CC BY
139
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ИмМУНОЛОгиЧеСКие МеШОиЫ Meditsinskaya Immunologiya 2015, Т. 17, № 5, стр. 479-488 Т . . . , , 2015, Vol. 17, No 5, pp. 479-488
© 2015, спбро рааки Immunological methods © 2015, spb raaci
НОВЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА
Черемных Е.Г.1, Иванов ПА.1, Фактор М.И.1, Карпова Н.С.1, Васильева Е.Ф.1, Гусев К.В.2, Брусов О.С.1
1ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия
2 ГБУЗ «Психиатрическая клиническая больница № 1 им. Н.А. Алексеева» Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, Россия
Резюме. Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета, обеспечивающим первичную защиту против проникающих в организм патогенов. Кроме того, показано, что система комплемента связана со многими заболеваниями, не только аутоиммунными и инфекционными, но и психическими. В связи с этим необходима разработка доступного и быстрого метода определения активности системы комплемента в режиме реального времени.
Представлен новый автоматизированный метод оценки функциональной активности системы комплемента (СК), основанный на цитолитическом действии этой системы для инфузорий Tetrahymena pyriformis. Метод состоит в циклическом подсчете живых подвижных клеток с помощью разработанного нами прибора БиоЛаТ, в состав которого входят две видеокамеры, устройства подсветки и перемещения круглого планшета, планшет с двумя рядами лунок, микропроцессорный блок управления. Управляет работой прибора и осуществляет подсчет клеток программа AutoCiliata. Подсчет производится на основе последовательной фиксации двух кадров c дальнейшей программной обработкой изображений.
Представлены результаты микроскопических наблюдений процесса гибели клетки в буфере на основе триэтаноламина с 5% концентрацией сыворотки крови, а также результаты сравнения активности СК в различных буферах — среде культивирования инфузорий, веронал-мединаловом буфере и буфере на основе триэтаноламина (ТЭА). Обоснована замена веронал-мединалового буфера на буфер на основе триэтаноламина.
Время гибели всех клеток в буфере на основе триэтаноламина с концентрацией сыворотки 5% не превышает 15 минут для всех исследованных сывороток. В качестве величин, характеризующих активность СК, выбраны время гибели половины клеток (ТЛД50) и величина 100 х (1/ТЛД50)% (активность системы комплемента, АСК).
Представлены результаты оценки чувствительности метода, на основе зависимостей ТЛД50 и АСК от концентрации сыворотки. Выдвинуто предположение о возможности оценки интегральной активности комплемента и соотношения интенсивностей синтеза и расхода его эффекторных белков.
Отражены результаты исследования разного содержания ионов Ca++ и Mg++ в буфере и обоснован выбор их физиологических концентраций, 2,5 мМ и 1,5 мМ соответственно.
Оценены статистические характеристики точности аппаратной и методической частей метода, средние коэффициенты вариации составляют 3,9 и 2,7% соответственно, что удовлетворяет требо-
Адрес для переписки:
Карпова Наталья Сергеевна ФГБНУ «Научный центр психического здоровья» 115522, Россия, Москва, Каширское шоссе, 34. Тел.: 8(495) 952-91-41. E-mail:nat_karpova@mail.ru
Образец цитирования:
Е.Г. Черемньк, ПА. Иванов, М.И. Фактор, Н.С Карпова, Е.Ф. Васильева, К.В. Гусев, О.С. Брусов, «Новый метод оценки функциональной активности системы комплемента» // Медицинская иммунология, 2015. Т. 17, № 5. С. 479-488. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-479-488
© Черемньк Е.Г. и соавт., 2015
Address for correspondence:
Karpova Natalia S.
Research Center of Mental Health
115522, Russian Federation, Moscow, Kashirskoye ch., 34. Phone: 7 (495) 952-91-41. E-mail: nat_karpova@mail.ru
For citation:
E.G. Cheremnykh, P.A Ivanov, M.I. Faktor, N.S. Karpova, E.F. Vasiljeva, K.V. Gusev, O.S. Brusov, "A new method to assess functional activity of serum complement system", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2015, Vol. 17, no. 5, pp. 479-488. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-479-488
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-479-488
Черемных Е.Г. и др. Медицинская Иммунология
Cheremnykh E.G. et al. Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ваниям надежности результатов исследования, а короткое время исследования доказывает возможность применения метода в клинической практике в онлайн-режиме.
Разработан метод полуавтоматического определения функциональной активности сывороточного комплемента, который может быть использован в повседневной клинической практике, том числе в онлайн-режиме.
Ключевые слова: система комплемента, активность комплемента, Tetrahymenapyriformis, прибор БиоЛаТ, обработка изображения, подсчет клеток
A NEW METHOD TO ASSESS FUNCTIONAL ACTIVITY OF SERUM COMPLEMENT SYSTEM
Cheremnykh E.G.a, Ivanov P.A.a, Faktor M.I.a, Karpova N.S.a, Vasiljeva E.F.a, Gusev K.V.b, Brusov O.S.a
a Research Сenter of Mental Health, Moscow, Russian Federation
b N.A. Alekseev Psychiatric Clinical Hospital № 1, Moscow Department of Health Care, Moscow, Russian Federation
Abstract. Complement system is an important component of innate immunity, providing primary protection against pathogens invading the body. In addition, it was shown that the complement system is associated with many diseases, not only autoimmune and infectious, but also mental disorders. In this regard, it is necessary to develop affordable and fast method of measuring activity of the complement system in real-time mode.
We present a new semi-automated method for assessment of serum complement activity. The assay is based on cytolytic action of complement system upon the ciliate organism Tetrahymena pyriformis. This method consists in repeated counting of live Tetrahymena motile cells by means of specially developed Biolat device, which consists of two video cameras, light sources, and movable round plate. The plate has two rows of holes. The device also includes microprocessor control unit based on AutoCiliata software, intended for control of operation module and counting the surviving cell. The calculations are based on fixation of two sequential video-frames, with subsequent software image processing.
Cell death events were observed upon incubation in triethanolamine (TEA) buffer containing 5% of blood serum. We have also compared complement activity in different buffers, i.e., standard medium for culturing of ciliates, Veronal-Medinalum buffer, and the TEA buffer. TEA buffer was found superior to the Veronal buffer when applied in the test system. The time of cell death in the TEA-buffered medium containing 5% serum was < 15 minutes for all the sera studied. The parameters denoting serum complement activity were as follows: a half-life time for the moving cells (TLD50), and a similar value for 100% cell inactivation (1/TLD50, functional activity of the complement system, ACS). The sensitivity of this assay was calculated from dependencies between TLD50 and ACS, and actual serum concentrations. We have suggested an opportunity for evaluation of an integral complement activity, and interrelations between the intensity of synthesis and consumption of its major effector proteins. In the course of this study, we have tested different concentrations of Ca++ and Mg++ ions in the incubation buffer, with optimal physiological concentrations of 2.5 mM and 1.5 mM, respectively. We have also estimated statistical precision characteristics for pre-analytical and analytical steps of the method. The average coefficients of variation (CV) were 3.9% and 2.7%, respectively, thus satisfying the reliability criteria in research. A short performance time of the study suggests its potential application in clinical practice, including online examination regimens.
A method for semi-automatic measurement of serum complement activity could be applicable in daily clinical practice, including the online performance.
Keywords: complement system, complement activity, Tetrahymena pyriformis, BioLat device, image processing, cell counts
Введение
Система комплемента (СК), самая древняя составляющая иммунитета, имеет важнейшее значение в защите организма человека и животных, но эта система часто бывает одним из зна-
чимых факторов неблагоприятного прогноза при многих заболеваниях, не только аутоиммунных или инфекционных. В настоящее время установлена связь системы комплемента и усиления патологического процесса при тяжелых травмах [5], болезнях сердца [11] и почек [12], рассеян-
ном склерозе [8], посттравматическом стрессе [3] психических заболеваниях, таких как депрессия [14], болезнь Альцгеймера [9], шизофрения [15], расстройства аутистического спектра [10] и др. Также установлено, что система комплемента является перспективной терапевтической мишенью [7], а умеренное и своевременное ее инги-бирование облегчает течение болезни и улучшает прогноз [6]. Поскольку система комплемента выполняет жизненно важную функцию для организма, то терапевтическое воздействие на эту систему должно обязательно контролироваться в режиме реального времени.
Сегодня активность комплемента в целом, отдельных путей или отдельных компонентов оценивают по степени гемолиза эритроцитов барана [2] и с помощью иммуноферментного метода [4]. Эти методы не позволяют оценивать уровень активности СК в режиме реального времени, а себестоимость иммуноферментных диагностических систем делает их недоступными для широкого применения сегодня. Кроме того, гемолитический метод часто дает ложноположительные результаты из-за реактивного лизиса [1], что снижает его достоверность.
Поэтому разработка быстрого, технологичного и дешевого метода интегральной оценки функциональной активности комплемента, не дающего реактивного лизиса, актуальна и, возможно, будет востребована медицинской практикой.
Материалы и методы
Объектом исследования является сыворотка венозной крови здоровых доноров. Сыворотку получали из крови сразу после отбора, замораживали при температуре -80 °С и использовали для исследования в течение 7 дней.
Разрабатываемый метод оценки активности системы комплемента основан на действии СК на простейших Tetrahymena pyriformis и регулярном циклическом подсчете их количества в пробах с сывороткой до полной гибели простейших.
Штамм инфузорий WH14 был любезно предоставлен профессором Долговым В.А. (Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии гигиены и экологии). Культивировали инфузории при стабильной температуре 25 °С на стерильной 4-компонентной среде: 0,5% пептон, 0,5% глюкоза, 0,1% дрожжевой экстракт, 0,1% хлористый натрий (все реактивы фирмы Sigma). На четвертые сутки после
пересева на свежую среду инфузорий использовали в опытах.
Для микроскопических наблюдений использовался микроскоп Imager Ml Carl Zeiss с объективами 10х и 40х, оборудованный камерой AxioCam HRc.
Регулярный подсчет живых подвижных клеток простейших осуществляли с помощью разработанных нами прибора БиоЛаТ-3 (рис. 1) и управляющей программы AutoCiliata (рис. 2). Прибор выполнен в цилиндрическом корпусе, в его состав входят следующие узлы:
— 2 видеокамеры с объективами;
— 2 устройства подсветки;
— устройство перемещения круглого планшета;
— планшет с двумя рядами лунок;
— микропроцессорный блок управления камерами и перемещением планшета.
В опыте лунки последовательно позиционируются под объективы видеокамер для подсчета в них живых клеток. Подсчет в каждой лунке производится на основе последовательной фиксации двух кадров каждой лунки и дальнейшей программной обработки изображений результатов вычитания, отражающих информацию только о подвижных объектах. Обработка состоит в выявлении и подсчете всех объектов заданной площади. Подсчет осуществляется до полной гибели инфузорий во всех заданных лунках. Далее программа рассчитывает время гибели половины от начального количества клеток (Тад50) и величину активности системы комплемента — АСК = 100 х (1/ТЛД50)%. В режиме реального времени результаты подсчета каждой лунки отражаются на экране в виде графика изменения количества клеток (рис. 2). Процесс, отражаемый
Рисунок 1. Прибор БиоЛаТ-3
Рисунок 2. Основной интерфейс программы AutoCiliata, предназначенной для подсчета живых подвижных объектов
графиком, имеет 3 фазы: лаг-фаза — количество клеток почти не меняется, фаза быстрой гибели клеток и фаза стабильного остаточного количества клеток. Через 2 часа результаты и рассчитанные параметры комплемента сохраняются в файле Excel. Если во всех лунках произошла полная гибель клеток раньше чем за 2 часа, то все можно сохранить, при включении соответствующей команды.
Исследования поводили при стабильной температуре 25 °С в трех разных буферах:
1. Среда культивирования инфузорий.
2. Веронал-мединаловый буфер (ВБС++) с рН 7,5: 0,78 мМ веронала, 0,73 мМ мединала, 0,73 мМ NaCl 2,5 мМ Mg++, 0,75мМ Ca++ (MgCl2, CaCl2); обычно используется для оценки активности комплемента по гемолизу эритроцитов.
3. Буфер на основе триэтаноламина (ТЭА++) с рН 7,5: 1 мМ ТЭА и несколько вариантов концентраций (0-10 мМ ) Ca++ и Mg++.
Все реактивы фирмы Sigma.
Результаты
1. Визуальное наблюдение гибели Tetrahymena pyriformis
При наблюдении за состоянием клеток Tetrahymena pyriformis с помощью оптического микроскопа установлена их гибель через 5-7 минут после добавления сыворотки в концентрации 5%, и уже через 15 минут живых клеток не остается. Процесс гибели индивидуальной клетки занимает около одной минуты и сопровождается выраженными изменениями морфологии клетки. На рисунке 3 представлены изображения
индивидуальной клетки в процессе гибели, полученные с интервалом в 20 секунд.
Время гибели всех клеток в буфере на основе триэтаноламина с концентрацией сыворотки 5% не превышает 15 минут для всех исследованных сывороток. В качестве величин, характеризующих активность СК, выбраны время гибели половины клеток (ТЛД50) и величина, равная 100 (1/ТЛД50)% (активность системы комплемента, АСК).
2. Сравнение действия сыворотки крови здоровых доноров на инфузории Tetrahymena pyriformis в трех разных буферах: среда культивирования инфузорий, ВБС++, ТЭА++
2.1. Сравнение действия сыворотки в среде культивирования и буфере ТЭА++
Общий объем в каждой лунке — 300 мкл. Для получения разных концентраций сыворотки в среде культивирования в лунки 1-3 планшета прибора БиоЛаТ ввели по 270 мкл среды культивирования и по 15 мкл сыворотки (концентрация сыворотки 5%), 4-6 — 255 мкл среды и 30 мкл сыворотки (концентрация сыворотки 10%), 7-9 — 225 мкл среды и 60 мкл сыворотки (концентрация сыворотки 20%). В лунки 10-12 ввели 270 мкл буфера ТЭА++ и 15 мкл сыворотки.
После включения прибора ввели в каждую лунку по 15 мкл среды с инфузориями и запустили процесс циклического подсчета клеток в 12 лунках с помощью команды «Комплемент» программы AutoCiliata.
При разведении сыворотки средой в 5 раз АСК = 21,98 и ТЛД50 = 4,55, в 10 раз - АСК = 10,6 Тлд50 = 9,43, в 20 раз - АСК = 3,39 Тлд5„ = 29,49, в буфере ТЭА++ с 2,5 мМ Са+2, 1,5 мМ Mg+2, при
Рисунок 3. Гибель клетки Тв^аНутвпа руг'^огт'к при активации СК
20-кратном разведении сыворотки АСК = 21,32 ТЛД50 = 4,69.
Таким образом, в буфере ТЭА++ с физиологическими концентрациями ионов кальция и магния активность комплемента в 4 раза выше, чем в среде культивирования.
2.2. Сравнение действия сыворотки в буферах ВБС++ и ТЭА++
Буфер в системе «сыворотка крови — инфузории» нужен, во-первых, для обеспечения постоянной величины рН = 7,5, во-вторых, для обеспечения необходимых для активации СК концентраций ионов Са+2 и Mg+2. В состав веро-нал-мединалового буфера входят наркологические препараты, следовательно, сейчас они стали недоступны, поэтому было решено использовать буфер на основе триэтаноламина с физиологическими концентрациями ионов кальция и магния.
Этот буфер (1 мМ ТЭА, 2,5 мМ Са+2, 1,5 мМ Mg+2, рН 7,5) оценили на токсичность. Выживаемость простейших через 24 часа составляет 100%. Это означает, что в выбранных концентрациях триэтаноламина и солей буфер нетоксичен для инфузорий Tetrahymena pyriformis.
Для сравнения активности СК в 2-х буферах использовали 12 сывороток крови здоровых доноров. В каждую из 12 лунок планшета ввели 270 мкл буфера, 15 мкл одной из 12 сывороток и 15 мкл среды с инфузориями. Опыт повторен дважды с двумя разными буферами.
Результаты сравнения активности СК для 12 сывороток в буферах ВБС++и ТЭА++ представлены в таблице 1. Коэффициент корреляции по 12 сывороткам для АСК в 2-х буферах составляет 0,8506.
2.3. Активность системы комплемента при разных концентрациях ионов Ca+2 и Щ£+2
Концентрации ионов Са+2 и Mg+2, а также Na+ в веронал-мединаловом буфере, применяемом в методе оценки активности комплемента по гемолизу эритроцитов, вероятно, определены в соответствии с особенностями тест-объектов (эритроцитов), в литературных данных обоснования солевого состава ВБС++ не найдено. Поскольку в разрабатываемом методе используется другой тест-объект, то концентрации солей необходимо выбирать, руководствуясь только особенностями системы комплемента, т.к. инфузории нормально функционируют в широком диапазоне концентраций солей, и оптимальный рН для этих простейших около 7.
Физиологическими значениями в крови концентраций Са+2 и Mg+2 являются 2,5 мМ и 1,5 мМ соответственно. Поэтому для исследования влияния этих ионов на активность комплемента был выбран диапазон концентраций от 0 до 10 мМ. Изменение активности системы комплемента в зависимости от концентраций Са+2 и Mg+2 представлено на графиках рисунков 4, 5.
Черемных Е.Г. и др. Медицинская Иммунология
Cheremnykh E.G. et al. Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ТАБЛИЦА 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ СК В ДВУХ БУФЕРАХ ВБС++ И ТЭА++
№ сыворотки Тлд50 (ВБС++), мин АКС (ВБС++) Тлд50 (ТЭА++), мин АКС(ТЭА++)
1 6,4 15,625 6,45 15,50387597
2 6,9 14,492715362 6,9 14,49275362
3 9,3 10,75268817 9,5 10,52631579
4 6,9 14,49275362 6,9 14,49275362
5 6,9 14,49275362 6,9 14,49275362
6 7,3 1 33,69863014 8,1 12,34567901
7 6,3 15,87301587 8,1 12,34567901
8 6,5 15,384615338 63,9 14,49275362
9 8,7 11,49425287 8, 9 11,23590506
10 8,5 11,76470588 8,9 11,23595506
11 9,4 10,63829787 9,4 10,63829787
12 7,15 13,98601399 7,6 13,15789474
коэф. корреляции 0,850621357
АСК, 1/мин
25 20 15 10 5 0
АСК, 1/мин
4 6
без CaCl2
8 10 - 2,5 мМ CaCl2
Рисунок 4. Изменение активности комплемента в зависимости от концентрации Мд+2 в буфере
30 25 20 15 10 5 0
V
\
CaCl2, мМ
—I— 10
12
без MgCl2
- 1,5 мМ MgCl2
Рисунок 5. Изменение активности комплемента в зависимости от концентрации Са+2 в буфере
0
Рисунок 6. Зависимость изменений параметров (1 - ТЛД50,2 - АСК) активности СК от концентрации сыворотки
3. Чувствительность метода
Чувствительность метода определяли с помощью изучения ТЛД50 и АСК для разных концентраций сыворотки — 5, 2,5, 1,25 и 0,625%. Этот диапазон концентраций сыворотки выбран исходя из результатов многократных различных сывороток здоровых людей. При концентрации сыворотки выше 5% гибель простейших может происходить слишком быстро (< 1 минуты) и точность метода снижается, а при концентрации ниже 0,5% часто невозможно определить АС К, т.к. гибели инфузорий не происходит.
Результат оценки ТЛД50 и АСК для концентраций сыворотки — 5, 2,5, 1,25 и 0,625% — представлен на графиках рисунка 6.
4. Статистические характеристики метода
Оценку точности подсчета живых клеток
на приборе БиоЛаТ проводили с помощью режима программы AutoCiliata «Экспресс-тест», который заключается в многократном подсчете клеток в заданных лунках. Подсчет производили в 10 лунках 10 раз. Результат подсчета представлен в таблице 2. Коэффициент вариации по всем лункам не превышает 5%, а средний коэффициент вариации равен 3,9%
Результат оценки одной и той же сыворотки в разное время представлен на графиках рисунка 7.
Обсуждение
Цитолитическое действие сыворотки крови для инфузорий замечено давно, а предположение о том, что гибель простейших происходит в результате активации системы комплемента, было
высказано уже в 1958 году [13]. Проблема использования этих тест-объектов для оценки комплемента состояла в вариабельности чувствительности культур и невозможности количественной оценки результата. При культивировании инфузорий в описанных условиях и использовании их в опыте всегда в одной фазе роста культуры (на 4 сутки) задача стабилизации чувствительности решена, что доказано в испытаниях одной и той же сыворотки в периоде 2-х недель. Точность подсчета живых подвижных клеток с помощью прибора БиоЛаТ показана в таблице 2. Коэффициенты вариации не превышают 5%. Таким образом, инструментальная составляющая разрабатываемого метода удовлетворяет требованиям по надежности и достоверности результатов.
При микроскопическом наблюдении за состоянием клетки Tetrahymena pyriformis в буфере ТЭА++ с концентрацией сыворотки 5% был зафиксирован процесс ее гибели, представленный на рисунке 3 последовательностью кадров. Целостность клетки нарушается из-за сквозных отверстий в районе клеточного рта, где клеточная мембрана наиболее тонка, и мембрано-атакую-щие комплексы, образующиеся в результате активации СК, быстро меняют осмотическое давление клетки. При этом содержимое клетки вытекает наружу. Это наблюдение, а также ряд исследований, касающихся действия на СК известных ингибиторов сериновых протеаз и не вошедших в настоящую статью, доказывают утверждение о том, что гибель простейших происходит в результате активации комплемента сыворотки крови.
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
-1000
10.11.2014
11.11.2014
ж — 14.11.2014 17.11.2014
^S^OA —- 18.11.2014
21.11.2014
1
1
vV^-C V S^sSN
10
15
Тлд50, МИН
4,92 4,76 4,87 5,12 5,12
Рисунок 7. Оценка активности СК сыворотки в разное время. Средний коэффициент вариации для ТЛД50 равен 2,7%.
ТАБЛИЦА 2. ОЦЕНКА ТОЧНОСТИ ПОДСЧЕТА ЖИВЫХ ПОДВИЖНЫХ ОБЪЕКТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРА БиоЛат
№ лун./ № подсчета 1 2 4 5 6 7 8 9 10
1 5401 5992 4925 5041 5667 5866 4894 5971 5274
2 5514 6124 4985 5279 5942 6095 5146 6127 5214
3 5314 6156 5251 5406 5899 6174 4899 6148 4871
4 5108 5415 4766 4967 5797 5936 4836 6343 5117
5 5075 5542 4817 5250 5742 6055 4835 6041 4763
6 4938 5804 4802 5137 5400 6083 4810 6035 4954
7 5060 5716 4594 4937 5463 5698 4660 5900 4866
8 4910 5715 4611 4809 5533 5679 4643 5993 4896
9 4847 5572 4690 4797 5329 5588 4779 5837 4617
10 5075 5454 4640 4782 5406 5759 4770 5651 4862
среднее 5124,2 5749 4808,1 5040,5 5617,8 5893,3 4827,2 6004,6 4943,4
ср. кв. отклонение 218,89 267,36 202,73 220,98 221,36 205,34 141,09 187,86 203,29
коэф. вариации 4,27 4,65 4,22 4,38 3,94 3,48 2,92 3,13 4,11
Изменение активности СК в зависимости от концентраций ионов магния и кальция (рис. 4, 5) отражает особенности механизма СК. Для ионов магния существует максимум при 3 мМ в условиях содержания кальция (0,125 мМ содержится при разведении сыворотки в 20 раз) и при 1,5 мМ в условии 2,5 мМ (в буфере) + 0,125 мМ (в сыворотке). При концентрациях магния от минимальной (0,075 мМ) до 1,5 или 3 мМ активность СК резко возрастает, что говорит о возрастании доли в активности СК петли амплификации в альтернативном пути, имеющего магний-зависимые ферменты. Активность СК при содержании магния от 1,5 или 3 мМ до 10 мМ медленно убывает, а при концентрации выше 10 мМ резко падает. Вероятно, высокие концентрации магния ингибируют СК, замещая ионы кальция в кальций-зависимых ферментах классического и лек-тинового путей.
Характер зависимости АСК от концентрации ионов кальция иной. График монотонно увеличивается при увеличении концентрации кальция, при этом АСК в буфере с 1,5 мМ ионов магния существенно выше, чем в буфере без магния. Монотонное увеличение АСК можно объяснить наличием в СК кальций-зависимых эффекторов и ингибиторов, на роль последнего может претендовать фактор I, являющийся сериновой про-
теазой. Почти линейная зависимость объясняется тем, что функции активации и ингибирования в СК сбалансированы на одинаковом уровне общей активности эффекторов и ингибиторов. Увеличенный уровень АСК (пунктирная линия) при концентрации ионов магния 1,5 мМ свидетельствует о высоком вкладе магний-зависимой петли амплификации.
Зависимость ТЛД50 от концентрации сыворотки является псевдогиперболической (рис. 6), т.к. хорошо аппроксимируется гиперболой в выбранном диапазоне концентраций, но при концентрации меньше 0,5% для большинства исследованных сывороток не происходит гибели инфузорий, т.е. в верхней части кривая имеет обрыв. В нижней части кривой (при увеличении концентрации выше 5%) значение ТЛД50 очень быстро приближается к 0, и поэтому время ТЛД50 невозможно оценить.
Зависимость величины АСК от концентрации исследованной сыворотки аппроксимирована квадратным уравнением (АСК = -0,2755Х2 + 4,7935Х — 1,6595). Вычисленное значение концентрации сыворотки, при которой гибели инфузорий не происходит (АСК = 0), равно 0,35%. Для всех исследованных сывороток эта концентрация меньше 1,25% и является особенностью СК конкретного человека и/или особенностью
патологии. АСК0 характеризует интенсивность синтеза эффекторов СК, т.е. количество активных ферментов, в результате действия которых формируется мембрано-атакующий комплекс (МАК).
Для концентраций сыворотки 5% и выше величина ТЛД50 отражает и собственно суммарную активность ферментной каскадной системы комплемента и количество активных молекул. Соотношение ТЛД50(5%)/ТЛД50(0,625%) может характеризовать степень истощения СК: чем больше эта величина, тем меньше эффекторных молекул СК в сыворотке и, соответственно, образуется меньше МАК. Таким образом, эта величина может
служить оценкой соотношения синтеза и расхода эффекторных молекул СК.
Статистические параметры (табл. 2, рис. 7) как аппаратной части, так и метода оценки активности СК удовлетворяют требованиям надежности результатов исследования, а короткое время исследования доказывает возможность применения метода в клинической практике в онлайн-режиме.
В заключение можно сказать, что вышеописанный метод по чувствительности, воспроизводимости, степени автоматизации его проведения и расчета может служить основой для использования его в широкой медицинской практике после его полной валидации и сертификации.
Список литературы / References
1. Кулешина О.Н., Андина С.С., Попова О.П., Черемных Е.Г., Козлов Л.В. Активность комплемента при коклюше // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2013. T. 2, № 69. С. 46-51. [Kuleshina O.N., Andina S.S., Popova O.P., Cheremnykh E.G., Kozlov, L.V. Activity of complement in pertussis]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccination, 2013, Vol. 2, no. 69, pp. 46-51. (In Russ.)]
2. Кулешина О.Н., Козлов Л.В., Черемных Е.Г. Универсальный метод определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных, земноводных и птиц // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. T. 157, № 2. C. 254-257. [Kuleshina O.N., Kozlov L.V., Cheremnykh E.G. Universal method for determining the functional activity of the human complement, laboratory, domestic and farm animals, amphibians and birds]. Byulleten eksperimental'noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, Vol. 157, no. 2, pp. 254-257. (In Russ.)]
3. Оганесян Л.П., Мкртчян Г.М., Сукиасян С.Г., Амбарцумян М.К., Аветисян Г.В., Бояджян А.С. Комплемент как патогенный фактор при посттравматическом стрессе // Биологический журнал Армении, 2009. Т. 1, № 61. С. 48-53. [Oganesyan L.P., Mkrtchyan G.M., Sukiasyan S.G., Ambardzumyan M.K., Avetisyan G.V., Boyajyan A.S. Complement as a pathogenic factor in post-traumatic stress]. Biologicheskiy zhurnal Armenii = Biologist. Journal Armenia, 2009, Vol. 1, no. 61, pp. 48-53. (In Russ.)]
4. Романов С.В., Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Определение активности про-теиназ системы комплемента иммуноферментными методами // Биомедицинская химия, 2003. Т. 49, № 6. С. 604-612. [Romanov S.C., Kozlov L.V., Dyakov V.L., Batalova T.N., Guzova B.A. Determination of the activity of proteases of the complement system immunoassay methods]. Biomeditsinskaja himiya = Biomedical Chemistry, 2003, Vol. 49, no. 6, pp. 604-612. (In Russ.)]
5. Bellander B.M., Singhrao S.K., Ohlsson M., Mattsson P., Svensson M. Complement activation in the human brain after traumatic head injury. J. Neurotrauma. 2001, Vol. 18, no. 12, pp. 1295-1311.
6. Ducruet A.F., Zacharia B.E., Sosunov S.A., Gigante P.R., Yeh M.L., Gorski J.W., Otten M.L., Hwang R.Y., DeRosa P.A., Hickman Z.L., Sergot P., Connolly E.S.Jr. Complement Inhibition Promotes Endogenous Neurogenesis and Sustained Anti-Inflammatory Neuroprotection following Reperfused Stroke. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 6, p. e38664.
7. Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. American Society of Hematology, 2008, Vol. 1, pp. 116-123.
8. Ingram G., Loveless S., Howell O.W., Hakobyan S., Dancey B., Harris C.L., Robertson N.P., Neal J.W., Morgan B.P. Complement activation in multiple sclerosis plaques: an immunohistochemical analysis. Acta Neuropathol. Commun., 2014, Vol. 9, no. 2, p. 53.
9. Loeffler D.A., Camp D.M., Bennett D.A. Plaque complement activation and cognitive loss in Alzheimer's disease. J. Neuroinflammation 2008, Vol. 11, no. 5, p. 9.
10. Momeni N., Bergquist J., Brudin L., Behnia F., Sivberg B., Joghataei M.T., Persson B.L. A novel blood-based biomarker for detection of autism spectrum disorders. Transl. Psychiatry., 2012, Vol. 13, no. 2, p. e91.
11. Palikhe A., Sinisalo J., Seppanen M., Haario H., Meri S., Valtonen V., Nieminen M.S., Lokki M.L. Serum complement c3/c4 ratio, a novel marker for recurrent cardiovascular events. Am. J. Cardiol., 2007, Vol. 1, no. 99 (7), pp. 890-895.
12. Roos A., Bouwman L.H., van Gijlswijk-Janssen D.J., Faber-Krol M.C., Stahl G.L., Daha M.R., Human IgA activates the complement system via the mannan-binding lectin pathway. J. Immunol.,2001, Vol. 1, no. 167 (5), pp. 2861-2868.
13. Sinclair I.J.B. The Role of Complement in the Immune Reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology, 1958, Vol. 1, no. 3, pp. 291-299.
14. Song C., Dinan T., Leonard B.E. Changes in immunoglobulin, complement and acute phase protein levels in the depressed patients and normal controls. J. Affect. Disord., 1994, Vol. 30, no. 4, pp. 283-288.
15. Spivak B., Radwan M., Brandon J., Baruch Y., Stawski M., Tyano S., Weizman A. Reduced total complement haemolytic activity in schizophrenic patients. Psychol. Med., 1993, Vol. 23, no. 2, pp. 315-318.
Авторы:
Черемньх Е.Г. — к.т.н., старший научный сотрудник, лаборатория биохимии ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия
Иванов П.А. — к.б.н., старший научный сотрудник, лаборатория биохимии ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия
Фактор М.И. — к.б.н., ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимии ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия Карпова Н.С. — младший научный сотрудник, лаборатория биохимии ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия Васильева Е.Ф. — к.б.н., старший научный сотрудник, лаборатория биохимии ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия Гусев К.В. — врач клинической лабораторной диагностики ГБУЗ «Психиатрическая клиническая больница № 1 им. Н.А. Алексеева» Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, Россия
Брусов О.С. — к.б.н., заведующий лабораторией биохимии, ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия
Поступила 05.03.2015 Отправлена на доработку 11.03.2015 Принята к печати 06.04.2015
Authors:
Cheremnykh E.G., PhD (Technology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry, Research Center of Mental Health, Moscow, Russian Federation
Ivanov P.A., PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry, Research Center of Mental Health, Moscow, Russian Federation
Faktor M.I., PhD (Biology), Leading Research Associate,
Laboratory of Biochemistry, Research Center of Mental
Health, Moscow, Russian Federation
Karpova N.S., Junior Research Associate, Laboratory
of Biochemistry, Research Center of Mental Health, Moscow,
Russian Federation
Vasiljeva E.F., PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry, Research Center of Mental Health, Moscow, Russian Federation Gusev K.V., Clinical Chemist (Laboratory Diagnostics), Clinical Laboratory, N.A. Alekseev Psychiatric Clinical Hospital № 1, Moscow, Russian Federation
Brusov O.S., PhD (Biology), Chief, Laboratory of Biochemistry, Research Center of Mental Health, Moscow, Russian Federation
Received 05.03.2015 Revision received 11.03.2015 Accepted 06.04.2015
