мир, 1997. 1232 с.
8. Топунов А. Ф., Петрова Н. Э. 2001. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность // Успехи биологической химии Т. 41, С. 199228.
9. Altschul S. F, Gish W., Miller W. et al. 1990. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. Vol. 215. P. 403-410.
10. AmargerN, Macheret V., Laguerre G. 1997. Rhizobi-um gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov., from Phaseolus vulgaris Nodules // Int. J. Syst. Bacte-riol. Vol. 47, No. 4. P. 996-1006.
11. Beringer J. E. 1974. R1 transfer in Rhizobium legumi-nosamm // J. Gen. Microbiol. 84:188-198.
12. Eardly B. D, Nour S. M., van Berkum P., Seland-er R. K. 2005. Rhizobial 16S rRNA and dnaK genes: mosaicism and the uncertain phylogenetic placement of Rhizobium galegae // App. and Env. Mic. Vol. 71. No. 3. P. 1328-1335.
13. Frank B. 1889. Ueber die Pilzsymbiose der Leguminosen // Ber Deut. Bot. Ges. Vol. 7. P. 332-346.
14. Gaunt M. W., Turner S. L., Rigottier-Gois L. et al, 2001. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 51. P. 2037-2048.
15. Gurtler V. and Stanisich V. A. 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region // Microbiology. Vol. 142. P. 3-16.
16. Hall T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. Vol. 41. P. 95-98.
17. Jahn D, Verkamp E, Soll D. 1992. Glutamyl-transfer RNA: a precursor of heme and chlorophyll biosynthesis // Trends. Biochem. Sci. Vol. 17 (6). P. 215-223.
18. Kimura M. A. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate at base substitudions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. Vol. 16. P. 111-120.
19. KumarS, TamuraK, NeiM. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bio-informatics. Vol. 5. P. 150-163.
20. Kwon S.-W, Park J.-Y, Kim J.-S. at al. 2005. Phylogenet-ic analysis of the genera Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium on the basis of 16S rRNA gene and internally transcribed spacer region sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 55. P 263-270.
21. Laguerre G, Mavingui P., Allard M.-R. et al. 1996. Typing of Rhizobia by PCR DNA Fingerprinting and PCR-RFLP Analysis of Chromosomal and Symbiotic Gene Regions: Application to Rhizobium leguminosar-um and Its Different Biovars // App. and Env. Microbiol. Vol. 62. P. 2029-2036.
22. Lindstrom K. 1989. Rhizobium galegae, a new species of legume root nodule bacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 39. No. 3. P. 365-367.
23. Martinez E. 1994. Recent developments in Rhizobium genome // Plant and Soil, Vol. 161. P. 11-20.
24. Martínez-Romero E., Caballero-Mellado J. 1996. Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity // Critical Rev. Plant Sci. Vol. 15. P. 113140.
25. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular evolution and phy-logenetics. New York: Oxford University Press. P. 336.
26. Normand P., Cournoyer B., Nazaret S, Simo-net P. 1992. Analysis of a ribosomal operon in the actinomycete Frankia // Gene. Vol. 111. P. 119 — 124.
27. Palmer K. M, Young J. P. W. 2000. Higher Diversity of R. leguminosarum bv. viciae Populations in Arable Soils than in Grass Soils // App. and Env. Microbiol. Vol. 66. P. 2445-2450.
28. Reese M. G. 2001. Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila mel-anogaster genome // Computers & Chemistry. Vol. 26 (1). P. 51-56.
29. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Спайнка Г., Кондороши А., Хукаса П. Пер. с англ. СПб.: Бионт, 2002. 558 с.
30. Sanger F, Air G.M, Barrell B. G. et al. 1977. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA // Nature. Vol. 265. P. 687-695.
31. Segovia L, Young J. P. W, Martinez-Romero E. 1993. Reclassification of American Rhizobium legumi-nosarum biovar phaseoli type I strains in a new species, Rhizobium etli sp. nov // Int. J. Sys. Bacteriol. Vol. 43. P. 374-377.
32. Sullivan J. T, Patrick H. N, Lowther W. L, Scott D. B, Ronson C. W. 1995. Nodulating strains of Rhizobium loti arise through chromosomal and symbiotic gene transfer in the environment // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 92. P. 8995-8999.
33. Sullivan J. T, Ronson C. W. 1998. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 95. P. 5145-5149.
34. Suominen L, Roos C., Lortet G. et al., 2001. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. Vol. 18. P. 907916.
35. Terefework Z., Kaijalainen S., Lindstrom K. 2001. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity of Rhizobium galegae isolated from Galega orientalis and Galega officinalis // J. Biotechnol. Vol. 91. P. 169-180.
36. Terefework Z., Nick G., Suomalainen S., Padin L. 1998. Phylogeny of Rhizobiurn galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria // Int. J. of Syst. Bacteriology. Vol. 48. P. 349-356.
37. Thompson J. D, Higgins D. G, Gibson T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nuc. Ac. Res. Vol. 22. P. 46734680.
38. Vandamme P., Pot B, Gillis M. et al., 1996. Poly-phasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. Vol. 60. P. 407438.
39. Vessey J. K, Chemining'wa G. N. 2006. The genetic diversity of Rhizobium leguminosarum bv. viciae in cultivated soils of the eastern Canadian prairie // Soil Biology and Biochemistry. Vol. 38. P. 153-163.
40. Vinuesa P., Rojas-Jimenez K., Contreras-Moreira B. et al., 2008. Multilocus sequence analysis for assessment of the biogeography and evolutionary genetics of four Bradyrhizobium species that nodulate soybeans on the Asiatic continent // App. and Env. Mic. Vol. 74. P. 6987-6996.
41. Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D.J. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. Vol. 173. P. 697-703.
42. Wernegreen J. J., HardingE.E., Riley M. A. 1997. Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium leguminosarum // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 94. P. 5483-5488.
43. Zotov V. S., Punina N. V., Ignatov A.N. et al. 2010. Elaboration and use of new approach to species and strain identification of phytopatological and nitrogen-fixing bacteria // Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology. Program and Abstracts, Finland, P. 87.
THE NEW TAXONOMIC MARKER OF NODULATION BACTERIA OF RHIZOBIUM GENUS AND ITS EVOLUTION
Zotov V. S., Punina N. V., Khapchaeva S. A., Didovich S. V., Melnichuk T. N, Topunov A.F.
SUMMARY: The new taxonomic marker (hin-region) has been proposed, which gives possibility for Rhizobium bacteria study on
"species — group of strains" level. Using this marker the groups of Rhizobium strains were determined, which could not be distinguished with other methods, and these results correlated with evolutionary similarity of the bacteria. The developed approach for creating marker systems allows to carry out effective inventory of inter- and intra-species genetic diversity of nodulating bacteria and to evaluate perspectives of their use in agriculture. The proposed marker system was used for description of Rhizobium bacteria samples isolated from various ecological-geographical regions of Ukraine.
Ф KEY WORDS: Rhizobium; phylogeny; taxonomy; diversity; saAFLP; hin-region PCR; PCR-RFLP; 16S ribosomal RNA; 16S-23S ribosomal RNA.
Ф Сведения об авторах
Зотов Василий Сергеевич - младший научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А. Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: adni83@yandex.ru. Пунина Наталия Владимировна — к. б. н., научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, научный сотрудник лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: hin-enkelte@yandex.ru.
Хапчаева Софья Арсеновна — старший лаборант лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: hapchaeva90@mail.ru. Дидович Светлана Витальевна — к. с/х. н., старший научный сотрудник, заведующая лабораторией биологического азота и фосфора Отдела микробиологии Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины. 95453, Украина, АР Крым, г. Симферополь, ул. Киевская, 150. E-mail: sv-alex.68@mail.ru.
Мельничук Татьяна Николаевна — к.с/х.н., старший научный сотрудник, заместитель директора по науке Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины. 95453, Украина, АР Крым, г. Симферополь, ул. Киевская, 150. E-mail: melnichuk tn@ukr.net.
Топунов Алексей Фёдорович - д. б. н., руководитель лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А. Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: aftopunov@yandex.ru.
Vasily Sergeevich ZOTOV — junior research scientist, Laboratory of Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences. E-mail: adni83@yandex.ru. Natalia Vladimirovna PUNINA — Ph.D., research scientist, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences; research scientist, Laboratory of DNA diagnostics, Research Centre for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences. E-mail: hin-enkelte@yandex.ru.
Sofia Arsenovna KHAPCHAEVA — senior technician, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Science. E-mail: hapchaeva90@mail.ru.
Svetlana Vitalievna DIDOVICH — Ph.D., senior research scientist, head of laboratory, Laboratory of biological nitrogen and phosphorus, Department of Microbiology, Institute of Agriculture of Crimea of National Academy of Agriculture Sciences of Ukraine. E-mail: sv-alex.68@mail.ru.
Tatiana Nikolaevna MELNICHUK — h.D., senior research scientist, Deputy Director on science, Institute of Agriculture of Crimea of National Academy of Agriculture Sciences of Ukraine. E-mail: melnichuk tn@ukr.net.
Alexey Fedorovich TOPUNOV - D.Sc., head of laboratory, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences. E-mail: aftopunov@yandex.ru.
