CC BY
41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
25
вано 99 цитологических препаратов, приготовленных из операционного материала больных (РМЖ). Уровень РЭ также был определен биохимическим методом во всех случаях. В работе использованы моноклональные антитела IC0211, полученные в Онкологическом центре, коммерческие моноклональные антитела к РЭ клон 1D5 (Dako).
Результаты исследования. Реактивность антител IC0211 сравнилискоммерческимиантителамикРЭ.Были исследованы 30 опухолей молочных желез, клеточная линия MCF7, которая является гормонзависимой, и линия клеток рака молочной железы T47D, гормоннезави-симая. Антитела IC0211 и 1D5 окрашивали ядра опухолевых и нормальных клеток молочной железы с различной интенсивностью. Интенсивность окраски различалась нетолько впределах одного окрашиваемого образцатка-
ни, но даже в оцениваемом поле зрения, независимо от метода определения РЭ (ИГХ или ИЦХ). Количество окрашенных клеток ткани РМЖ было примерно одинаковым. Коэффициент корреляции имел высокое значение (г=0,94; р<0,001). Рисунок окрашивания клеток линии MCF7 антителами IC0211 и 1D5 был одинаковым. Клетки линии T34D не окрашивались названными антителами. Проведенный сравнительный анализ уровня РЭ, определяемого биохимическим методом и ИГХ, показал умеренную корреляцию между этими методами (г=0,49; р<0,05). Корреляционный анализ между биохимическим методом определения РЭ и ИЦХ также показал высокую степень корреляции методов (г=0,72; р<0,05).
Выводы. ИГХ или ИЦХ окрашивание может быть использовано для определения уровня экспрессии РЭ.
НОВЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПОЛИФЕНОЛОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИДРОФОБНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ФЕНИЛ-АГАРОЗЕ
В настоящее время доказано, что низкополимерные полифенолы многолетних растений являются «мягкими», но эффективными антиоксидантами, отличающимися цитостатическими свойствами благодаря их ингибирующему воздействию на гиперактивное окислительное фосфорилирование в митохондриях клеток ряда опухолей, таких как вызываемый этил-тиомочевиной гепатоцеллюлярный рак и продуцирование а-фетопротеин гепатокарциномы [Leder, Waugh; Pitot, 2003].
Однако значительная техническая сложность всех известных методик хроматографической очистки полифенолов, т.е. многоэтапных и затратных процедур, является серьезным препятствием на пути широкого использования этих соединений в исследованиях канцерогенеза. Это определяет несомненную важность такой задачи, как создание простого и, насколько возможно, быстрого метода полной и щадящей очистки фракции полифенолов из стандартизированного лекарственного растительного сырья.
Для решения этой задачи мы использовали колоночную гидрофобную хроматографию низкого давления на 6 %-ной поперечно-сшитой фенил-агарозе с диаметром матричных пор 20-40 мкм. Геометрия колонки: 1,2x12,0 см, скорость элюции - 1,0 мл/млн, + 22-25 °С. После нанесения 0,8-0,9 мл образца на колон-
А.А. Маркарян ММ А им. И. М. Сеченова, Москва
ку, уравновешенную 10 мМ калий-фосфатным буфером (pH 6,35), подавали линейный 500-50 мМ понижающийся градиент концентраций №01. Исходным сырьем служил сухой экстракт Фитопрост, полученный из многокомпонентной растительной смеси и зарегистрированный в России в качестве биологической активной добавки к пище. Экстракцию полифенолов проводили 60 %-ным водным раствором этилацетата при 40 °С в течение часа 100 :1 (объем: вес).
В результате методики фракционирования, описанной выше, мы получили препарат полифенолов 99,5 %-ной чистоты с молекулярными массами от 1,0 до 5,0 кДА при общей продолжительности элюции 90 мин. Суммарный выход полифенолов составил 29±2,8 мкг/г сухого экстракта, что говорит об их практически полном извлечении из исходного материала. УФ-спектро-фотометрические исследования установили присутствие в очищенном препарате не более, чем 0,5-0,6 % примесей ароматических и гетероциклических веществ.
Данная работа представляет собой первое сообщение об успешном применении гелей фенил-агарозы для быстрого, полного и одноэтапного получения фракции высокоочищенных полифенолов из стандартизованного растительного сырья. Следует надеяться на успешное применение метода в близких к биофармации исследованиях канцерогенеза.
№2/томЗ/2004
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
