НОВЫЙ ПЦР-ТЕСТ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ" ДЛЯ ACIDOVORAX CITRULLI, ОСНОВАННЫЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОДИРУЮЩЕЙ БЕЛОК S-BOX ДОМЕНА PAS Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

https://doi.org/10.17116/molgen20213902146

Новый ПЦР-тест в режиме «реального времени» для Acidovorax citrulli, основанный на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS

© О.Ю. СЛОВАРЕВА1' 2, Е.В. СТАРИКОВА2- 3

'ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева», Москва, Россия; 2ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений», р.п. Быково, Раменский район, Московская область, Россия; 3ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», Москва, Россия

РЕЗЮМЕ

Цель исследования. Диагностика возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli нуждается в новых высокоспецифичных методах, основанных на ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). Целью исследования являлась разработка нового теста ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli.

Материалы и методы. Методом кластеризации белковых последовательностей 9 геномов A. citrulli и 9 геномов A. avenae c помощью программы cd-hit были идентифицированы 153 белковых кластера, присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех штаммах A. avenae. Полученные кластеры сравнивали с известными белковыми последовательностями (nr) с помощью программы blastp с целью установления их специфичности для A. citrulli. Кодирующие последовательности специфичных для A. citrulli белков использовали для подбора праймеров и зонда. Специфичность ПЦР-РВ проверяли путем тестирования ДНК 6 штаммов A. citrulli и 188 штаммов нецелевых бактерий.

Результаты. В результате поиска специфичных для A. citrulli белковых последовательностей нами был идентифицирован белок S-box PAS домена. Проведенные ПЦР-тесты показали 100% специфичность как при тестировании целевых штаммов (все реакции положительны), так и с нецелевыми штаммами (все реакции отрицательны).

Заключение. Таким образом, был разработан новый тест ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli, основанный на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS.

Ключевые слова: Acidovorax citrulli, ПЦР в режиме «реального времени», домен PAS, белок S-box, диагностика фитопатогенов, карантин растений.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Словарева О.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-6022-5955; e-mail: slovareva.olga@gmail.com Старикова Е.В. — https://orcid.org/0000-0001-6582-210X; e-mail: hed.robin@gmail.com Автор, ответственный за переписку: Словарева О.Ю. — e-mail: slovareva.olga@gmail.com

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Словарева О.Ю., Старикова Е.В. Новый ПЦР-тест в режиме «реального времени» для Acidovorax citrulli, основанный на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021;39(2):46—50. https://doi.org/10.17116/molgen20213902146

Novel qPCR-based test system for Acidovorax citrulli based on PAS domain S-box protein gene

© O.Yu. SLOVAREVA1 2, E.V. STARIKOVA2 3

'Russian State Agrarian University — Moscow Agricultural Academy named after K.A. Timiryazev, Moscow, Russia; 2Federal State Organization «All-Russian Plant Quarantine Center», Bykovo, Russia;

3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia ABSTRACT

Goal. The diagnosis of Acidovorax citrulli requires new highly specific methods based on qPCR. The goal of the study was to develop a new qPCR-based test for the identification of A. citrulli.

Materials and methods. By clustering the protein sequences of 9 A. citrulli genomes and 9 A. avenae genomes, the cd-hit program was used to identify 153 protein clusters present in all 9 A. citrulli strains and absent in all A. avenae strains. The resulting clusters were compared with known protein sequences (nr) using the blastp program to determine their specificity for A. citrulli. Coding sequences of A. citrulli-specific proteins were used for the selection of primers and the probe. The specificity of qPCR was tested by using the DNA of 6 A. citrulli strains and 188 non-target bacteria strains.

Results. As a result of the search for A. citrulli-specific protein sequences, identified the S-box PAS domain protein. The qPCR tests performed showed 100% specificity both when testing target strains (all reactions were positive) and with non-target strains (all reactions were negative).

Conclusion. Thus, a new qPCR test was developed for the identification of A. citrulli, based on the sequence encoding the S-box protein of the PAS domain.

Keywords: Acidovorax citrulli, qPCR, PAS domain, S-box protein, phytopathogen diagnostic, plant quarantine.

INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:

Slovareva O.Yu. — https://orcid.org/0000-0001-6022-5955; e-mail: slovareva.olga@gmail.com Starikova E.V. — https://orcid.org/0000-0001-6582-210X; e-mail: hed.robin@gmail.com Corresponding author: Slovareva O.Yu. — e-mail: slovareva.olga@gmail.com

TO CITE THIS ARTICLE:

Slovareva OYu, Starikova EV. Novel qPCR-based test system for Acidovorax citrulli based on PAS domain S-box protein gene. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2021;39(2):46—50. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20213902146

Введение

Acidovorax сИгиШ — это фитопатогенная бактерия, способная наносить значительный ущерб производству продукции тыквенных культур в местах своего распространения [1]. Л. с'йгиШявляется карантинным организмом для многих стран [2]. Ранняя диагностика возбудителя — ключ к контролю его распространения [3]. Использование методов на основе поли-меразной цепной реакции (ПЦР) является самым быстрым способом обнаружения бактерий в образце. При этом ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) — метод, требующий минимальных трудозатрат [4]. На сегодняшний день для диагностики Л. сНгиШ применяется только один метод ПЦР-РВ, представленный в диагностическом протоколе Европейской и средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР) РМ7/127(1) [5]. Однако оценка специфичности данного теста показала неудовлетворительный результат [6]. В связи с высокой актуальностью проведено исследование, целью которого являлась разработка нового теста на основе ПЦР-РВ для идентификации Л. сЫгиШ.

Материалы и методы

Для поиска мишени использовали аннотированные белки, соответствующие кодирующим последовательностям 9 геномных сборок Лcidovorax сЫгиШ и 9 геномных сборок Лcidovorax ачепае, загруженным с NCBI RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/ GCF/) в сентябре 2019 г. (табл. 1).

С целью получения неизбыточных наборов белков для каждого из геномов каждый набор белковых последовательностей кластеризовали с помощью программы сё^й. Алгоритм программы производит группировку последовательностей по заданному пользователем порогу идентичности с использованием «жадного» алгоритма фильтрации по коротким «словам» (коротким частям последовательностей: ди-пептидам, трипептидам и др.). Для создания неизбыточного набора последовательностей использовали порог идентичности 90%, допустимая разница в длине последовательностей составила 80%.

Неизбыточные наборы белковых последовательностей 9 штаммов Л. сЫгиШ и 9 штаммов Л. avenae были помечены в соответствии с видом и класте-

ризованы с помощью программы cd-hit при пороге идентичности в 60% и допустимой разнице в длине последовательностей 80%. Для идентификации белковых кластеров, присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех 9 штаммах A. ave-nae, нами был применен скрипт на языке Python.

Полученные белковые кластеры, присутствующие у A. citrulli и отсутствующие у A. avenae, сравнивали с известными белковыми последовательностями (nr) с помощью программы blastp с целью оценки их специфичности для A. citrulli. Специфичными считались белки, имеющие низкое сходство (<70% идентичности) с белками других бактериальных видов как родственных, так и не родственных A. citrulli. Из анализа исключили фаговые белки, а также белки, имеющие внутривидовую вариабельность у A. ci-trulli как неподходящие в качестве мишени.

Праймеры подбирали с использованием программы PrimerBlast.

Праймеры и зонд произведены ЗАО «Евроген» (Россия).

Оценку аналитической специфичности нового метода ПЦР-РВ проводили со следующими штаммами: изоляты A. citrulli, выделенные из растений арбуза в США, Испании и Китае и позднее заложенные в Испанской коллекции фитопатогенов Института сельскохозяйственных исследований (IVIA), г. Валенсия под номерами 51, 2609 и 3000 соответственно. Также в исследовании использовали 2 штамма A. citrulli DLS 1035, выделенные из экстрактов семян арбуза и дыни, и штамм DLS 1456, выделенный из экстракта семян арбуза; происхождение экстрактов — Италия. Также использовали следующие нецелевые бактерии: Acidovorax cattleya (NBC 430), Arthrobacter castelli, Arthrobacter sp. (2 изолята), Burkholderia sp., Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (3 изолята), Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (CFBP (Франция) 2405 и 3491), Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (10 изолятов, а также штамм NCP-PB (UK) 2137), Curtobacterium sp. (2 изолята), Cur-tobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens (1 изолят, а также штамм CFBP 3418), Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii (CFBP 1384), Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsettiae (CFBP 2403), Dickeya sp. (изолят из коллекции EVIRA, Финляндия), Dickeya chrysanthemi (DSMZ (Германия) 4610-0508-001), Dickeya da-

Таблица 1. Геномные сборки штаммов A. citrulli и A. avenae, использованные для биоинформатического предсказания ПЦР-мишени

Вид Штамм Идентификатор RefSeq Assembly Число предсказанных белков

Acidovorax citrulli AAC00-1 GCF_000015325.1 4581

» KACC17005 GCF_002441975.1 4442

» M6 GCF_001593665.2 4178

» DSM 17060 GCF_900100305.1 4167

» AAC00-1 #5684 GCF_003096435.1 4619

» AAC00-1 #5596 GCF_003387255.1 4546

» AAC00-1 #5593 GCF_003664145.1 4541

» pslb65 GCF_000948135.1 4157

» tw6 GCF_000968215.1 4267

Acidovorax avenae ATCC 19860 GCF_000176855.2 4659

» T10_61 GCF_001282395.1 4574

» АА81_1 GCF_003029685.1 4701

» MD5 GCF_003029725.1 4345

» SH7 GCF_003029785.1 3958

» AA78_5 GCF_003029805.1 3769

» AA99_2 GCF_003029825.1 3580

» KL3 GCF_003029905.1 3532

Acidovorax avenae SF12 GCF_003030005.1 3636

dantii subsp. dadantii (DSMZ 18020-1112-001), Dick-eya dadantii subsp. dieffenbachiae (DSMZ 18013), Dick-eyaparadisiaca (DSMZ 18069-0406-001), Dickeya solani (DSMZ 28711), Dickeya zeae (DSMZ 18068-0816-001), Enterobacter amnigenus, Erwinia amylovora (47 изолятов, а также штаммы CFBP 1430 и 3025, ACW (Швейцария) 35298, 35295, 58459, 37905, 35356 и 57467, LMG (USA) 2068 и NCPPB 683), Erwinia billingiae, Erwinia piriflorinigrans (2 изолята), Erwinia tasmaniensis, Micro-bacterium sp. (2 изолята), Microbacterium phyllosphaer-ae, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum lupini, Ochro-bactrum sp. (2 изолята), Paenibacillus, Pantoea agglom-erans (2 изолята, а также штамм DSMZ 1619), Pantoea ananatis, Pantoea dispersa, Pantoea stewartii subsp. stew-artii (6 изолятов), Pectobacterium atrosepticum (штамм DSMZ 18077 и изолят из коллекции EVIRA, Финляндия), Pectobacterium betavasculorum (DSMZ 180760306-001), Pectobacterium cacticida (DSMZ 21821-0908001), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (DSMZ 30168), Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum (DSMZ 22556-0509-001), Pectobacterium wasabiae (DSMZ 18074-0315-001), Phyllobacterium sp., Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas congelans (ICMP (Новая Зеландия) 9032), Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fuscovaginae (DSMZ 7231-0205-001), Pseudomonas graminis, Pseudomonas hibiscicola, Pseudomonas savasta-noi pv. glycinea (CFBP 2214), Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (штаммы CFBP 1390, 1429 и 3652), Pseudomonas syringae pv. syringae (2 изолята), Pseudomonas syringae, Rahnella aquantilis, Ralstonia solanacearum (16 изолятов, а также штаммы NCPPB 2315 и 2316, AOBC PPSCD (Венгрия) 1069 и 1071), Rathayibacter tritici (CFBP 1385), Sphingomonas paucimobilis, Steno-trophomonas sp. (2 изолята), Stenotrophomonas malto-philia, Xanthomonas arboricola pv. pruni, Xanthomonas

axonopodis pv. alli (CFBP 6107), Xanthomonas axono-podis pv. phaseoli (CFBP 2534), Xanthomonas campestris pv. campestris (2 изолята), Xanthomonas campestris pv. ra-phani (NCPPB 1946), Xanthomonas euvesicatoria (DSMZ 19128), Xanthomonas fragariae (NCPPB 1469), Xanthomonas gardneri (DSMZ 19127), Xanthomonas hyacinthi, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (NCPPB 3002), Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (CFBP 2286), Xanthomonasperforans (DSMZ 18975), Xanthomonas translucens (DSMZ 18974), Xanthomonas vesicatoria (DSMZ 22252), Xylella fastidiosa и Xylophilus ampelinus (2 изолята, а также штамм LSV 28.02, Франция). Всего для проведения тестов использовали 188 штаммов нецелевых бактерий.

ДНК-матрицу всех штаммов брали в концентрации 15—20 нг/мкл. Для измерения концентрации использовали спектрофотометр NanoDrop 2000C Thermo Fisher Scientific (США). Каждый штамм тестировали в трехкратной повторности.

Так, qPCR проводили, используя следующий состав смеси на 1 реакцию: 12 мкл деионизированной воды, 5 мкл мастер-микса 5X qPCRmix-HS производства фирмы ЗАО «Евроген» (Россия), по 1 мкл каждого праймера в концентрации 10 пкм, 1 мкл зонда в концентрации 5 пкм и 5 мкл ДНК-матрицы. Для проведения ПЦР использовали амплификатор детектирующий ДТпрайм, ООО «ДНК-Технология» (Россия). Программа амплификации: начальная денатурация — 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов: 10 с при 94 °C, 30 с при 62 °C и 20 с при 72 °C.

Результаты и обсуждение

В результате кластеризации белковых последовательностей штаммов A. citrulli и 9 штаммов A. avenae были идентифицированы 4744 белковых кластера,

Таблица 2. Последовательности праймеров и зонда на локус C8E07_RS00895

Праймер/ зонд

Последовательность (5'-3')

Tm

Цепь

Начало в AAC00-1 #5596

Конец в AAC00-1 #5596

PAS F PAS R PAS P

CCAAAGCCAGCACGAGGAGA 62.45

GAACAGCGAGACGGAGTGGT 62.14

FAM-ACGCGCATCAACGGCGTCATCG-BHQ1 62

208579 208735 208600

208598 208716 208622

+

+

содержащих 2 и более белков. Не были определены ни в один кластер 977 белков.

Нами было идентифицировано 153 белковых кластера (размером от 60 до 1389 аминокислот), присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех штаммах A. avenae. Большинство из данных кластеров были аннотированы как мембранные белки, рестриктазы, фаговые белки и др. В результате сравнения полученных белковых кластеров с известными белковыми последовательностями (nr), многие из них были исключены из кандидатов на ПЦР-ми-шень, поскольку имели высокое сходство с белками других бактериальных видов и родов (таких как Vario-vorax, Ottowia, Stenotrophomonas, Bordetella и др.), хотя их кодирующие последовательности и отсутствовали в геноме близкородственного вида A. avenae.

В результате такого отбора нами был идентифицирован белок S-box длиной 524 аминокислотных остатка (WP_011796953.1). Этот белок принадлежит домену PAS и участвует в принятии бактерией сигналов, таких как фотоны, молекулы газа и др. Сигнальные домены PAS встречаются у многих организмов, но отличаются высокой вариабельностью (идентичность около 20%) [7]. Белок S-box домена PAS был идентичен во всех 9 штаммах A. citrulli и не имел значительного (согласно вышеупомянутому критерию в 70% идентичности) сходства с другими белками.

Кодирующая последовательность A. citrulli штамма AAC00-1 # 5596 (NZ_QUNC01000001.1), соответствующая белку WP_011796953.1 (locus_tag=«C8E07_ RS00895»), была в дальнейшем использована для разработки праймеров. Были подобраны следующие праймеры на ген S-box PAS домена (локус C8E07_ RS00895) A. citrulli штамма AAC00-1 #5596 (NZ_ QUNC01000001.1) (табл. 2).

В ходе оценки специфичности ПЦР-РВ были получены положительные результаты реакции со всеми 6 штаммами A. citrulli. Проведение реакции с 188 нецелевыми бактериальными изолятами показало отрицательные результаты. Таким образом, новый метод

ПЦР-РВ, основанный на нуклеотидной последовательности гена S-box PAS домена, позволяет проводить выявление и идентификацию A. citrulli, избегая перекрестных реакций с нецелевыми бактериями.

Заключение

В данном исследовании методом кластеризации белковых последовательностей геномов A. citrulli и A. avenae были получены 153 белковых кластера, присутствующих только в штаммах A. citrulli. После анализа полученных кластеров на предмет их специфичности для A. citrulli нами был идентифицирован белок S-box PAS домена. Кодирующая последовательность, соответствующая данному белку, была использована для подбора праймеров и зонда. В результате оценки специфичности нового метода ПЦР-РВ было установлено, что тест подходит для обнаружения и идентификации всех штаммов A. citrulli и не приводит к получению ложноположительных реакций с нецелевыми бактериями. Использование нового метода ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli, основанного на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS, позволит быстро проводить тестирование здоровья продукции тыквенных культур в условиях рутинной диагностики.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Информация о соблюдении стандартов работы с животными: настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Информация об исследованиях, где в качестве объектов выступали люди: настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Финансирование. Отсутствует.

The authors declare no conflicts of interest.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Yang R, Garcia DS, Pérez Montaño F, Mateus da Silva G, Zhao M, Jiménez Guerrero I, et al. Complete assembly of the genome of an Acidovorax citrulli strain reveals a naturally occurring plasmid in this species. Front. Microbiol. 2019;10:1400.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01400

2. European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO), Acidovorax citrulli. Categorization. 2020. https://gd.eppo.int/taxon/PSDMAC/categorization

3. Islam MR, Hossain MR, Kim HT, Jesse DMI, Abuyusuf M, Jong HJ, et al. Development of molecular markers for detection of Acidovorax citrulli strains causing bacterial fruit blotch disease in Melon. Intern. J Mol Sci. 2019;20(11). pii: E2715. https://doi.org/10.3390/ijms20112715

4. Xinyue B, Xiaodong L, Haibo Y, Mengnan A, Rui L, Zihao X, et al. Development of a multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of Cucumber green mottle mosaic virus and Acidovorax citrulli in watermelon. Peer J. 2019;7:e7539.

https://doi.org/10.7717/peerj.7539

5. European and Mediterranean Plant Protection Organization. PM7/127(1) Acidovorax citrulli. EPPO Bulletin. 2016;46(3):444-462. ISSN 0250-8052. https://doi.org/10.1111/epp.12330

6. Slovareva OY, Komev KP, Matyashova GN, Stakheev AA, Prikhodko SI. Recommended procedure for detection and identification Acidovorax citrulli in seeds. AIP Conference Proceedings. 2019;2063:030020. https://doi.org/10.1063/L5087328

7. Nebert DW. Aryl hydrocarbon receptor (AHR): «pioneer member» of the basic-helix/loop/helix per-Arnt-sim (bHLH/PAS) family of «sensors» of foreign and endogenous signals. Prog Lipid Res. 2017;67:38-57. https://doi.org/10.1016Zj.plipres.2017.06.001

Поступила в редакцию 07.02.2020 Received 07.02.2020 После доработки 20.02.2020 Revised 20.02.2020 Принята к публикации 27.02.2020 Accepted 27.02.2020

Поздравление!

Поздравляем с юбилеем заместителя главного редактора журнала

Романову Юлию Михайловну!

Желаем здоровья, творческих успехов, удачи!