CC BY
49
Активность комплемента при коклюше
О.Н. Кулешина1 (filiana87@mail.ru), С.С. Андина1, О.П. Попова1, Е.Г. Черемных2, Л.В. Козлов1
1ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Москва
2ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН, Москва
Резюме
Гемолитическим методом и новым методом с использованием инфузорий в качестве мишени определены активность и количество С1-ингибитора, а также функциональная активность комплемента в сыворотках крови больных коклюшем детей. Показано, что при коклюше наблюдается потеря количества и функциональной активности С1-ингибитора вследствие его расходования при активации системы комплемента, а также, возможно, благодаря специфическому инактивирующему действию возбудителя на этот белок. Потеря активности С1-ингибитора компенсируется его усиленным биосинтезом и появлением в сыворотке крови свежего белка с высокой удельной активностью. Предложенная методика определения активности комплемента по его действию на инфузории точна и корректна и не содержит недостатков, присущих гемолитическому методу. Активность С1-ингибитора и комплемента зависит от тяжести заболевания и может использоваться в качестве диагностического критерия. Ключевые слова: коклюш, активность комплемента, С1-ингибитор, инфузории
Complement Activity in Whooping Cough
O.N. Kuleshina1 (filiana87@mail.ru), S.S. Andina1, O.P. Popova1, E.G. Cheremnyh2, L.V. Kozlov1
1 Federal Budgetary Institution of a Science «G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology» Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Moscow
2 The Federal State Budgetary Institution «Mental Health Research Center» of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow Abstract
The activity and the amount of C1-inhibitor, as well as the functional activity of the complement hemolytic and the newly developed method with infusoria as a target in the blood serum of children with pertussis are determined. It is shown that there is a loss in whooping cough amount and functional activity of C1-inhibitor due to its consumption as a result of the activation of the complement system, as well, probably due to the specific pathogen the protein inactivation. Loss of C1-inhibitor activity offset reinforced its biosynthesis and appearance of fresh serum protein with high specific activity. The proposed method for determination of complement activity by its effect on the infusoria is accurate and correct and does not contain the disadvantages of hemolytic method. C1-inhibitor activity and complement depends on the severity of the disease and can be used as a diagnostic criterion. Key words: pertussis, the activity of complement, C1-inhibitor, infusoria
Введение
Роль системы комплемента даже в инфекционной патологии не ограничивается участием в элиминации возбудителя при активном осуществлении адаптивной защиты, а состоит также в организации иммунологических и воспалительных процессов, выходящих далеко за рамки лишь ликвидации опасности [8].
Среди бактериальных возбудителей болезней особый интерес может представлять Bordetella pertussis - возбудитель коклюша, поскольку он связывает значительное количество С1-ингибитора, что приводит к устойчивости бактерий к литическо-му действию комплемента из-за нарушения регуляции последнего [7].
Это свойство возбудителя может объяснять наличие отеков как симптоматического признака коклюша, а также ослабление общей иммунной защиты организма, ввиду чего для коклюша характерен высокий уровень сопутствующих инфекций.
Отмеченные особенности побудили исследовать количество и функциональную активность С1-ингибитора в сыворотках крови больных коклюшем разной степени тяжести. Можно было ожидать, с одной стороны, снижения функциональной активности С1-ингибитора в результате прямого воздействия на него возбудителя, а также потребления этого белка в результате активации системы комплемента; с другой стороны, количество и активность С1-ингибитора могли возрастать из-за повышенного биосинтеза его как белка острой фазы [5].
Действительно, любой воспалительный процесс сопровождается активацией системы комплемента, а также повышенной продукцией белков острой фазы - С3 и С4. Организм вынужден синтезировать дополнительно С1-ингибитор для регуляции процесса, чтобы контролировать потребление комплемента и образование анафилатоксинов С3а, С4а и С5а [4, 6, 11].
Противоположные тенденции в действии самого возбудителя на концентрацию С1-ингибитора, потребления комплемента в ходе его активации и острофазной реакции организма могли проявляться в разной степени в зависимости от тяжести патологического процесса. Методы определения количества и функциональной активности С1-ингибитора для дифференциальной диагностики причин отеков были разработаны нами ранее [1].
Для определения функциональной активности компонентов комплемента в настоящее время существует два подхода. Первый - это гемолитические методы для определения общей активности комплемента и отдельных компонентов, второй - методы иммуноферментного анализа для выявления активности отдельных компонентов. Второй подход наиболее точен, однако относительно дорог и сложен. Что касается гемолитических методов, то они просты в качестве оценочных тестов, но сложны для точных определений. Кроме того, главным недостатком гемолитических методов является возможность существенного завышения результатов при исследовании комплемента в сыворотках крови больных в острой фазе развития инфекции [10].
Существует так называемый «свидетельский лизис» эритроцитов (как мишени гемолитической реакции) сывороткой крови лихорадящих больных, обусловленный накоплением в крови комплекса С5Ь6.
Одним из путей решения проблемы разработки адекватных и удобных методов определения комплементарного статуса больного могла бы быть замена сенсибилизированных эритроцитов барана в качестве мишени другими клетками. Такой удобной клеточной мишенью оказались живые инфузории, которые, даже не будучи сенсибилизированными с помощью антител, под действием комплемента обездвиживаются, не лизируясь при этом [9].
Цели настоящей работы - определение количественной и гемолитической активностей комплемента в сыворотках крови больных коклюшем детей, а также разработка удобного для клинического применения адекватного метода определения функциональной активности комплемента.
Материалы и методы
Было обследовано 55 больных коклюшем детей в возрасте от 1 месяца до 13 лет, находившихся на стационарном лечении в Инфекционной клинической больнице № 1 г. Москвы. Диагноз основывался на клинико-эпидемиологических данных и результатах бактериологических и серологических исследований.
По тяжести клинических проявлений дети были разделены на три группы: легкие формы - 10 детей, средней тяжести - 37 и тяжелые - 8. Сопутствующие инфекционные заболевания были диагностированы у 30 детей. Все они относились к больным 2-й (65%) и 3-й групп (75%). У всех пациентов было проведено
определение количества и функциональной активности С1-ингибитора в сыворотке крови.
Для определения С1-ингибитора использовали антитела и конъюгат из набора «Тест-система иммуноферментная для определения С1-ингибитора комплемента человека «ИФА-С1-инг» (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург).
Для определения гемолитической активности компонентов комплемента применялись реагенты ООО «Реаком» Кировского НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ.
Разработанный на кафедре биоорганической химии технологического факультета Московского государственного университета пищевых производств прибор «БиоЛаТ-3.0» [3] позволил автоматизировать биотестирование на инфузориях Tetrahymena pyriformis.
Определение количества С1-ингибитора проводили иммуноферментным методом путем связывания его из сыворотки крови в лунках микропланшета, в которых были сорбированы моноклональные антитела к С1-ингибитору человека. Связавшийся С1-ингибитор обнаруживали конъюгатом других моноклональных антител с пероксидазой хрена, активность которой определяли с использованием хромогенного субстрата - тетраметилбензидина.
Для определения функциональной активности С1-ингибитора проводили связывание его из сыворотки в лунках микропланшета, в которых был сорбирован выделенный нами из человеческой сыворотки естественный лиганд ингибитора - субкомпонент С^ в активированной форме. Процесс выявления функциональной активности С1-ингибитора завершался аналогично определению его количества.
Поскольку имеются конкретные трудности в получении и хранении сохраняющего 100%-ную функциональную активность высокоочищенного препарата С1-ингибитора, было решено выбрать в качестве стандарта пул из не менее чем десяти сывороток здоровых людей, сохраняемый либо в заморжен-ном виде при -20 0С, либо в лиофильно высушенном. Так как среднее содержание С1-ингибитора в сыворотках крови равно 200 мкг/мл, за стандарт условно принимали 200 мкг/мл С1-ингибитора, и за стандарт активности также принималась активность 200 мкг/мл ингибитора. Активность белка в контрольной сыворотке полагали 100%-ной, при том что часть белка в сыворотке крови может находиться в неактивном или инактивированном состоянии. Поэтому более высокая, по сравнению с контролем, удельная активность С1-ингибитора в определяемых образцах, объясняемая высоким обновлением белка, может приводить к парадоксальным, более высоким, значениям активности по сравнению с количеством.
Гемолитическую активность компонентов комплемента определяли планшетным микрометодом [2].
Общую активность комплемента устанавливали по результатам воздействия его на инфузории. В измери-
тельные ячейки прибора «БиоЛаТ-3.0» (рис. 1) вносили 200 мкл суспензии - приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе (рН 7,4), содержащем 0,075 ммоль №С1, 0,075 ммоль Са2+, 0,25 ммоль Mg2+ и 100 мкл того же буфера с 2 - 50 мкл испытуемой сыворотки. Определяли число живых клеток в ячейках каждую минуту путем автоматизированного подсчета с помощью компьютера, подключенного к прибору.
Динамику изменения числа живых клеток во времени для измеряемой активности комплемента
сравнивали с аналогичной динамикой, полученной для контрольного образца, представляющего собой пул десяти сывороток крови здоровых доноров.
Методы расчета основаны либо на определении времени инкубации инфузорий с комплементом, необходимого для гибели половины инфузорий, либо на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Расчет процента актив-
Рисунок 1.
Прибор для измерения скорости гибели инфузорий «БиоЛаТ-3.0»
ности относительно контроля по обеим величинам дает практически совпадающие результаты.
Статистическая обработка результатов проводилась по методу наименьших квадратов для линейной регрессии с определением коэффициента корреляции г, а также по критерию Стьюдента с оценкой достоверности различий Р.
Результаты и обсуждение
В ходе проведенных исследований было обнаружено, что у десяти больных с легкой формой заболевания количество и активность С1-ингибитора составляли 140 мкг/мл, что свидетельствовало о снижении на 30% от нормы благодаря потреблению в результате активации комплемента и/или связыванию ингибитора возбудителем. Количество С1-ингибитора у больных с течением инфекции средней тяжести (37 детей) составляло 170 мкг/мл, а у пациентов с тяжелой формой (8 детей) - 150 мкг/мл, что тоже было несколько ниже нормы. Однако функциональная активность С1-ингибитора и у больных со средней степенью тяжести инфекции, и у тяжелых больных соответствовала норме - 200 мкг/мл. Это может означать, что компенсация снижения количества С1-ингибитора осуществлялась за счет усиления его биосинтеза. Повышенное обновление белка стало причиной его высокой удельной активности. Доля больных, у которых была обнаружена высокая удельная активность С1-ингибитора, среди больных с легкой формой достигала 10%, со средней тяжестью - 27% и среди тяжелых больных - 50%. Таким образом, активность С1-ингибитора как белка острой фазы может быть характеристикой тяжести заболевания. Кроме того, снижение количества и активности С1-ингибитора на ранних стадиях заболевания, а также у больных с легкой формой инфекции, вероятно, обусловлено как прямым воздействием воз-
будителя, так и потреблением комплемента, что может являться причиной симптоматичных отеков.
Второй задачей, стоявшей в этом исследовании, была разработка адекватного метода определения функциональной активности комплемента, удобного для клинического применения. Как указывалось выше, гемолитический метод может давать завышенные результаты вследствие лизиса в острый период воспалительного процесса. Поэтому коклюш мог оказаться весьма наглядным примером для оценки влияния воспалительного процесса на результаты определения активности комплемента двумя методами: стандартным - гемолитическим и новым - по оценке динамики гибели инфузорий под действием на них комплемента (рис. 2).
Была проведена сравнительная оценка активности комплемента 10 сывороток здоровых людей двумя методами - гемолитическим и по действию на инфузории (табл. 1).
Данные этой таблицы показывают адекватность определения активности комплемента двумя методами в сыворотках крови здоровых людей. Однако при гемолитическом методе наблюдаются завышенные результаты по сравнению с методом оценки действия на инфузории (табл. 2).
Таким образом, в методе, где используются инфузории, отсутствует «реактивный лизис», который в гемолитической методике может давать завышение результатов.
При использовании метода с воздействием на инфузории была определена активность комплемента в сыворотках крови 21 больного коклюшем ребенка в возрасте от 1 месяца до 11 лет. У этих же больных детей были определены количество и функциональная активность С1-ингибитора. По тяжести клинических проявлений больные были разделены также на три группы: легкая форма - 3 ребенка,
Рисунок 2.
Динамика гибели инфузорий под действием комплемента сыворотки крови больных коклюшем на примере четырех сывороток
Таблица 1.
Сравнение определения активности комплемента в сыворотках крови здоровых людей гемолитическим методом и по действию на инфузории (г = 0,9)
№ сыворотки Активность комплемента по гемолизу, % от нормы Активность комплемента на инфузориях, % от нормы
1 129 123
2 112 115
3 132 121
4 193 183
5 153 119
6 94 94
7 69 54
8 75 105
9 104 113
10 90 98
Таблица 2.
Сравнение определения активности комплемента в сыворотках крови больных коклюшем в острой фазе гемолитическим методом и по действию на инфузории
Активность комплемента по гемолизу, % от нормы Активность комплемента на инфузориях, % от нормы*
50 33,8
50 40,7
100 36,5
50 35,7
100 40,8
Примечание: *Р < 0,03.
средней тяжести - 15 и тяжелая форма - 3 (ре- желой - были близки норме. Компенсация проис-
зультаты приведены на рис. 3). ходила за счет усиления биосинтеза, о чем свиде-
Как и в предыдущих сериях опытов, активность тельствовала высокая удельная активность вновь
и количество С1-ингибитора были снижены только синтезированного белка при заболевании средней
при легкой форме заболевания, при средней и тя- тяжести. Следует отметить, что активность компле-
Рисунок 3.
Активность и количество С1-ингибитора (мкг/мл), а также активность комплемента (% от нормы), определенные одновременно в сыворотках крови групп больных коклюшем с легкой (3 ребенка), средней (15 детей) и тяжелой (3 ребенка) формами заболевания
Рисунок 4.
Обратная зависимость между активностями комплемента и С1-ингибитора в сыворотках крови детей, больных коклюшем
мента была существенно ниже нормы и падала по мере увеличения тяжести болезни.
Таким образом, активность комплемента, а также активность и количество С1-ингибитора имели противоположные тенденции - в зависимости от тяжести заболевания. На рисунке 4 представлен график, отражающий обратную зависимость активностей комплемента и С1-ингибитора.
Выводы
1. При коклюше наблюдается снижение функциональной активности С1-ингибитора вследствие его расходования на активацию системы комплемента, а также, возможно, благодаря специфическому инактивирующему действию возбудителя на этот белок. Потеря
активности С1-ингибитора компенсируется его усиленным биосинтезом и появлением в сыворотке крови свежего белка с высокой удельной активностью. Именно это обстоятельство позволяет относить С1-ингибитор к белкам острой фазы болезни.
2. Предложенная методика определения активности комплемента по его действию на инфузории точна и корректна и не содержит недостатков, присущих гемолитическому методу.
3. Изучение поведения комплемента при коклюше показало, что его активность зависит от тяжести заболевания и что комплемент может использоваться в качестве диагностического критерия. н
Литература
1. Андина С.С., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества С1-ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков // Биомедицинская химия. 2004. Т. 50. № 1. С. 86 - 91.
2. Козлов Л.В., Вавилова Л.М., Голосова Т.В. Микрометод определения факторов комплемента // Иммунология. 1985. № 3. С. 66 - 68.
3. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований // Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.2009 г. Бюл.№20.
4. Chae Y.M., Park J.K. The relationship between brachial ankle pulse wave velocity and complement 1 inhibitor // J. Korean Med. Sci. 2009. V. 24. P. 831-836.
5. Dorresteijn M.J., Visser T., Cox L.A. et al. C1-esterase inhibitor attenuates the inflammatory response during human endotoxemia // Crit. Care Med. 2010. V. 38. P. 2139 - 2145.
6. Kalter E.S., Daha M.R., ten Cate J.W. et al. Activation and inhibition of Hageman factor-dependent pathways and the complement system in uncomplicated bacteremia or bacterial shock // J. Infect. Dis. 1985. V. 151. P 1019 - 1027.
7. Marr N., Luu R.A., Fernandes R.C. Bordetella pertussis binds human C1 esterase inhibitor during the virulent phase, to evade complement-mediated killing // J. Infect. Dis. 2007. V. 195. P. 585 - 588.
8. Ricklin D., Hajishengallis G., Yang K. et al. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis // Nat. Immunol. 2010. V. 11. P. 785 - 797.
9. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis // Immunology. 1958. V. 1. P. 291 - 299.
10. Thompson R.A., Rowe D.S. Reactive haemolysis - a distinctive form of red cell lysis // Immunology. 1968. V. 14. P. 745 - 762.
11. Woo P., Lachmann P. J., Harrison R.A. et al. Simultaneous turnover of normal and dysfunctional C1-inhibitor as a probe of in vivo activation of C1 and contact activatable proteases // Clin. Exp. Immunol. 1985. V. 61. P 1 - 8.
