ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПШЕНИЦЫ И ЯЧМЕНЯ В РОССИИ Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

MIRJournal

MicrobioLogy Independent Research JournaL

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ

Выявление и идентификация возбудителей бактериальных болезней пшеницы и ячменя в России

О. Ю. Словарева12#

1 ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К. А. Тимирязева», Москва, Российская Федерация

2 ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений», Быково, Московская область, Российская федерация # Для корреспонденции: Ольга Словарева, e-mail: [email protected]

Ключевые слова: экспорт зерна, зерновые культуры, бактериозы зерновых культур, карантин растений DOI: 10.18527/2500-2236-2020-7-1-1-12

Получена 31 декабря 2019 г. Принята к печати 13 февраля 2020 г. Опубликована 2 марта 2020 г.

АННОТАЦИЯ

Экспорт зерна представляет собой важную статью продовольственного бизнеса в России. Импортерами российского зерна являются страны Европы, Азии, Африки и Южной Америки. Каждая страна-импортер предъявляет свои требования к фито-санитарному состоянию ввозимой продукции. Важным требованием импортеров является отсутствие в партиях зерна таких возбудителей бактериальных болезней зерновых культур, как Pectobacterium rhapontici, Rathayibacter tritici, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae pvs., Acidovorax avenae subsp. avenae, Xanthomonas translucens pvs., Rathayibacter rathayi и Pseudomonas cichorii. Достоверная информация о распространении данных видов бактерий на территории Российской Федерации ограничена. Методы выявления и идентификации возбудителей бактериозов на сегодняшний день не разработаны, что повышает риск распространения фитопатогенов, способных нанести существенный экономический вред сельскому хозяйству.

Цель данного исследования состояла в выявлении и идентификации возбудителей бактериальных болезней пшеницы и ячменя. Для этого нами был проведен сбор образцов растительного материала пшеницы и ячменя в Родионово-Несве-тайском, Мясниковском, Зерноградском, Азовском и Мартыновском районах Ростовской области. Представители различных штаммов бактерий были выделены из полученных образцов с использованием соответствующих питательных сред. Тестирование штаммов было проведено методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, разработанных для участка 16S рибосомальной РНК (PSF/PSR и 8UA/519B), и праймеров SyD1/SyD2, подобранных для участка генома Pseudomonas syringae (GenBank CP047267.1), с последующим секвенированием по Сэнгеру.

В результате из проб пшеницы и ячменя были выделены и идентифицированы штаммы следующих бактерий: Curtobacterium sp., Paenibacillus sp., Enterobacteriaceae, Pseudomonas azotoformans, P. poae, P. azotoformans, P. hibiscicola, P. fluorescens, Stenotrophomonas sp., P. syringae pv. syringae, P. syringaepv. atrofaciens, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp. и Pantoea agglomerans.

Detection and identification of wheat and barley phytopathogens in Russia

O. Y. Slovareva12"

1 Russian State Agrarian University - Moscow Agricultural Academy named after K. A. Timiryazev, Moscow, Russian Federation

2 All-Russian Plant Quarantine Center, Bykovo, Moscow Oblast, Russian Federation # Corresponding author: Olga Slovareva [email protected]

Keywords: grain export, grain crops, crop bacteriosis, plant quarantine ABSTRACT

Grain export is an important branch of the food business in the Russian Federation. The countries of Europe, Asia, Africa, and South America are importers of Russian grain. Each importing country has its own requirements for the phytosanitary condition of imported products. One important requirement for importers is the absence of pathogens that can cause bacterial diseases of grain crops, such as Pectobacterium rhapontici, Rathayibacter tritici, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae pvs., Acidovorax avenae subsp. avenae, Xanthomonas translucens pvs., Rathayibacter rathayi, and Pseudomonas cichorii. Reliable information on the distribution of these bacterial strains in the Russian Federation is limited. Methods for the isolation and identification of these

bacterial pathogens have not been developed to date, which increases the risk of the spread of phytopathogens that could cause significant economic harm to agriculture.

The purpose of this study was to isolate and identify the causative agents of bacterial diseases of wheat and barley. In order to do this, we collected samples of plant material of wheat and barley in the Rodionovo-Nesvetaysky, Myasnikovsky, Zernogradsky, Azovsky, and Martynovsky districts of the Rostov Oblast. Various bacterial strains were isolated from the obtained samples using the appropriate cultural media. The strains were tested by polymerase chain reaction (PCR) using primers designed for the 16S ribosomal RNA (PSF/PSR and 8UA/519B) and SyD1/SyD2 primers selected for the Pseudomonas syringae genome (GenBank CP047267.1) with subsequent sequencing according to the Sanger method. As a result, the following bacterial strains were isolated and identified from wheat and barley samples: Curtobacterium sp., Paenibacillus sp., Enterobacteriaceae, Pseudomonas azotoformans, P. poae, P. azotoformans, P. hibiscicola, P. fluorescens, Stenotrophomonas sp., P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. atrofaciens, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp., and Pantoea agglomerans.

ВВЕДЕНИЕ

С 2011 года Россия входит в тройку крупнейших мировых экспортеров продукции зерновых культур, в частности пшеницы и ячменя [1]. В каждой стране, закупающей российское зерно, существуют требования, предъявляемые к качеству ввозимых зерновых культур. Особое внимание уделяется фитосанитар-ному состоянию зерна. Организации по карантину и защите растений в разных странах имеют перечни вредных организмов, рекомендованных для регулирования в качестве карантинных вредных организмов. Список А1 перечня включает карантинные вредные организмы, отсутствующие в данной зоне, а список А2 - карантинные вредные организмы, • присутствующие в данной зоне, но не широко распространенные и служащие объектом официальной борьбы. В Европе такой надзор осуществляет Европейская и Средиземноморская организация по карантину и защите растений (European and Mediterranean Plant Protection organization, EPPO) [2]. В большинстве стран-импортеров российской продукции зерновых культур имеется перечень микроорганизмов, содержание которых в зерне не допускается. Следует отметить, что при указании таксономических названий бактерий могут использоваться синонимы, что затрудняет работу фитосанитарных служб. В перечень бактериальных возбудителей болезней зерновых культур, относящихся к родам Triticum L. (пшени- • ца) и Hordeum L. (ячмень) семейства Poaceae (злаки), включены следующие виды:

• Pectobacterium rhapontici (Millard 1924) Patel & Kulkarni 1951, возбудитель розового бактериоза зерна пшеницы и ржи. Синонимы: Erwinia rhapontici (Millard 1924) Burkholder 1948 [3], Erwinia carotovora var. rhapontici (Millard) Dye [3]. Этот фи-топатоген до настоящего времени не описан на • территории Российской Федерации (РФ). Зерновые культуры не являются основными растениями-хозяевами данной бактерии, тем не менее,

P. rhapontici входит в карантинный перечень стран Восточной и Южной Африки (подкарантинная продукция - пшеница) [2];

• Rathayibacter tritici (Carlson & Vidaver) Zgurskaya, Evtushenko, Akimov & Kalakoutskii, возбудитель

желтого слизистого бактериоза пшеницы. Синонимы: Clavibacter tritici (Carlson & Vidaver) Davis, Gillaspie, Vidaver & Harris, Corynebacterium michiganense pv. tritici (Hutchinson) Dye & Kemp, Corynebacterium tritici (Hutchinson) Burkholder, Phytomonas tritici (Hutchinson) Bergey, Pseudomonas tritici Hutchinson [2]. Бактерия поражает пшеницу [4] и входит в перечень карантинных видов (список А1) в Бразилии, Узбекистане, Греции, Молдавии и странах ЕАЭС, а также находится в карантинном перечне США [2] и Народной Республики Бангладеш [5];

Pseudomonas fuscovaginae (ex Tanii et al. 1976) Miyajima et al. 1983 [3], возбудитель бурой гнили листовой оболочки злаковых культур. Поражает в основном пшеницу, однако в настоящее время считается растительным патогеном и для других злаков, включая кукурузу и сорго [6]. Бактерия находится в списке A1 Египта [7], а также является карантинным видом в Нигерии. Микроорганизм распространен на территории Азии (Япония, Китай, Малайзия, Иран, Филиппины, Непал), Океании (Австралия), Южной Америки (Бразилия), Северной Америки (Мексика) и Африки (Бурунди и Мадагаскар) [8]. Информация о распространении на территории РФ отсутствует. Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (McCulloch) Young, Dye & Wilkie [2], возбудитель базально-го бактериоза пшеницы. Синоним- Pseudomonas atrofaciens (McCulloch) Stevens. В природных условиях, кроме пшеницы, фитопатоген поражает рожь, ячмень и овес. Данные о распространении на территории РФ отсутствуют. Возбудитель является карантинным видом в Мексике [2] и Египте [7]. Pseudomonas syringae pv. coronafaciens (Elliott) Young, Dye & Wilkie, возбудитель ореольного бактериоза ржи. Бактерия может поражать также овес. В фитосанитарных требованиях стран-импортеров подкарантинной продукцией для данного фитопатогена является пшеница. Карантинный вид в Нигерии и Мексике, входит в перечень ограниченно распространенных карантинных видов (список A2) в Восточной и Южной

Африке. Бактерия распространена на территории РФ [2].

Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall 1902 [2], возбудитель базального ожога. Может поражать растения различных видов, включая злаковые. Точные данные о распространении на территории РФ отсутствуют. Входит в список A1 в Бразилии и A2 - в Иордании, а также в карантинный перечень Мексики [2];

Acidovorax avenae subsp. avenae (Manns 1909) Willems et al. 1992 [9], возбудитель бактериальной полосатости листьев. Синонимы: Pseudomonas avenae subsp. avenae Manns 1909, Acidovorax avenae (Manns) Willems, Goor, Thielemans, Gillis, Kersters & De Ley. Бактерия может вызывать болезни у многих растений, имеющих экономическое значение, включая рис, кукурузу, овес, сахарный тростник, просо и лисохвост [10, 11]. Карантинный вид в Египте [7] и Марокко, входит в список A2 в Восточной и Южной Африке, при этом подкарантин-ной продукцией является пшеница. Считается, что на территории РФ бактерия отсутствует [2]; Xanthomonas translucens pv. cerealis (Hagborg) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings, возбудитель черного бактериоза ржи. Синонимы: Xanthomonas campestris pv. cerealis (Hagborg) Dye, Xanthomonas translucens f. sp. cereal Hagborg. Поражает такие злаки, как пшеница, рожь, ячмень и овес. Точные данные о распространении в РФ отсутствуют. Карантинный вид в Мексике [2]; Xanthomonas translucens pv. translucens (Jones, Johnson & Reddy) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings, возбудитель черного бактериоза ячменя. Название этой бактерии имеет множество синонимов: Pseudomonas translucens (Jones, Johnson & Reddy) Stapp, Xanthomonas campestris pv. hordei (Hagborg) Dye, Xanthomonas campestris pv. translucens (Jones, Johnson & Reddy) Dye, Xanthomonas translucens (Jones, Johnson & Reddy) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings, Xanthomonas translucens pv. hordei (Hagborg) Dye. Основным растением-хозяином является ячмень. Патоген может поражать рожь и пшеницу, а также травы: тимофеевку луговую, бромус и пырей ползучий. Считается, что бактерия распространена на территории РФ. Карантинный вид в Марокко и Нигерии, входит в список A2 в Иордании и Турции [2]; Xanthomonas translucens pv. graminis (Egli, Goto & Schmidt) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings, возбудитель бактериального увядания зерновых культур. Синонимы: Xanthomonas campestris pv. graminis (Egli, Goto & Schmidt) Dye, Xanthomonas graminis Egli, Goto & Schmid. Поражает злаки, включая пшеницу, рожь и ячмень. Из дикорастущих видов может поражать ежу сборную. Фитопа-тоген встречается в Европе (Франция, Германия, Швейцария, Великобритания) [2]. Точные данные о распространении на территории РФ отсутствуют. Карантинный вид в Египте [7];

• Xanthomonas translucens pv. undulosa (Smith, Jones & Reddy) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings [2], возбудитель черного бактериоза пшеницы. Синонимы: Phytomonas translucens var. undulosa Stapp, Xanthomonas campestris pv. undulosa (Smith, Jones & Reddy) Dye, Xanthomonas translucens f. sp. undulosa. Считается, что патоген распространен по всему миру, поражает пшеницу и ячмень [12]. Входит в карантинный перечень Нигерии.

• Rathayibacter rathayi (Smith) Zgurskaya, Evtushenko, Akimov & Kalakoutskii, смолистый бактериоз. Синонимы: Corynebacterium michiganense pv. rathayi (Smith) Dye & Kemp, Corynebacterium rathayi (Smith) Dowson, Phytomonas rathayi (Smith) Bergey et al. Бактерия поражает рожь, пшеницу, а также ежу сборную. Данный вид распространен во многих странах Европы (Австрия, Кипр, Дания, Германия, Норвегия, Румыния, Швеция, Великобритания), однако считается, что в РФ он отсутствует. Входит в список A1 в странах Южной Африки [2].

• Pseudomonas cichorii (Swingle) Stapp, возбудитель бактериального ожога различных сельскохозяйственных культур. В большей степени поражает салат [13], однако для стран-импортеров под-карантинной продукцией является в том числе и пшеница [7]. Синонимы: Phytomonas cichorii, Pseudomonas endiviae, Pseudomonas papaveris. Бактерия широко распространена на всех континентах. Входит в карантинный перечень Мексики, в список А1 в Египте и А2 - в Иордании [2]. Возбудители бактериозов зерновых культур, кроме Rathayibacter tritici, не являются карантинными видами в РФ, в связи с чем исследования с целью их выявления не проводились, и достоверные данные об их распространении на территории РФ отсутствуют. Кроме того, отсутствует методика диагностики ряда бактериальных фитопатогенов зерновых культур. Соответственно, выявление возбудителей бактериозов (за исключением Rathayibacter tritici) в партиях как экспортируемого, так и импортируемого зерна в РФ на сегодняшний день не проводится, что приводит к высокому риску проникновения на территорию РФ фитопатогенов, способных нанести существенный экономический вред сельскому хозяйству.

Таким образом, разработка методов диагностики фитопатогенов зерновых культур является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования состояла в выделении и идентификации возбудителей бактериальных болезней пшеницы и ячменя для установления фитосанитарного состояния российской продукции зерновых культур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор материала

Всего было обследовано 1720 га посевных площадей, из них 1536 га - озимая пшеница, 184 га - ячмень. Во время проведения обследования растения озимой

пшеницы и ячменя находились в фазе колошения. В первую очередь осматривали растения с симптомами пятнистости, наличия штрихов и полос, а также признаков увядания и деформации листьев. Подобные симптомы встречаются, например, при заболеваниях, вызванных бактериями Pseudomonas syringae pvs. Обращали также внимание на наличие тли, которая является потенциальным переносчиком бактерий Xanthomonas translucens pvs. [14]. Особое внимание уделяли растениям с наличием гнили и хлоротично-некротичными полосами на листьях, так как подобные симптомы могут быть вызваны X. translucens pv. translucens [15]. Растения с механическими повреждениями также отмечали, поскольку повреждения могут способствовать проникновению патогенных бактерий, например, X. translucens pv. graminis, в ткани протоксилемы, откуда возбудитель впоследствии мигрирует в сосудистую ткань [16]. С каждого участка отбирали один образец вегетативных частей растений зерновых культур с соответствующими симптомами, добавляя при этом к образцу достаточное количество здоровой ткани тех же растений. Сбор и упаковка образцов были организованы так, чтобы предотвратить повреждения, контакт с другими образцами и контаминацию. Листья и стебли перекладывали фильтровальной бумагой и помещали в контейнеры с отверстиями для доступа воздуха. До проведения исследования образцы хранили при температуре от 2 до 8°С.

Подготовка аналитических проб

В лаборатории получали суспензии микробиоты образцов (аналитические пробы). Отбор проб проводили из участков на стыке симптоматической и здоровой тканей. От каждого образца отбирали лабораторную пробу массой от 1.0 до 2.5 г и помещали в емкость объемом 100 мл. Взвешивание проб проводили на лабораторных электронных весах (AJH-4200CE, Vibra, Япония). К лабораторным пробам добавляли фосфатно-солевой буфер (PBS) [17] в соотношении 20:1, после чего пробы подвергали интенсивному встряхиванию на ротационном шей-кере Unimax 2010 (Heidolph, Германия) при режиме 200 об/мин в течение 45-60 мин. Экстракт отделяли от примесей растительных тканей безнапорной фильтрацией с использованием фильтров обеззоленных «Синяя лента», размер пор 3-5 мкм. Полученные экстракты центрифугировали 10 мин при 4° (10 000 g, Allegra X-30R, Beckman Coulter, Дания). Сразу после центрифугирования супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 1 мл PBS. Полученную суспензию использовали для выделения бактерий.

Изоляция бактерий

Выделение культур проводили на средах CRL, CRL.2 и mCRL.2. Среда CRL содержала следующие компоненты: пептон 12.0 г, глицерин 10.0 г, агар 18.0 г, MgSO4 0.7 г, K2HPO4 2.0 г, KH2PO4 2.0 г, глюкозу 2.5 г, дрожжевой экстракт 2.0 г, мясной пептон 2.0 г,

сахарозу 15.0 г, NaCl 2.0 г, CaCO3 20.0 г (реактивы производства PanReac AppliChem, Испания) на 1 л дистиллированной воды. Среда CRL.2 состояла из тех же компонентов, за исключением CaCO3. Все ингредиенты перемешивали, доводили рН 20%-м раствором соляной кислоты до 7,0-7,2 с помощью рН-метра (МР 220, Mettler Toledo, Швейцария) и стерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин (автоклав MLS-3020U, Sanyo, Япония). Для получения среды mCRL.2 к среде CRL.2 после стерилизации и охлаждения до 50° добавляли спиртовой (70%) раствор ци-клогексимида до его конечной концентрации 200 мг на 1 л среды и водный раствор 2,3,5-трифенилтетра-золия хлористого (ТТХ) до конечной концентрации 50 мг на 1 л среды.

Аналитические пробы использовали для приготовления серии десятикратных разведений в PBS. Разведения 10-3 и 10-4 в объеме 100 мкл высевали с помощью шпателя Дригальского на чашки Петри со средой mCRL.2, используя метод растяжения на 2 чашки в двух повторах (4 чашки на каждый образец). После посева чашки Петри плотно оборачивали герметизирующей пленкой «Parafilm» и выдерживали при температуре +25° в инкубаторе (MIR-254, Panasonic Healthcare Co., Япония) в течение пяти суток. По истечении этого срока проводили отбор колоний различных морфотипов. Отдельные колонии пересевали на чашки Петри со средами CRL и CRL.2 с помощью бактериологической петли для получения чистой культуры бактерий. Чашки, обернутые пленкой «Parafilm», инкубировали при температуре +25° в течение 72 ч. Затем с помощью бактериологической петли отбирали отдельные колонии и помещали в микропробирки с 200 мкл PBS.

ПЦР и секвенирование

Для лизирования клеток пробы инкубировали 10 мин при 96°, после чего охлаждали в морозильной камере в течение 5 мин. Полученный препарат использовали для проведения ПЦР, которую проводили в несколько этапов. На первом этапе ДНК всех изолятов тестировали методом классической ПЦР с праймера-ми PSF/PSR (PSF 5'-AGC CGT AGG GGA ACC TGC GG-'3, PSR 5'- TGA CTG CCA AGG CAT CCA CC-'3), специфичными к роду Pseudomonas. В качестве положительного контроля использовали штаммы Pseudomonas syringae pv. syringae, полученные из венгерской коллекции AOBC PPSCD. Для приготовления реакционной смеси на одну реакцию использовали 16.0 мкл деионизированной воды, 5.0 мкл мастер-микс 5X MasDDTaqMIX-2025 (ЗАО «Диалат», Россия) и по 1.0 мкл каждого праймера в концентрации 10 пмоль. Для проведения реакции использовали 2 мкл ДНК. Итоговый объем - 25 мкл. Амплификацию проводили в следующем режиме: начальная денатурация 95° -10 мин, затем 25 циклов: 95° - 20 с, 64° - 15 с, 72° -15 с; финальная элонгация 72° - 2 мин.

Изоляты, отрицательные в ПЦР с праймерами PSF/PSR, тестировали повторно в ПЦР с универсальными праймерами 8UA/519B, специфичными

к участку 16S-23S рибосомальной РНК (рРНК) (8UA: 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3', 519B: 5'-GTA TTA CCG CGG CKG CTG-3'). Размер продукта амплификации - 500 п.о. Праймеры заказывали в ООО «Евроген» (РФ). Для приготовления реакционной смеси для одного образца использовали 14 мкл деионизирован-ной воды, 5 мкл мастер-микс 5X MasDDTaqMIX-2025 (ЗАО «Диалат», РФ), по 2 мкл каждого праймера в концентрации 10 пмоль. Затем в микропробирку вносили 2 мкл ДНК-матрицы образца. Итоговый объем - 25 мкл. Режим амплификации: начальная денатурация 96°С - 10 мин, затем 35 циклов: 95 °С - 15 с, 55°С

- 30 с, 72° - 30 с; финальная элонгация 72° - 10 мин.

Изоляты, положительные в тесте с праймерами PSF/PSR, далее анализировали с праймерами SyD1/ SyD2 (SyD1 5'-CAGCGGCGTTGCGTCCATTGC-3', SyD2 5'-TGCCGCCGACGATGTAGACCAGC-3'), специфичными к Pseudomonas syringae pv. syringae. В качестве положительного контроля также использовали штаммы Pseudomonas syringae pv. syringae. Для приготовления реакционной смеси для одной реакции использовали 17.4 мкл деионизированной воды, 5 мкл мастер-микс 5X MasDDTaqMIX-2025 (ЗАО «Диалат», Россия), по 0.3 мкл каждого праймера в концентрации 10 пмоль. В каждую пробирку вносили 2 мкл ДНК образца. Итоговый объем - 25 мкл. Программа амплификации: начальная денатурация 95° - 10 мин, затем 25 циклов: 95° - 20 с, 64° - 15 с, 72° - 45 с; финальная элонгация 72° - 7 мин.

Для проведения всех ПЦР-реакций использовали амплификатор Bio-Rad T100 Thermal Cycler (BioRad, США). Определение продуктов реакции проводили в 1.5%-м агарозном геле, используя источник питания для электрофореза Power Pac HV и Bio-Rad Imaging System (Bio-Rad, США).

Для каждого образца, положительного в одном из тестов, проводили идентификацию методом сек-венирования по Сэнгеру [18]. Для этого ампликоны, полученные методом ПЦР, очищали при помощи DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Затем в каждом образце, содержащем очищенные ампликоны, проводили измерение концентрации ДНК, используя спектрофотометр NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрацию ДНК каждого образца доводили до рабочей, исходя из длины продукта амплификации на электрофореграмме (длина продукта, деленная на 100). Для разведения использовали воду. Затем проводили амплификацию, используя набор Big Dye Kit (Thermo Fisher Scientific, США); данный набор содержит меченые dNTP для получения меченой цепи. Состав реакционной смеси для одной реакции: 1 мкл Big Dye 3.1, 1.5 мкл Big Dye buffer, 2 мкл праймера (прямого или обратного) в концентрации 0.8 пмоль, 4.5 мкл воды, 1 мкл ДНК. Режим амплификации: 96° - 1 мин, затем 25 циклов 96° - 10 с, 50°

- 5 с, 60° - 4 мин. После амплификации очищали ДНК, используя BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции

производителя. Затем по 25 мкл очищенной ДНК вносили в лунки секвенатора АВ-3500 (Applied Biosystems, США). Программу секвенирования выбирали исходя из длины фрагментов. Результаты обрабатывали с помощью программы BioEdit. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями бактерий, размещенными в GenBank, с помощью сервиса BLAST [19].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация бактериальных изолятов

Объектами исследования являлись бактериальные изоляты, выделенные из образцов пшеницы и ячменя. Отбор образцов растительного материала проводили в мае 2019 года в Родионово-Несветайском, Мясниковском, Зерноградском, Азовском и Мартыновском районах Ростовской области (Рис. 1). Отбирали растения с симптомами заболевания (пятнистость, наличие штрихов и полос) (Рис. 2). Информация об обследованных сортах с указанием площадей под посевами представлена в Таблице 1. Всего было отобрано 22 образца. В процессе выделения бактериальных культур на питательной среде mCRL.2 были получены колонии различных морфо-типов (Рис. 3). Для ПЦР-тестов и идентификации было отобрано 116 колоний.

Чтобы выбрать изоляты, принадлежащие роду Pseudomonas, ДНК всех изолятов тестировали методом ПЦР с праймерами PSF/PSR, специфичными к данному роду [20]. В результате тестирования были получены продукты амплификации длиной от 420 до 750 п.о. для 43 образцов ДНК бактериальных изолятов из 116 (Рис. 4А). В 31 случае из 43 длина продукта амплификации составляла 600 п.о., что соответствовало положительному контролю (Рис. 4Б).

Пробы, выделенные из 73 бактериальных изолятов, показавших отрицательный результат при тестировании с праймерами PSF/PSR, далее анализировали в ПЦР с универсальными праймерами 8UA/519B, специфичными к участку 18S-23S рРНК [21]. Полученные продукты амплификации имели длину 500 п.о. (Рис. 4В). Пробы, выделенные из 43 бактериальных изолятов, положительных при тестировании с прай-мерами PSF/PSR, далее анализировали с праймерами SyD1/SyD2, специфичными к Pseudomonas syringae pv. syringae [20]. В результате были получены фрагменты длиной 1100 п.о., соответствующие положительному контролю, для 7 образцов (Рис. 4Г).

Таким образом, для идентификации методом сек-венирования было получено 43 образца продуктов амплификации с праймерами PSF/PSR, 73 - с праймерами 8UA/519B и 7 - с праймерами SyD1/SyD2. Результаты изучения состава бактериальных изоля-тов, идентифицированных методом секвенирования указанных продуктов амплификации, представлены в Таблице 2.

Рис. 1. Карта Ростовской области. Голубым цветом обозначены районы проведения обследования посевов зерновых культур.

Таблица 1. Характеристика обследованных площадей, засеянных озимой пшеницей и ячменем в районах Ростовской области

Район Культура Сорт Площадь (га)

Родионово-Несветайский Ячмень яровой Леон 18

Пшеница озимая Калым 47

Алексеич 50

Тарасовская 70 57

Мясниковский Пшеница озимая Безостая 100 168

Калым 146

Лидия 90

Баграт 88

Ячмень озимый Достойный 15

Эспада 15

Зерноградский Пшеница озимая Табор 100

Танаис 81

Таня 252

Табор 114

Баграт 110

Азовский Пшеница озимая Сила 69

Васса 42

Стан 46

Юкка 42

Гром 16

Ячмень озимый Тимофей 136

Мартыновский Пшеница озимая Баграт 18

Рис. 3. Колонии бактерий различных морфотипов, полученные на среде mCRL.2. Колонии получены через 72 ч после посева суспензии микробиоты.

Уо!ите 7 ЫитЬег 1 2020

7

т1г-]оигпа1.ога

к

Рис. 4. Продукты ПЦР, полученные для изученных образцов в агарозном геле. (A) Продукты ПЦР, полученные с праймерами PSF/PSR для образцов бактериальных изолятов. (Б) Продукты ПЦР, полученные с праймерами PSF/PSR, соответствующие роду Pseudomonas (600 п.о.). (В) Продукты ПЦР, полученные с праймерами 8UA/519B (500 п.о.). (Г) Продукты ПЦР, полученные с праймерами SyD1/SyD2. Проба положительного контроля на Рис. 4 Б, В находится в первой лунке.

Таблица 2. Бактерии, выявленные на исследуемых образцах озимой пшеницы и ячменя и идентифицированные с помощью ПЦР с последующим секвенированием

Культура Сорт Бактерии, идентифицированные в ПЦР с соответствующими праймерами

PSF/PSR 8UA/519B SyD1/SyD2

Ячмень яровой Леон Pseudomonas sp. Pantoea agglomerans, Enterobacteriaceae, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp. P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. atrofaciens

Пшеница озимая Калым Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

Алексеич P. fluorescens, P. poae, Pseudomonas sp.

Тарасовская 70 Pseudomonas sp.

Пшеница озимая Безостая 100 Pseudomonas sp. Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

Калым Curtobacterium sp., Pseudomonas sp.

Лидия Pseudomonas sp.

Баграт

Ячмень озимый Достойный Pseudomonas sp.

Эспада

Пшеница озимая Табор P. fluorescens, Pseudomonas sp. Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

Танаис Pseudomonas sp.

Таня

Табор P. fluorescens, Pseudomonas sp.

Баграт Pseudomonas sp.

Пшеница озимая Сила Pseudomonas sp. Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

Васса

Стан

Юкка P. hibiscicola, Pseudomonas sp.

Гром Pseudomonas sp.

Ячмень озимый Тимофей P. azotoformans, Pseudomonas sp. Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

Пшеница озимая Баграт Pseudomonas sp. Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp., Pantoea sp.

В результате секвенирования продуктов амплификации с праймерами PSF/PSR идентифицированы следующие бактериальные изоляты:

• Pseudomonas fuorescens (из образца озимой пшеницы сорта Алексеич Родионово-Несветайского района, а также образца озимой пшеницы сорта Табор Зерноградского района). Колонии бактерии на питательной среде mCRL.2 были круглые с неровными краями, 0.02 мм в диаметре, белого цвета;

• P. poae (из образца озимой пшеницы сорта Алексеич). Культура на среде mCRL.2 представляла собой круглые колонии правильной формы розового цвета, 0.05 мм в диаметре.

• Curtobacterium sp. (из образца озимой пшеницы сорта Калым Мясниковского района). Культура на среде CRL.2 имела плоские желто-бежевые колонии неровной формы, 1.0 мм в диаметре. На среде CRL колонии были ярко-оранжевого цвета;

• P. azotoformans (из образца озимого ячменя сорта Тимофей Азовского района). На среде CRL колонии бактерии были молочно-белые, неровной формы, выпуклые, до 5.0 мм в диаметре;

• P. hibiscicola (из образца озимой пшеницы сорта Юкка Азовского района). На среде CRL колонии культуры были матовые, кремово-желтые, выпуклые, круглые с ровными краями, от 1.0 до 5.0 мм в диаметре.

Другие продукты амплификации, полученные с праймерами PSF/PSR, путем сравнения с последовательностями, размещенными в GenBank, идентифицированы как Pseudomonas sp.

В процессе анализа нуклеотидных последовательностей, полученных после амплификации с прайме-рами 8UA/519B, были идентифицированы следующие изоляты:

• Pantoea agglomerans (из образца ярового ячменя сорта Леон Родионово-Несветайского района). Колонии данного изолята на среде mCRL.2 были круглые, 4 мм в диаметре, персикового цвета с ярко-малиновым центром. На средах CRL.2 и CRL культура имела колонии желтого цвета, неровные, растекающиеся;

• Enterobacteriaceae (из образца ярового ячменя сорта Леон). На среде mCRL.2 культура имела круглые слабовыпуклые колонии малинового цвета, 3.0 мм в диаметре.

Также во всех образцах пшеницы и ячменя были идентифицированы изоляты, относящиеся к бактериям Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus sp., Erwinia sp. и Pantoea sp.

В результате секвенирования продуктов амплификации, полученных с праймерами SyD1/SyD2, были идентифицированы изоляты Pseudomonas syringae pv. syringae и Pseudomonas syringae pv. atrofaciens в образцах ярового ячменя сорта Леон Родионово-Несветай-ского района и озимой пшеницы сорта Калым Мясниковского района. На средах CRL.2 и CRL культуры данных изолятов имели белые, матовые, растекающиеся колонии неровной формы, характеризующиеся быстрым агрессивным ростом (Рис. 5).

Рис. 5. Культура P. syringae на среде СЯЬ.2 после инкубирования при 25°С в течение 48 ч.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данном исследовании проведено выделение и идентификация возбудителей бактериальных болезней пшеницы и ячменя. В процессе проведения обследований посевов и сбора образцов озимой пшеницы и ячменя в Родионово-Несветайском, Мясниковском, Зерноградском, Азовском и Мартыновском районах Ростовской области на растениях было отмечено наличие симптомов бактериальных болезней, таких как полосы, пятнистости, хлоротичные и некротические участки тканей. Данные наблюдения позволяют сделать вывод о присутствии на посевах зерновых культур в Ростовской области бактериальных фитопато-генов с высокой вирулентностью.

Для посева бактериальных суспензий использовались три экспериментальные питательные среды. На всех средах отмечался быстрый рост бактерий. Использование среды mCRL.2, содержащей циклогек-симид, позволило избежать зарастания чашек Петри колониями грибов при посеве. При этом данное про-тивомикробное вещество не проявляло бактериоста-тических свойств, что позволило провести выделение максимального числа различных бактерий. Другой компонент среды - водный раствор 2,3,5-трифенил-тетразолия хлористого в концентрации 50 мг/л - позволил окрасить некоторые бактериальные колонии, что упростило описание их морфологии. Использование для культивирования чистых культур сред CRL.2 и CRL показало их перспективность при работе с возбудителями бактериозов зерновых культур.

В процессе проведения ПЦР-теста с праймерами PSF/PSR не были получены продукты реакции длиной 752 п.о., описанные разработчиками праймеров [17]. Данная ПЦР позволяет получать продукты амплификации длиной от 420 до 750 п.о. с различными видами

бактерий рода Pseudomonas. Размер продукта амплификации для положительного контроля ПЦР, P. syringae pv. syringae, составил 600 п.о. В рамках данного исследования идентифицированы бактерии Pseudomonas azotoformans, P. poae, P. hibiscicola и P. fluorescens. Данный тест можно использовать в качестве метода определения псевдомонад среди отобранных колоний.

Использование праймеров 8UA/519B с последующим секвенированием позволило провести идентификацию бактерий, принадлежащих различным родам, таким как Curtobacterium sp., Enterobacteriaceae, Pantoea agglomerans, Stenotrophomonas, Paenibacillus, Bacillus sp., Erwinia sp. и Pantoea sp. Виды, принадлежащие роду Pseudomonas, с помощью данных прай-меров идентифицировать не удалось, так как участок генома, который является мишенью, идентичен у большинства псевдомонад.

Амплификация с ДНК бактерий, принадлежащих виду P. syringae pv. atrofaciens, с праймерами SyD1/SyD2, по данным литературы [17], должна приводить к образованию продукта реакции длиной 558 п.о., однако мы установили, что размер продукта ПЦР составляет 1100 п.о., в том числе и для положительного контроля, P. syringae pv. syringae, что соответствует расположению данных праймеров на участке-мишени последовательности генома P. syringae (с 2966585 по 2967602 п.о., GenBank CP047267.1). Использование данных прай-меров с последующим секвенированием позволило идентифицировать бактерии P. syringae pv. atrofaciens и P. syringae pv. syringae, входящие в карантинные перечни стран-импортеров зерновых культур.

Данные, представленные в Таблице 2, показывают, что каждый образец озимой пшеницы и ячменя содержит в составе своей микробиоты бактерии, принадлежащие родам Pseudomonas, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Bacillus, Erwinia и Pantoea. Среди найденных фитопатогенов бактерии Pseudomonas, Erwinia и Pantoea потенциально могут обладать наибольшей вирулентностью, так как именно данные роды бактерий содержат наибольшее число фитопа-тогенных видов [22]. Это может быть связано с тем, что вышеуказанные бактерии, являясь грамотри-цательными, имеют системы секреции, отличные от имеющихся у грамположительных бактерий [23]. Типы секреции III, IV и VI позволяют грамотрица-тельным бактериям доставлять факторы вирулентности через клеточные мембраны растения-хозяина [24]. Принимая во внимание наличие симптомов бактериальных болезней на посевах озимой пшеницы

и ячменя в период проведения обследования, можно предположить, что выделенные изоляты, такие как P. syringae pvs., являются высоковирулентными в отношении растений-хозяев [22].

Виды фитопатогенных бактерий, входящие в карантинные перечни стран-импортеров, за исключением P. syringae pv. atrofaciens и P. syringae pv. syringae, не были обнаружены в исследованных образцах. Использованные методы идентификации могли быть недостаточными для идентификации некоторых псевдомонад, таких как P. cichorii и P. fuscovaginae, так как при сравнении полученных последовательностей нуклеотидов с последовательностями, размещенными в GenBank, ряд бактерий, идентифицированных как бактерии рода Pseudomonas, не определены до вида.

Тем не менее, использованный подход позволяет сделать вывод об отсутствии в отобранных образцах таких бактерий, как Pectobacterium rhapontici, Rathayibacter tritici, R. rathayi, Acidovorax avenae subsp. avenae и Xanthomonas translucens pvs.

Данные о составе микробиоты пшеницы и ячменя, полученные в результате исследования, могут быть использованы для определения соответствия российской продукции зерна фитосанитарным требованиям стран-импортеров.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор не преследует коммерческих или финансовых интересов.

ЦИТИРОВАНИЕ

Словарева ОЮ. Выявление и идентификация возбудителей бактериальных болезней пшеницы и ячменя в России. MIR J 2020; 7(1), 1-12. doi: 10.18527/25002236-2020-7-1-1-12.

АВТОРСКИЕ ПРАВА

© 2020 Словарева. Эта статья публикуется в свободном доступе в соответствии с лицензией Creative Commons AttributionNonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BY-NC-SA), которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любых носителях при условии, что указываются автор и источник публикации, а материал не используется в коммерческих целях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Развитие российского экспорта. Российский экспортный центр. https://www.exportcenter.ru/ intemational_markets/russian_exports/?sphrase_ id=116943.

2. European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) Global database, 2020. Available: https://gd.eppo.int.

3. Garrity GM, Lilburn TG, Cole JR, Harrison SH, Euzeby J, Tindall BJ. Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea, Release 7.7, 2007. Part 5 -The Bacteria: Phylum "Proteobacteria", Class Gammaproteobacteria, pp. 148-245. Available: http://taxonomicoutline.org/content/7/7/148/pdf.

4. Baek KY, Lee HH, Son GJ, Lee PA, Roy N, Seo YS, Lee SW. Specific and Sensitive Primers Developed by Comparative Genomics to Detect Bacterial Pathogens in Grains. Plant Pathol J 2018; 34(2), 104-112. doi: 10.5423/PPJ.OA.11.2017.0250.

5. Phyto requirements Bangladesh, 2015. Ministry of Bangladesh Foreign Affairs, MOFA/Europe/EE/ Russia/216/15(022). Available: http://www.fsvps.ru/ fsvps-docs/ru/importExport/bangladesh/files/phyto_ requirements_bangladesh.pdf.

6. Patel HK, da Silva DP, Devescovi G, Maraite H, Paszkiewicz K, Studholme DJ, Venturi V. Draft Genome Sequence of Pseudomonas fuscovaginae, a Broad-Host-Range Pathogen of Plants. Journal of Bacteriology 2012; 194(10), 2765-2766. doi: 10.1128/ JB.00341-12.

7. wheat, part 1: general principles for wheat (triticum aestivum l.). Egyptian Organization for Standards & Quality (EOS), Standard No. 1601-1, 2010.

8. Patel HK, Matiuzzo M, Bertani I, Bigirimana VdeP, Ash GJ, Höfte M, Venturi V. Identification of virulence associated loci in the emerging broad host range plant pathogen Pseudomonas fuscovaginae. BMC Microbiology 2014; 14, 274. doi: 10.1186/s12866-014-0274-7.

9. Garrity GM, Lilburn TG, Cole JR, Harrison SH, Euzeby J, Tindall BJ. Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea, Release 7.7, 2007. Part 4 - The Bacteria: Phylum "Proteobacteria", Class Betaproteobacteria, pp. 112-147. Available: http://taxonomicoutline.org/ content/7/7/112/pdf.

10. Xie G, Zhang G, Liu H, Lou M, Tian W, Li B, Zhou X, Zhu B, Jin G. Genome Sequence of the Rice-Pathogenic Bacterium Acidovorax avenae subsp. avenae RS-1. Journal of Bacteriology. 2011; 193(18), 5013-14. doi: 10.1128/JB.05594-11.

11. Chu N, Zhou JR, Fu HY, Huang MT, Zhang HL, Gao SJ. Global Gene Responses of Resistant and Susceptible Sugarcane Cultivars to Acidovorax avenae subsp. avenae Identified Using Comparative Transcriptome Analysis settings. Microorganisms 2020; 8(1), 10. doi: 10.3390/microorganisms8010010.

12. Sharma A, Sharma D, Verma SK. Zinc binding proteome of a phytopathogen Xanthomonas translucens pv. undulosa. Royal Society Open Science 2019; 6(9): 190369. doi: 10.1098/rsos.190369.

13. Komatsu H, Shirakawa T, Uchiyama T, Hoshino T. Chemical structure of cichorinotoxin, a cyclic lipodepsipeptide that is produced by Pseudomonas

cichorii and causes varnish spots on lettuce. Beilstein J Org Chem 2019; 15, 299-309. doi: 10.3762/ bjoc.15.27.

14. Boosalis MG. The epidemiology of Xanthomonas translucens on cereals and grasses. Phytopathology 1952; 42, 387-395.

15. Sands DS, Fourest E. Xanthomonas campestris pv. translucens in North and South America and in the Middle East. Bulletin OEPP/EPPO 1989; 19(1), 127130. doi: 10.1111/j.1365-2338.1989.tb00138.x.

16. Wichmann F, Vorhölter F, Hersemann L, Widmer F, Blom J, Niehaus K, et al. The noncanonical type III secretion system of Xanthomonas translucens pv. graminis is essential for forage grass infection. Mol Plant Pathol 2013; 14(6), 576-88. doi: 10.1111/ mpp.12030.

17. Giovanardi D, Sutton SA, Stefani E, Walcott RR. Factors influencing the detection of Acidovorax citrulli in naturally contaminated cucurbitaceous seeds by PCR-based assays. Seed Science and Technology 2018; 46(1), 93-106. doi: 10.15258/sst.2018.46.1.09.

18. Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 1975; 94(3), 441-8. doi: 10.1016/0022-2836(75)90213-2.

19. Basic Local Alignment Search Tool, 2020. Available: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

20. Kazempour MN, Kheyrgoo M, Pedramfar H, Rahimian H. Isolation and identification of bacterial glum blotch and leaf blight on wheat (Triticum aestivum L.) in Iran. African Journal of Biotechnology 2009; 9(20), 2860-2865.

21. Daffonchio D, Cherif A, Brusetti L, Rizzi A, Mora D, Boudabous A, et al. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera. Appl Environ Microbiol 2003; 69(9), 5128-37. doi: 10.1128/ aem.69.9.5128-5137.2003.

22. Горшков В Ю. Бактериозы растений: молекулярные основы формирования растительно-микробных патосистем. Казань: Изд-во Сергея Бузукина; 2017.

23. Green ER, Mecsas J. Bacterial Secretion Systems -An overview. Microbiol Spectr 2016; 4(1), 1-19. doi: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-2015.

24. El Qaidi S, Scott NE, Hays MP, Geisbrecht BV, Watkins S, Hardwidge PR. An intra-bacterial activity for a T3SS effector. Sci Rep 2020; 10(1), 1073. doi: 10.1038/s41598-020-58062-y.