CC BY
54
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 637.5.04/.07
Новый молокосвертывающий препарат «Протепсин» для создания инновационных технических решений производства здоровых продуктов питания
The new milk the curtailing preparation «Protepsin» for creation of innovative technical solutions of production of healthy food
Профессор Л.В. Антипова, аспирант M.B. Горбунков (Воронежский государственный университет инженерных технологий) кафедра технологии продуктов животного происхождения, тел. (8473)255-27-65 E-mail: [email protected]
Professor L.V. Antipova, Graduate Student M.B. Gorbunkov (Voronezh State University of Engineering Technologies) chair of technology of products of an animal origin, tel. (8473)255-27-65 E-mail: [email protected]
Реферат. Ферментные технологии традиционно используются для переработки молока и побочных продуктов. Вместе с тем проблема остается актуальной из-за дефицита и дороговизны имеющихся ферментных препаратов, большинство из которых импортного производства. Ферментный препарат «Протепсин», производимый в условиях ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (п. Ржавки, Московская область), имеет сходные с сычужным ферментом свойства. Первичная структура представлена преимущественно гидрофобными и дикарбоновыми аминокислотами, молокосвертывающая протеи-наза разрывает пептидные связи, образованные гидрофобными аминокислотами, проявляет активность к животным белкам мясного и молочного происхождения. Идентификация функциональных групп активного центра фермента указывает на важность участия в акте катализа нескольких карбоксильных групп и, возможно, ароматического остатка какой-либо соответствующей аминокислоты. При обработке молока применительно к технологии сыров установлена идентичность продуктов гидролиза с гидролизатом сычужного фермента, что указывает на перспективность препарата в разработке линейки новых здоровых продуктов питания отечественного производства. Может позиционироваться как заменитель сычужного фермента в технологии сыров, творога и других белковых продуктов.
Summary: Fermental technologies are traditionally used for processing of milk and by-products. At the same time the problem remains actual because of deficiency and high cost of the available fermental preparations, the majority from which import production. The fermental preparation «Protepsin» made in the conditions of JSC Plant of Endocrine Enzymes (the item of Rzhavki, the Moscow region) has properties, similar to abomasal enzyme. Primary structure is presented by mainly hydrophobic and dicarbonical amino acids, of milk the curtailing proteinase breaks the peptide links formed by hydrophobic amino acids, shows activity to animal protein of a meat and dairy origin. Identification of functional groups of the active center of enzyme indicates importance of participation in the act of a catalysis of several carboxyl groups and, perhaps, the aromatic rest of any corresponding amino acid. When processing milk in relation to technology of cheeses identity of products of hydrolysis with a hydrolyzate of abomasal enzyme that points to prospects of a preparation in development of a line of new healthy food of a domestic production is established. It can be positioned as substitute of abomasal enzyme in technology of cheeses, cottage cheese and other proteina-ceous products.
(£> АнтиповаЛ.В., Горбунков M.B., 2016
Ключевые слова: «Протепсин», ферментный препарат, протеолитическая активность, молоко-свертывающая активность, переработка белоксодержащего сырья.
Keywords\ «Protepsin», fermentai préparation, proteolytic activity, milk the curtailing activity, procès sing of protein-bearing raw materials.
Несмотря на рост объемов производства ферментных препаратов в мире, в России он явно недостаточен [1, 2, 3]. Однако в последнее время обозначились положительные тенденции в области наращивания объемов и расширения ассортимента биологических катализаторов для различных отраслей промышленности. Особое место отводится продуктам животного происхождения прежде всего из-за ценности белковых комплексов, выполняющих пластические функции в организме. Признавая преимущества биокатализа, следует строго обеспечить полную инактивацию ферментов из-за возможности развития заболеваний пищеварительной системы. В настоящее время на рынке отечественных ферментных препаратов появился «Протепсин», производимый ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (п. Ржав-ки, Московская область).
По данным производителя ферментный препарат проявляет активность к полному спектру белков мяса, являясь синергистом ферментов мышечной ткани. Он рекомендован для ускорения созревания, мягчения мясных тканей, а также при получении гидролизатов с заданным соотношением белковых веществ [4, 5]. В ходе экспериментальных исследований действия препарата на различные белки установлено, что он обладает молокосвертывающей активностью. При исследовании препарата нами установлено, что при электрофоретическом и хроматографическом разделении идентифицируются 4 белковые фракции, две из которых обладают общей протеолитической активностью. Исследование протеолитических фракций путем их выделения из геля после электрофореза на молокосвертывающий эффект показало, что только одна из них обладает молокосвертывающей активностью, что представляет важную информацию в оценке перспектив расширения области применения препарата.
Поскольку структура и функции любого биополимера тесно связаны, на первом этапе определили состав аминокислот как основу первичной структуры белков. При этом электрофоретически гомогенные протеиназы препарата подвергали гидролизу 6 л НС1 в соотношении 1:24 при температуре 105 °С в течение 24 ч. Гидро-лизат упаривали досуха в среде азота, а сухой остаток анализировали на аминоана-лизаторе марки Hd 1200 Е (табл. 1).
Таблица 1
Аминокислотный состав протеиназы I и протеиназы II препарата «Протепсин»
Протеиназа I Протеиназа II
Содержание аминокислот
Название Количество Количество
аминокислоты % остатков на % остатков на
молекулу фермента молекулу фермента
Лизин - - 0,5 1
Гистидин 0,3 1-2 1,1 2-3
Аргинин - - 1,1 1-2
Аспарагиновая кислота 15,1 90 16,2 44-45
Треонин 7,2 40-41 10,9 30-31
Серии 4,6 30-31 5,0 16-17
Глютамин овая 12,6 61-62 9,7 22-23
кислота
Пролин 7,5 47 1,7 5-6
Окончание табл. 1
Протеиназа I Протеиназа II
Содержание аминокислот
Название Количество Количество
аминокислоты % остатков на % остатков на
молекулу фермента молекулу фермента
Глицин 4,5 44-45 6,8 31
Алании 8,2 65-66 6,8 26
Цистин 0,5 2-3 - -
Валин 12,0 71-72 14,2 40-41
Метионин - - 2,0 4-5
Изолейцин 8,0 44 8,6 23-24
Лейцин 5,6 29-30 10,2 27-28
Тирозин 6,0 25-26 6,6 12-13
Фенилаланин 8,2 51-52 11,4 23-24
Полученные результаты свидетельствуют о различиях в числе аминокислотных остатков и наборе аминокислот, входящих в структуру ферментов. Особенно выражены различия в содержании глютаминовой кислоты, пролина, сирина, лейцина, фенилаланина, гистидина, аспарагиновой кислоты. В составе протеиназы I превалируют «кислые» аминокислоты, что, видимо, и определяет более низкий рН оптимума действия этого фермента. Просматривая перспективы препарата как заменителя используемых в молочной отрасли аналогов, предстояло установить структурные особенности более детально.
В расшифровке механизма катализа отправной точкой является идентификация функциональных групп, участвующих в акте катализа. Этот вопрос достаточно глубоко изучен для животных протеиназ, в частности пепсиновых [6, 7], когда установлены функциональные группы каталитического центра, предложены гипотезы и рабочие модели разрыва пептидных связей. В частности, идентификация карбоксильных групп в активном центре ферментов стала возможна с помощью синтетических реагентов - диазосоединений, которые специфически взаимодействуют и блокируют СООН-группу, вызывая интенсивную инактивацию ферментов. Определенную роль в идентификации функциональных групп активных центров могут играть величины рК групп. Однако метод нельзя считать надежным из-за образования множественных ковалентных, ионных или координационных связей и индуктивных воздействий соседних групп, вызывающих значительные колебания величины рК.
Для идентификации функциональных групп в активном центре ферментов необходимо совпадение нескольких независимых экспериментальных критериев. Широко для этой цели используется исследование кривых рН-активности и расчета теплоты ионизации [8]. Результаты графоаналитических расчетов показали, что величины АрКа и АрКб находятся в пределах 0,18-0,20. Такие малые величины характерны для карбоксильных групп, входящих в белки. Близкие значения теплоты ионизации для обеих ветвей кривой рН-активности говорят о возможном наличии в каталитическом центре фермента не одной карбоксильной группы, а нескольких.
В доказательство версии были применены и другие методы. Например, типичной реакцией на имидазол является его фотоокисление в присутствии метиленовой сини. В таких условиях окисление имидазола вызывает резкую инактивацию фермента, аналогично инактивируется фермент, если в активном центре находится триптофан. Исследуемый молокосвертывающий фермент инактивируется при фотоокислении, что доказывает важность для акта катализа ароматических функциональных групп.
Технологии пищевой и пе
ЛПК-прооукты з ±
ывающей промышленности питания, № 1, 2016
Большое значение в идентификации функциональных групп каталитического центра имеет блокировка их специфическими химическими реагентами. В наших опытах в качестве таких реагентов мы использовали ЭДТА, 8-оксихинолин, моной-одуксусную кислоту, п-хлормеркурий-бензонат, глютатион, цистеин, семикарбазид, тиодипропионовую кислоту, тиосульфат натрия, металлический йод, перманганат калия. Растворы протеиназы II, содержащие 5 103 М этих соединений, выдерживали в течение 24 ч. Параллельно ставили контрольные опыты. Активность протеиназы определяли на гемоглобине при рН 3,0 через 0,5; 3 и 24 ч.
Как показали результаты опытов, ЭДТА и 8-оксихинолин не оказывали никакого влияния на активность исследуемого фермента, что говорило об отсутствии в его каталитическом центре какого-либо металла. Не оказывали никакого влияния реагенты на ЭН-группу: п-хлормеркурийбензоат и монойодуксусная кислота. Фермент полностью сохранял свою активность и в присутствии специфических реагентов на дисульфидную группу (цистеина, глютатиона, тиодипропионовой кислоты, тиосульфата натрия). Это свидетельствовало о том, что в каталитическом центре протеиназы II не содержится ЭН-группа, а следовательно, она не является «тиоло-вым» ферментом; протеиназа II не является сериновой, а также она не металлофер-мент.
Иная картина отмечена нами при внесении йода и перманганата калия. За 3 ч активность протеиназы II в присутствии йода снижалась на 50 %, а в случае перманганата калия полностью исчезала. Полученные данные свидетельствовали об участии в акте катализа тирозина и триптофана. Это совпадает с некоторыми экспериментальными данными по ингибированию кислых протеиназ микробного происхождения и пепсина.
К специфическим реагентам относятся и ионы двухвалентных металлов. Известно, что они оказывают ингибирующий или активирующий эффект. Однако данные относительно влияния определенных ионов на активность кислых протеиназ весьма противоречивы. Это, видимо, можно объяснить тем, что кислые протеиназы из различных источников имеют отличия.
В наших опытах мы использовали соли двухвалентных металлов в виде хлоридов в концентрации 5 10 :; М при рН 5,0 в фосфатно-цитратном буфере. Активность фермента определяли на гемоглобине при рН 3,0 через 0,5, 1 и 3 ч. Ионы Ва2+, Сс12+, М§2+, РЬ2+, Мп2+, Си2+, Со2+, Ш2+, Са2+ практически не оказыва-
ли никакого влияния на активность протеиназы II. Лишь в случае Ре3+ наблюдался ингибирующий эффект. За 3 ч инкубации фермент терял до 60 % своей активно-
Известно, что ионы Ре3+ обладают специфически выраженной способностью образовывать прочные внутрикомплексные соединения с тремя карбоксильными группами поликарбоновых кислот. На основании этого можно предположить, что присутствие ионов Ре3+ и лимонной кислоты в виде фосфатно-цитратного буфера вело к образованию аналогичных комплексов и инактивации фермента. Совокупность полученной информации позволяет утвердительно ответить на вопрос о принадлежности фермента к карбоксильным протеиназам.
При оценке гидролитической способности фермента к разрыву определенных пептидных связей в белках, установлено, что фермент в той или иной степени гид-ролизует казеинат натрия и казеин, водо- и солерастворимые белки мяса, коллаген и желатин. Лучшими субстратами были альбумин, гемоглобин, казеин. Максимальная степень гидролиза гемоглобина, определенная спектрофотометрически, составляла 65-68 %. Близко к этому значению был альбумин. Казеин занимал среднее значение между гемоглобином и желатином. При гидролизе синтетических пептидов показано, что фермент имеет сродство с гидрофобными и ароматическими радика-
Технологии пищевой АПК
1щевой и перерабатывающей прол продукты здорового питания, т 1,
омышленности 2016
лами, образующими пептидные связи в белках. Таким образом, молокосвертываю-щий фермент «Протепсин» проявляет определенные сходства с пепсиновой группой ферментов, успешно применяемой в технологии сыров и творога. Представляло интерес провести исследование на молочных субстратах в сравнении с сычужным ферментом для оценки перспектив применения препарата в технологии молочных продуктов, так как препарат «Протепсин» обладает молокосвертывающей активностью и способностью гидролизовать белки молочной сыворотки.
При исследовании влияния внешних факторов на уровень активности ПА и МСА соответственные субстраты нагревали до заданной температуры, а рН -с использованием НС1 при контроле рН потенциометрически или приготовлением субстрата на фосфатном буфере соответствующего рН.
Влияние температуры и рН на МСА препарата «Протепсин» и сычужного фермента представлено на рис.1 и 2.
МСА, %
20 0
25 30 40 45 50 55 60
Рис. 1. Влияние температуры на МСА препаратов: 1 - сычужный фермент; 2 - «Протепсин»
-1-1-1-1-1-1-1-1
5,2 5,4 5,6 5,8 6 6,26,46,66,8
РН
Рис. 2. Влияние рН на МСА препаратов: 1 - сычужный фермент; 2 -«Протепсин»
Как видно из рис. 1, 2, препараты практически идентично реагируют на внешние факторы, что указывает на единую природу происхождения - животные организмы, условия нормального существования которых весьма близки, что поддерживается соответствующими ферментными системами. Препараты слабо проявляют коагулирующие свойства при рН, близких к нейтральному значению, и весьма усиливаются при снижении рН. Температурные оптимумы связаны с физиологическими условиями существования животных организмов и находятся в области 40 °С.
Учитывая чрезвычайно важную роль Са2+ в механизме коагуляции белков молока, представляло интерес провести исследование влияния этих катионов на активность ферментов. При этом пользовались известной информацией К.К. Горбатовой [9] о том, что в процессе свертывания казеина молока различают 3 стадии: первая (ферментативная) связана с протеолитическим воздействием ферментов на молекулу козеина; вторая представляет физико-химический процесс структурооб-разования, которая связана с возникновением кальциевых мостиков между мицеллами казеина; третья связана с медленным протеолизом компонентов казеина под действием протеаз препаратов. От содержания Са 2+ в молоке зависит скорость его свертывания и качество сгустка. Завершающая стадия определяет качество сгустка, хранимость и потребительские свойства продуктов.
Изменение общей иротеолитической активности при рН 6,5 и МСА в зависимости от концентрации ионов Са2+, вносимых в молоко в виде СаСЬ, представлено на рис. 3.
Как видно из рис. 3, при концентрации ионов Са2+ 0,1 г/л МСА обоих препаратов увеличивалась практически одинаково. Концентрация Са2+ 0,2 г/л молока снижала МСА, однако в случае сычужного фермента это снижение происходило более плавно, дальнейшее увеличение в среде ионов кальция к изменению МСА не приводило в обоих случаях.
Иная картина отмечена при исследовании влияния ионов кальция на ПА обоих препаратов (рис. 3). Активность с разной скоростью увеличивалась.
%
120
0
ОД
0,2
0,3
0,4
0,5
•Сычужный фермент ■ Протепсин
■Сычужный фермент2
Са 2+ 2/п
Рис. 3. Влияние Са 2+ на ПА и МСА препаратов «Протепсин» и сычужный фермент
Несмотря на идентичность графиков, следует отметить более высокую чувствительность препарата сычужного фермента к ионам Са2+ как в случае ПА, так и МСА.
Рассматривая перспективу использования препарата «Протепсин» в качестве заменителя сычужного фермента в технологии сыров, весьма важна оценка соотношения ПА и МСА. При изучении этого вопроса ПА определяли в течение 3 ч часов по методу Бенке (Aniso). Величина An iso отражает гидролиз казеина в течение времени формирования сгустка и обработки сырного зерна. Учитывая, что в процессе созревания сыров в классических технологиях рН снижается в среднем до рН 5,5, необходимо учитывать глубину протеолиза и при этом значении рН. Для получения сравнимых результатов предварительно концентрации препаратов выравнивали по времени молокосвертывающей активности к 10 мин свертывания и рассчитывали их активную массу. За единицу активной массы принимали количество препарата, которое вызывало свертывание 50 мл молока при рН 6,5 и 35 °С в течение 10 мин ( табл. 2).
Таблица 2
Сравнительная активность ферментных препаратов
Наименование препарата Среднее время образования сгустка, мин МСА, ед/г Коэффициент разведения Конечное время свертывания молока, мин Активная масса, мг
Сычужный фермент 7,5 53180 1,3 10 7,69
«Протепсин» 5,5 39000 1,8 10 10,3
Как видно из данных табл. 2, «Протепсин» в 1,3 раза активнее свертывает казеин молока. Для выяснения уровня протеолиза препаратов реакцию проводили при рН 6,5 и 5,5. Концентрации ферментных препаратов принимали исходя из активных масс в 100 мл раствора. Протеолиз вели при 35 °С (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительная оценка Aniso ферментных препаратов
Наименование препаратов Aniso . мг разлож. белка Ап.180 «Протепсин»
Ап.180 Сычужный фермент
рН 6,5
Сычужный фермент 22,80-1СИ 3,7
«Протепсин» 84,8-10-4
рН 5,5
Сычужный фермент 50,0-10-4 4,1
«Протепсин» 204,5-10-4
Как видно из данных табл. 3, «Протепсин» в 3,7 раза активнее разлагает казеин при рН 6,5, а при рН 5,5 - в 4,1 раза, чем сычужный фермент.
Таким образом, «Протепсин» активнее, чем сычужный фермент, воздействует на казеин молока, проявляя более глубокий протеолиз белков. Известно, что более глубокий протеолиз не является главным недостатком заменителей сычужного фермента. Гораздо более важна специфичность действия ферментов, особенно в оценке продуктов гидролиза белков.
Для исследования общего количества пептидов и аминокислот использовали методику, разработанную сотрудниками ВНИИМС, когда после гидролитических превращений казеина определяли суммарное количество оставшегося белка, образовавшихся пептидов и аминокислот (табл. 4).
Таблица 4
Характеристика продуктов гидролиза казеина под действием ферментных препаратов
Наименование препаратов I акт. масса, г 25 акт. масс, г Количество разлож. белка, г-% Количество пептидов, Г-% Количество аминокислот, г-%
рН 6,5
Сычужный фермент 0,00769 0,192 0,026 0,015 0,011
«Протепсин» 0,01030 0,257 0,075 0,048 0,053
рН 5,5
Сычужный фермент 0,00769 0,192 0,058 0,024 0,034
«Протепсин» 0,01030 0,257 0,097 0,095 0,083
Как видно из результатов, по глубине гидролиза «Протепсин» более чем в 2 раза превышает сычужный фермент при рН 6,5 и при рН 5,5 за 3 ч гидролиза. Оценка продуктов гидролиза за 24 ч показала, что с течением времени глубина гидролиза приближалась при действии препаратов, что может быть связано с гетерогенностью препарата «Протепсин» и механизмами кислотной инактивации фракций. Во всех случаях можно констатировать преобладание суммарных аминокислот за 24 ч гидролиза и суммарных пептидов за 3 ч гидролиза. Это говорит о том, что ферменты препаратов обладают протеиназной и пептидной активностями.
В оценке специфичности разрыва пептидных связей весьма важна оценка качественного набора аминокислот в гидролизатах субстрата. В опыте отбирали 10 мл гидролизатов казеина под действием ферментных препаратов после 24-часовой инкубации и осаждали в них белки 80 %-ным этанолом. Осадок отделяли ценрифугированием. Центрифугат оставляли в холодильнике на сутки. Дополнительно образовавшийся осадок отфильтровывали через бумажный фильтр. Полученный фильтрат упаривали досуха на водяной бане. В остаток добавляли 5 мл дистиллированной воды и вносили 3,6 мл 60 %-ной салициловой кислоты. Смесь настаивали в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем вторично упаривали досуха. Полученный сухой остаток аминокислот хроматографировали на автоматическом аминоанализаторе. Аналогичные действия проводили с контрольными образцами (табл. 5).
Таблица 5
Аминокислотный состав гидролизатов казеина при действии ферментных препаратов
Аминокислоты Количество аминокислот, мг-%
Сычужный фермент «Протепсин»
pH pH
6,5 5,5 6,5 5,5
Глютаминовая кислота 4,89 17,50 9,50 27,68
Глицин 1,98 2,75 2,22 13,00
Алании - - - 9,90
Цистин - - - -
Валин 0,76 3,74 26,80 58,76
Фенилаланин 4,26 12,42 14,96 68,38
Лейцин - - - 6,20
Сумма 10,12 36,41 53,48 183,92
Как свидетельствуют полученные данные, у «Протепсина», вероятно, более широкая субстратная специфичность, так как гидролизат казеина при действии ферментов препарата обогащен более широким набором аминокислот. Весьма важно, что в гидролизатах обоих препаратов превалируют фенилаланин, валин, глютами-новая кислота. Видимо, специфичность действия ферментов препаратов имеет общие черты.
Полученные данные свидетельствуют о реальной перспективе использования препарата «Протепсин» в технологиях, где он может быть предложен как заменитель сычужного фермента. Учитывая отсутствие необходимости использования ад-дитивов и химических сред, следует рассматривать возможность создания линейки здоровых продуктов питания на молочной основе для различных физиологических групп и социальных слоев населения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Frost & Sullivan: Обзор рынка биотехнологий в России и оценка перспектив его развития / РВК, 2014.- 70 с.
2. Производство мясной продукции на основе биотехнологии [Текст]: учеб. для вузов / A.B. Лисицын [и др.] / под общей ред. академика Россельхозакадемии H.H. Липатова,- М.: ВНИИМП, 2005.- 369 с.
3. Жаринков, А.И. Пищевая биотехнология: научно-практические решения в АПК [Текст]: учеб. для вузов / А.И. Жаринков, И.Ф. Горлов.- М.: Вестник РАСХН, 2007,- 476 с.
4. Antipova, L.V. The experience of enzyme preparation application in the processing of animal origin raw materials [Text] / L.V. Antipova, M.V. Gorbunkov, S.A. Sto-rublevtsev / / Europen Journal of Natural History.- 2015. -№ 2.- P. 42-43.
5. Антипова, А.В. Свойства коммерческого ферментного препарата «Про-тепсин» [Текст] / Л.В. Антипова, М.В. Горбунков // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий.- 2013.- № 4.- С. 145-147.
6. Coker A., Cooper J.B. Human pepsin ЗВ. Resolution: 2.61 А / PDBID: 3VTL / Feb. 28, 2014.
7. Dutta S., Choudhury D., Roy S. Crystal structure of 186 F mutant of papain. Resolution: 198 A / 2014 -07-02/ RDBID: 4 QRV/Aug. 4, 2015.
8. Изучение физико-химических и кинетических свойств комплексного ферментного биопрепарата [Текст] / А.И. Сливкин [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация.- 2015.- № 2. -С. 120-123.
9. Горбатова, К.К. Биохимия молока [Текст] / К.К. Горбатова.- СПб.: Гиорд, 2013.- 428 с.
REFERENCE
1. Frost & Sullivan: The review of the market of biotechnologies in Russia and an assessment of prospects of its development / RVK, 2014. - 70 p.
2. Production of meat production on the basis of biotechnology: studies, for higher education institutions [Text]/ A.B. Lisitsyn [etc.] / under the general editorship of the academician Rosselkhozakademiya N.N. Lipatov.- Moscow, 2005. - 369 p.
3. Zharinkov, A.I. Food biotechnology: scientific and practical decisions in agrarian and industrial complexes [Text]: studies, for higher education institutions / A.I. Zharinkov, I.F. Gorlov. - Moscow, 2007. - 476 p.
4. Antipova, L.V. The experience of enzyme preparation application in the processing of animal origin raw materials [Text] / L.V. Antipova, M.V. Gorbunkov, S.A. Storublevtsev // Europen Journal of Natural History.- 2015.- № 2.- P. 42-43.
5. Antipova, L.V. Properties of the commercial fermental preparation «Protepsin» [Text] / L.V. Antipova, M.V. Gorbunkov // Bulletin of the Voronezh state university of engineering technologies.- 2013.- № 4.- P. 145-147.
6. Coker A., Cooper J.B. Human pepsin 3B. Resolution: 2.61 A / PDBID: 3VTL / Feb. 28, 2014.
7. Dutta S., Choudhury D., Roy S. Crystal structure of 186 F mutant of papain. Resolution: 198 A / 2014 -07-02/ RDBID: 4 QRV/Aug. 4, 2015.
8. Studying of physical and chemical and kinetic properties of a complex fermental biological product [Text] / A.I. Slivkin [etc.] / /Bulletin of the Voronezh state university. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy. - 2015.- № 2.- P. 120-123.
9. Gorbatova, K.K. Biochemistry of milk [Text] / K.K. Gorbatova.- St. Peterburg, 2013.- 428 p.
