CC BY
24
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616.831-005.4
Н. С. Щербак, П. П. Бельтюков, Д. А. Овчинников, А. Н. Кузьменков, М. С. Гордеева, М. М. Галагудза, Е. Р. Баранцевич, Е. В. Шляхто
ВЛИЯНИЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ С3 КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ И РЕПЕРФУ-ЗИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии имени В. А. Алмазова, Санкт-Петербург
ВВЕДЕНИЕ
Ишемическое посткондиционирование (ИПост) -эффективный механизм защиты клеток от ишемиче-ского и реперфузионного повреждения. Феномен ИПост впервые описан в 2003 г., когда было показано, что короткие повторные эпизоды ишемии миокарда по 30 секунд в период ранней реперфузии, выполненные после длительной ишемии, обеспечивают существенный кардиопротективный эффект [16]. Впоследствии нейропротективные эффекты ИПост были обнаружены во многих экспериментальных исследованиях ише-мии-реперфузии головного мозга [14, 17]. Протектив-ная концепция ИПост основывается на том, что ткани могут быть защищены от реперфузионного повреждения посредством коротких эпизодов ишемии и репер-фузии, выполненных в раннем реперфузионном периоде после длительной ишемии.
Механизмы ишемического и реперфузионного повреждения сложны и включают метаболические нарушения, невосстановление кровотока (no-reflow), внутриклеточный отек, инициацию адаптивных иммунных реакций и другие изменения, приводящие, в итоге, к некрозу и апоптозу клеток [8, 15]. Реактивное воспаление при ишемии-реперфузии - сложный патологический процесс с неоднозначным биологическим значением, исходно направленный на отграничение и устранение возникающего очага инфаркта, который, однако, может сопровождаться развитием серьезного вторичного повреждения. Лучшее понимание механизмов воспаления, которое развивается после ишемии-реперфузии головного мозга, может способствовать разработке новых методов профилактики и терапии, направленных на уменьшение площади повреждения.
Система комплемента является ключевым звеном врожденного иммунного ответа организма. Однако
;п()ГМУ
в ряде исследований было установлено, что некоторые активированные компоненты системы комплемента могут вносить дополнительное повреждающее действие при ишемическом и реперфузионном повреждении [4, 13]. К настоящему времени существует небольшое количество экспериментальных и клинических исследований, посвященных изучению активации компонентов системы комплемента при ишемическом и реперфузионном повреждении тканей головного мозга [1, 5, 6]. Исследований, направленных на изучение функциональной активности системы комплемента при применении ИПост головного мозга, к настоящему времени не существует.
Цель исследования - количественная оценка функциональной активности С3-компонента системы комплемента в сыворотке крови крыс на разных сроках реперфузии после глобальной ишемии и выполнения ИПост головного мозга.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациями Этических комитетов СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова и ФЦСКЭ им. В. А. Алмазова, а также в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального института здоровья США № 85-23).
Моделирование ишемического повреждения. Исследование проводилось на крысах-самцах линии Wistar массой 220-250 г (питомник «Рапполово»), содержащихся в условиях 12/12-часового свето-темнового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum. Животных наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг, внутрибрюшинно). Обратимую глобальную ишемию (ГИ) головного мозга моделировали окклюзией плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левой общей сонной артерии на 10 минут, по ранее описанной методике [2]. ИПост моделировали путем снятия и наложения микрохирургических зажимов на артерии в раннем реперфузионном периоде согласно выбранному протоколу эксперимента - 3 эпизода по 15 с/15 с реперфузии/реокклюзии после ишемии с последующей реперфузией, длительность которой составляла 2-х и 7-ми суток. Животные были случайным образом разделены на следующие экспериментальные группы: 1) Н - интактные животные (n=6); 2) И1 - 10-минутная ишемия без реперфузии (n=6); 3) И2 - 10-минутная ишемия с последующей реперфузией в течение 2-х суток (n=6); 4) И3 - 10-минутная ишемия с последующей реперфузией в течение 7-ми суток (n=6); 5) ИП1 -10-минутная ишемия + ИПост (n=6); 6) ИП2 - 10-минутная ишемия + ИПост с последующей реперфузией в течение 2-х суток (n=5); 7) ИП3 - 10-минутная ишемия +ИПост с последующей реперфузией в течение 7-ми суток (n=5). Все хирургические вмешательства проводились на термостатируемом операционном столе при температуре 37 оС. В послеоперационном периоде до момента выхода животных из наркоза их температура
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • №3 • 2012
также поддерживалась на постоянном уровне за счет внешнего источника тепла.
Биохимическое исследование. Кровь для получения сыворотки отбирали после декапитации животных в соответствии с протоколом эксперимента. Образцы сыворотки замораживали и хранили при -30 °С, не допуская размораживания до проведения анализа, не более месяца. Функциональную активность С3 в сыворотке крови крыс определяли с использованием реагента ЯС3, представляющего собой смесь донорских сывороток крови человека, в которой белок С3 был предварительно инактивирован. В ходе анализа к реагенту ЯС3 (0,2 мл) добавляли 0,2 мл мединалового буфера, содержащего 17 мМ М§2+ и 5,1 мМ Са2+, 0,3 мл 0,9 %-го раствора №С1, 0,02 мл исследуемой сыворотки крови крыс, предварительно разведенной в 6 раз 0,9 %-м раствором №С1. После прогревания смеси (3 мин, 37 оС) в нее вносили 0,1 мл стандартной суспензии эритроцитов кролика (около 1,2х106 эритроцитов/мл). В такой смеси, благодаря присутствию как ионов магния, так и ионов кальция, активация комплемента возможна по любому из существующих механизмов. Кинетику комплементопосредованного гемолиза регистрировали фотометрически в термоста-тируемой при 37 оС кювете (1=5 мм) на спектрофотометре СФ-46 с регистрацией оптической плотности при 800 нм каждые 5 секунд. Были определены лаг-период (Т1а§) - время инкубации смеси от момента добавления эритроцитов до начала эффективного гемолиза; скорость лизиса (У1ув) - максимальная скорость гемолиза, которая определяется как снижение оптической плотности инкубационной смеси в единицу времени (дБ800/5"), и Ттах - время достижения У1у8.
Статистический анализ. Достоверность различий оценивали при помощи и-критерия Манна-Уитни с использованием программы «81аИ811са 6.0». Различия считались достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Моделируемая 10-минутная ишемия головного мозга приводила к повышению активности С3-компо-нента комплемента, что выражалось в достоверном (р<0,05) увеличении максимального значения скорости гемолиза У1у8 и в значимом уменьшении времени для его достижения Ттах (р<0,05, таблица). Увеличение реперфузионного периода до 2-х суток способствовало достоверному (р<0,05) нарастанию увеличения активности С3-компонента комплемента при сравнении с активностью, наблюдаемой в группе И1 (таблица). В позднем реперфузионном периоде, а именно -через 7 суток после восстановления кровотока, активность С3-компонента комплемента уменьшалась, что выражалось в снижении показателя У1у8 и достоверном (р<0,05) увеличении показателей Т1а§ и Ттах при сравнении с показателями, наблюдаемыми ко 2-м суткам реперфузии в группе И2.
Для анализа изменений функциональной активности С3-компонента комплемента в сыворотке крыс после перенесения обратимой глобальной ишемии головного мозга нами использовались три срока реперфу-зии - непосредственно после 10-минутной ишемии, т. е. без реперфузии, а также спустя 2 и 7 суток реперфузии. Различные сроки реперфузии были выбраны для анализа активности комплемента с учетом феномена отсроченной гибели нейронов. Согласно данной концепции, обратимая глобальная ишемия приводит к гибели клеток головного мозга, интенсивность которой нарастает к 48 часам после ишемии и понижается к 7-м суткам реперфузионного периода [11]. Наличие отсроченной гибели нейронов было подтверждено в многочисленных исследованиях на песчанках, крысах и кроликах [12]. Также необходимо отметить, что после ишемии, приводящей к гибели нейронов, последующая реперфузия обладает дополнительным повреждающим действием [4, 13]. Результаты, демонстрирующие увеличение активности С3-компонента комплемента на 2-е сутки реперфузии после обратимой глобальной ишемии, полученные в нашем исследовании, согласуются с результатами, полученными ранее другими исследователями с применением иммуногисто-химического анализа на модели фокальной ишемии у крыс [6]. Так, при помощи иммуногистохимического анализа было установлено, что диффузия С3 в зону ишемии была самой высокой на 3-и сутки реперфузии после моделирования обратимой 60-минутной фокальной ишемии у крыс [6]. В другом исследовании методом иммуноблотинга было обнаружено достоверное увеличение относительного содержания С3-компонен-та комплемента в сыворотке крови больных с ишеми-ческим инсультом при сравнении со здоровыми лицами. Необходимо отметить, что повышение данного биохимического показателя было зарегистрировано у больных с острым ишемическим инсультом на 1-е сутки их пребывания в стационаре [1]. Недостатком существующих экспериментальных и клинических работ является то, что активность С3-компонента комплемента оценивали в одной, реже - в двух временных точках реперфузионного периода, что не позволяет оценить изменение функциональной активности комплемента в динамике. В нашем исследовании мы впервые исследовали активность С3-компонента комплемента как в раннем, так и в отдаленном реперфузион-ном периоде. Однако до настоящего времени остаются не изученными точные механизмы участия активированных компонентов системы комплемента в патогенезе ишемического-реперфузионного повреждения головного мозга, а также их роль во взаимодействии с другими белками острой фазы [5]. С3-компонент комплемента занимает центральное место в системе комплемента, которая, в свою очередь, является главным участником врожденного гуморального иммунитета, а также является одним из вспомогательных звеньев приобретенного иммунитета. Необходимо отметить,
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
что в нескольких исследованиях на мелких лабораторных животных ин-гибирование компонентов комплемента обеспечивало нейропротектив-ный эффект при ишемическом повреждении [3, 7, 9, 10].
При анализе данных, полученных при применении ИПост после глобальной ишемии, были обнаружены следующие закономерности. Параметры, характеризующие функциональную активность С3-компонента комплемента, значимо не различались между группами И1, И2 и ИП1, ИП2 соответственно (таблица). Эти данные свидетельствуют о том, что ИПост при данных сроках реперфузии не оказывало влияния на активацию С3-компонента комплемента, отмеченную при ишемии-реперфузии головного мозга. Однако к 7-м суткам реперфузии активность С3-компонента комплемента увеличивается при сравнении с группой И3, а также с группами ИП1 и ИП2, что выражается в значимом увеличении (р<0,01) показателя У1у8 при сравнении с группой И3 и в достоверном снижении показателей Т1а§ и Ттах при сравнении как с группой И3 (р<0,01), так и с группами ИП1 и ИП2 (р<0,05). Применение ИПост приводит к увеличению активности С3-компонента комплемента в отдаленном реперфузион-ном периоде, к 7-м суткам реперфузии. Возможно, применение ИПост приводит к изменению характера адаптивного иммунного ответа, интенсивность которого существенно варьирует в зависимости от длительности реперфузии.
ВЫВОДЫ
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что следствием обратимого ишемического повреждения головного мозга у крыс является повышение активности С3 в первые 7 суток после глобальной ишемии с максимально выраженным повышением активности ко 2-м суткам. Применение ИПост приводит к достоверному увеличению функциональной активности С3-компонента комплемента к 7-м суткам реперфузии, что, возможно, свидетельствует о способности организма к синтезу и, следовательно, к активному адаптивному ответу в отдаленном постишемическом периоде. Можно предположить, что применение ИПост реализует свой нейропротектив-ный потенциал за счет изменения степени активации иммунной системы, которая, в свою очередь, зависит от длительности реперфузионного периода. Однако это предположение нуждается в дальнейшем экспериментальном изучении и подтверждении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Айвазян, В. А. Компоненты системы комплемента СЗ и фактор В в крови больных с острым ишемическим инсультом /
Активность С3-компонента комплемента при ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга с применением ишемического посткондиционирования
Экспериментальная группа (n) Определяемые значения
Tlag (с) Tmax (с) Vlys (dE„„/5")
Н (n=6) 23±3,6 b 43±3,8 0,024±0,0026 *,**
И1 (n=6) 19±2,5 j 32±4,8 0,031±0,0038 j
И2 (n=6) 15±1,5 27±1,3 0,042±0,0024
И3 (n=6) 20±4 " 40±7,9 " 0,03±0,0058 "
ИП1 (n=6) 19±2,1 34±2,5 ♦ 0,028±0,0009*
ИП2 (n=5) 17±1,4 26±1,8 § 0,039±0,0046 •
ИП3 (n=5) 12±1,8 n 19±1,3© 0,05±0,0033 ©
* - р<0,05, при сравнении с И1, И3, ИП1; ** - р<0,01 при сравнении И2, ИП2, ИП3; ф - р<0,05 при сравнении с И2; * - р<0,05 при сравнении с ИП2; * - р<0,05 при сравнении с ИП3; © - р<0,01 при сравнении с И3; ** - р<0,05 при сравнении с И2; ь - р<0,05 при сравнении с И2, ИП2, ИП3; рр - р<0,05 при сравнении с И1, И2, ИП1, ИП2, ИП3; п - р<0,05 при сравнении с И3, ИП1, ИП2.
В. А. Айвазян [и др.] // Журнал неврол. и психиатрии. Инсульт. -
2005. - № 15. - С. 57-60.
2. Щербак, Н. С. Новый способ моделирования обратимой глобальной ишемии головного мозга у крыс / Н. С. Щербак [и др.] // Бюл. эксперимент. биологии и мед. - 2011. - Т. 152. -№11. - Р. 592-596.
3. Akita, N. Protective effect of C1 esterase inhibitor on reperfusion injury in the rat middle cerebral artery occlusion model / N. Akita [et al] // Neurosurgery. - 2003. - № 52. - P. 395-401.
4. Bhole, D. Therapeutic potential of targeting the complement cascade in critical care medicine / D. Bhole, G. L. Stahl // Crit. Care Med. - 2003. - № 31. - Р. 97-104.
5. Costa, C. Source Role of complement component C5 in cerebral ischemia/reperfusion injury / С. Costa [et al] // Brain Res. -
2006. - № 1100 (1). - Р. 142-151.
6. Czurko, A. Appearance of immunoglobulin G and complement factor C3 in the striatum after transient focal ischemia in the rat / A. Czurko [et al] // Neurosci Lett. - 1994. - Vol. 17. - № 166 (1). -Р. 51-54.
7. De Simoni, M. G. Neuroprotection by complement (C1) inhibitor in mouse transient brain ischemia / M. G. De Simoni [et al] // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 2003. - № 23. - Р. 232-239.
8. Girn, H. R. Reperfusion syndrome: cellular mechanisms of microvascular dysfunction and potential therapeutic strategies / H. R. Girn [et al] // Vasc. Endovascular. Surg. - 2007. - № 41 (4). -Р. 277-293.
9. Heimann, A. C1-esterase inhibitor reduces infarct volume after cortical vein occlusion / A. Heimann [et al] // Brain Res. -1999. - № 838. - Р. 210-213.
10. Huang, J. Neuronal protection in stroke by an sLex-glycosy-lated complement inhibitory protein / J. Huang [et al] // Science. -1999. - № 285. - Р. 595-599.
11. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia / T. Kirino // Brain Res. - 1982. - № 239. -Р. 57-69.
12. Mitani, A. Critical levels of extracellular glutamate mediating gerbil hippocampal delayed neuronal death during hypothermia: brain microdialysis study / А. Mitani, K. Kataoka // Neuroscience. -1991. - № 42 (3). - Р. 661-670.
13. Seelen, M. A. Role of complement in innate and autoimmunity / M. A. Seelen // J. Nephrol. - 2005. - № 18. - Р. 642-653.
14. Zhang, W. Neuroprotective effects of ischemic postcondi-tioning on global brain ischemia in rats through upregulation of hippocampal glutamine synthetase / W. Zhang [et al] // J. Clin. Neurosci. - 2011. - № 18 (5). - Р. 685-689.
15. Zhao, H. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ische-mic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats / H. Zhao [et al] // J. Cereb. Blood Flow. Metab. - 2006. - № 26 (9). -Р. 1114-1121.
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • N03 • 2012
16. Zhao, Z. Q. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning / Z. Q. Zhao [et al] // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2003. - № 285 (2). - P. 579-88.
17. Zhou, C. Delayed ischemic postconditioning protects hippocampal CA1 neurons by preserving mitochondrial integrity via Akt/GSK3B signaling / C. Zhao [et al] // Neurochem. Int. -2011. - № 59 (6). - P. 749-758.
РЕЗЮМЕ
Н. С. Щербак, П. П. Бельтюков, Д. А. Овчинников, А. Н. Кузьменков, М. С. Гордеева, М. М. Га-лагудза, Е. Р. Баранцевич, Е. В. Шляхто
Влияние ишемического посткондиционирования на активность С3 компонента комплемента при ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга
Ишемическое посткондиционирование (ИПост) - эффективный механизм защиты клеток от ишемического и реперфузионного повреждения. Активация системы комплемента при ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга может приводить к дополнительному повреждению здоровых тканей. Изменение активности С3-компонента комплемента при глобальной ишемии головного мозга и при применении ИПост остается неизученной. Цель настоящей работы состояла в количественной оценке функциональной активности СЗ-компонента системы комплемента в сыворотке крови крыс на разных сроках репер-фузии после глобальной ишемии и выполнения ИПост головного мозга. Показано, обратимое 10-минутное ишемическое повреждение головного мозга у крыс приводит к повышению активности СЗ-компонента системы комплемента в первые 7 суток
после глобальной ишемии с максимально выраженным повышением активности ко 2-м суткам. Применение ИПост приводит к достоверному увеличению функциональной активности С3-компонента комплемента к 7-м суткам реперфузии.
Ключевые слова: ишемическое посткондиционирование, С3-компонент комплемента, головной мозг, ишемия, крысы.
SUMMARY
N. S. Shcherbak, P. P. Bel'tiukou, D. A. Ouchin-nikov, A. N. Kuzmenkou, M. S. Gordeeua, M. M. Ga-lagudza, E R. Barantseuitch, E. V. Shlyakhto
Effect of ischemic postconditioning on the activity of complement component C3 in cerebral ischemic and reperfusion injury
Ischemic postconditioning (IPost) is an effective mechanism to protect cells from ischemic and reperfusion injury. Activation of the complement system in ischemic and reperfusion brain injury can cause additional damage to healthy tissue. Changes in the activity of C3-complement component in global cerebral ischemia and in IPost are unknown. The aim of this study was to quantify the functional activity of the C3-component of complement in the serum of rats at different stages of reperfusion after cerebral global ischemia and IPost. Reversible 10-minute ischemic brain injury in rats was found to lead to increased activity of the C3-component of complement in the first seven days after global ischemia, with the maximal increase in the C3 activity on the 2nd day of reperfusion. IPost leads to a significant increase in the functional activity of complement component C3 on the 7th day of reperfusion.
Key words: ischemic postconditioning, complement component C3, brain, ischemia, rats.
© А. Г. Маркарян, 2012 г. УДК 616-092.19-06:616-057
А. Г. Маркарян
ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ВЫГОРАНИЕ КАК СЛЕДСТВИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО СТРЕССА
Ереванский государственный медицинский университет имени М. Гераци
ВВЕДЕНИЕ
Проблема изучения причин возникновения и развития стресса на работе является актуальной. Непрерывный дисстресс на рабочем месте может привести к формированию синдрома профессионального выгорания, проявляющегося в симптомах эмоционального, умственного истощения, физического утомления, личностной отстраненности и снижения удовлетворения исполнением работы. Известно, что труд врача, сопряженный с ответственностью за судьбу, здоровье и жизнь людей, по сути своей связан с неободимостью проявления сочувствия к психологическому состоянию пациентов, понимания их проблем, сопереживания, так называемой профессиональной эмпатии. И именно
врачи, так же как и психологи, педагоги, социальные работники и другие группы специалистов, наиболее часто подвержены риску развития синдрома профессионального выгорания. Такие факторы, как контакт с большим количеством тяжелобольных, работа в ночное время, повышенная ответственность, частое повторение ситуаций, связанных с необходимостью принятия правильного решения в условиях дефицита времени, могут привести к нарушению психического состояния врача, снижению оптимального рабочего функционального состояния с развитием у них синдрома профессионального выгорания [3-5]. Так возникла необходимость проведения комплексного клинико-эпидемиологического изучения состояния здоровья врачей Республики Армения, одобренного Министерством образования и науки РА. Цель исследования -изучение распространенности синдрома профессионального выгорания у врачей Армении различных специальностей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведено проспективное обсервационное исследование 1475 врачей, работающих в 85 разных медучреждениях страны (поликлиники - 12, сельские медицинские амбулатории - 12, стационары и медицинские центры - 24, подстанции скорой помощи - 5,
