CC BY
30
УДК 615.277.3:611.13/.16-02 Д.А. Хоченков1, Н.С. Сапрыкина2, М.А. Барышникова3, С.А. Полозкова4, В.А. Горбунова5, А.Ю. Барышников6 НОВЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АРАНОЗЫ - БЛОКАДА НЕОАНГИОГЕНЕЗА
1к.б.н., научный сотрудник лаборатории биомаркеров и механизмов ангиогенеза опухолей НИИ ЭДиТО «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
2научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
3к.фарм.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
4аспирант отделения химиотерапии НИИ клинической онкологии «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» 5д.м.н., профессор, заведующая отделением химиотерапии НИИ клинической онкологии «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» 6д.м.н., профессор, директор НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», заведующий лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей
Адрес для переписки: 115478 Москва, Каширское ш., 24, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, Барышникова Мария Анатольевна e-mail: biotherapy rbi@mail.ru
Резюме
Изучено влияние на неоангиогенез аранозы (арабинопиранозилметил нитрозомочевина) - оригинального отечественного противоопухолевого препарата. Ранее в экспериментах на животных было показано, что арано-за обладает значительным противоопухолевым действием на эпителиальные солидные опухоли. Мышам BDF1(C57Bl/6*DBA/2) вводили подкожно эпидермоидную карциному легких Льюис. На 10 сутки опухолевый узел достигал объема 500-800 мм3 и животным вводили однократно в/в аранозу в дозах 180 мг/мл, 240 мг/мл и 360 мг/кг. На 3; 5 и 8 сутки после введения препаратов мышей забивали, опухоль извлекали и помещали в 10 %-ный р-р формалина. Гистологическое исследование проводили на срезах опухолей, окрашенных гемотоксили-ном и эозином. Исследование количества микрососудов в опухоли проводили на срезах опухолей стандартным иммуногистохимическим методом с использованием антител против CD31. Однократное введение аранозы мышам с перевитой карциномой Льюис вызывало снижение числа кровеносных сосудов в тканях опухоли. Установлена зависимость между концентрацией вводимого препарата и снижением количества сосудов. Наибольшее снижение числа сосудов было получено при введении аранозы в концентрации 360 мг/кг. Эффект снижения числа сосудов в опухоли сохранялся на протяжении 8 суток после введения препарата.
Ключевые слова: араноза, неоангиогенез, иммуногистохимия, CD31. A NEW MECHANISM OF THE ARAÑOSE ACTION - NEOANGIOGENESIS BLOKADE
Summary
Theinfluenceofthe Aranose (Arabinopyranosyl-N-methyl-N-nitrosourea), the original domestic antitumor drug, on neoangiogenesiswasstudied. Previous experiments performed on animals showed that the aranose had significant antitumor action onsolid epithelial tumors. BDF1(C57Bl/6*DBA/2) mice had been injected with epidermoid Lewis lung carcinoma. The tumor nodule had reached 500-800 mm3by the 10th day and mice received a single intravenous injection of the aranose of 180 mg/ml, 240 mg/ml and 360 mg/kg. Mice were devitalized on the 3rd, 5th and 8th day after preparation administration; tumors were retrieved and placed in 10% formalin. Histological assessments were performed on tumor slices stained with hematoxylin and eosin. The standard immunohistochemical method with antibodies against CD31 was used for analysis of tumor microvessels on tumor slices. A single injection of the aranose to mice with intortedLewis carcinoma leaded to decrease of blood vessels quantity in the tumor tissue. The maximum decrease was seen at injection of the aranose in concentration of 360 mg/kg. The effect of blood vessels decrease was seen during 8 days after aranose administration.
Key words: aranose, neoangiogenesisimmunohi;
Введение
Одним из новых направлений химиотерапии опухолей является антиангиогенная терапия. Неоангиогенез в опухоли отличается от нормального ангиогенеза рядом особенностей [1]. В эндотелии сосудов имеются рецепторы VEGF, которые являются мишенями для таргетной терапии [2]. Кроме
istry, CD31.
того, в эндотелии сосудов в опухоли имеется большое количество других мишеней, воздействие на которые блокирует опухолевый рост [3]. При недостатке кровеносных сосудов опухолевые клетки сами формируют подобие сосудов, по которым поступает кровь, это так называемый феномен сосудистой мимикрии [4-12]. В этих структурах имеются свои молекулы, которые могут быть мишенью
для терапии опухолей.
Противоопухолевые химиопрепараты также могут обладать антиангиогенным свойством [1315]. Ранее при скрининге и изучении механизма действия противоопухолевых препаратов не изучалось их антиангиогенное действие. Это обусловлено отсутствием в то время необходимых моделей [1]. С появлением большого числа новых антиан-гиогенных препаратов возрос интерес к выяснению антиангиогенного действия старых, хорошо зарекомендовавших себя в клинической практике противоопухолевых препаратов.
Араноза (арабинопиранозилметил нитрозо-мочевина) - оригинальный отечественный препарат, обладающий значительным противоопухолевым действием на эпителиальные солидные опухоли, на которые другие аналогичные препараты действуют значительно слабее [16; 17]. Препарат используется в клинической практике с 1996 г. для лечения меланомы [18-20]. Цитотоксический механизм действия аранозы связан с индукцией метилирования ДНК в О6-позиции гуанина, что, в конечном счете, приводит к гибели клетки [21-23]. Смерть клетки под действием аранозы проходит по механизму апоптоза [24]. В механизм апоптоза под действием аранозы вовлекается, как внешние пути (в том числе CD95/Fas сигнальный путь [25]), так и внутренние. Целью настоящей работы было изучение влияние аранозы на неоангиогенез.
Материалы и методы
Животные и опухоли
В работе были использованы мыши гибриды BDF1 (C57Bl/6xDBA/2), самцы. Животные были получены из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и содержались в условиях вивария ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина»
Штамм опухоли эпидермоидной карциномы легких Льюис (LLC) был получен из Банка опухолевых штаммов ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина». Животным прививали LLC п/к(в середину бока мыши) по 0,3 мл приготовленной по стандартной методике взвеси опухолевых клеток в среде 199. При достижении подкожным опухолевым узлом объёма 500-800 мм3 отбирали мышей с примерно равным объёмом опухоли и методом случайной выборки формировали контрольную и терапевтические группы.
Лекарственные средства
«Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» 500 мг производства филиала «Наукопрофи» ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина». Препарат растворяли в 5 %-ном растворе глюкозы (ООО «Мосфарм») и на 10 сутки после трансплантации опухоли вводили мышам из терапевтических групп однократно в/в (в хвостовую вену) в дозах 360; 240 и 180 мг/кг. По литературным данным ЛД]0 лекарственной формы арано-зы для мышей составляет 370 мг/кг[26].
Взятие гистологических образцов
На 3; 5 и 8 сутки после введения препаратов животных из контрольной и терапевтических групп (по 2 животных, выбранных слепым методом, из каждой группы на каждый срок) усыпляли. Выделяли подкожный опухолевый узел, который помещали в 10 %-ный р-р формалина. Через сутки опухоль извлекали из формалина, помещали в 70 %-ный р-р этилового спирта и в таком виде хранили до проведения гистологических работ.
Определение числа кровеносных сосудов
в образцах опухоли
Гистологическое исследование проводили на срезах опухолей, окрашенных гемотоксилином и эозином. Для этого в патологоанатомическом отделении ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» депара-финизированные срезы толщиной 4 мкм окрашивали гемотоксилином и эозином по стандартной методике. Исследование количества микрососудов в опухоли проводили на срезах опухолей стандартным иммуногистохимичесим методом с использованием антител против антигена CD31 (поликло-нальная кроличья антисыворотка, разведенная 1 : 50, ab28364, Abcam). Инкубацию проводили в течение 18 ч при +4 °С.
Проявку результатов проводили при помощи LSAB-системы Envision+ kit (Dako), с последующим внесением красителя - DAB+ (Novex). Стекла докрашивали гематоксилином (BioVitrum) и заключали в покровное стекло. Результаты иммуно-гистохимического окрашивания исследовали при помощи микроскопа Nikon 80i с фотокамерой DS-Fi-1 при увеличении 200 х.
Подсчет количества CD31+ микрососудов проводили в 5 областях среза с 2 образцов опухоли, содержащих их максимальное количество (т.н. «hot-spots» области) и вычисляли среднее значение. Подсчитывали количество окрашенных структур вне зависимости от наличия просвета в сосуде.
Статистическую обработку проводили по непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова [27].
Результаты
К 3 дню после введения препарата в не леченной опухоли обнаружили 32 микрососуда, к 5 дню количество микрососудов возрастало до 46 и снижалось до 39 к 8 дню (табл. 1). При однократном в/в введении мышам аранозы в дозе 180 мг/кг количество микрососудов в опухоли не изменялось и колебалось на уровне 28-29. При введении аранозы в дозе 240 мг/кг количество микрососудов колебалось на уровне 22 - 26. Араноза в дозе 360 мг/кг оказывала еще более сильное снижение количества микрососудов (14-20). На рис. 1 представлено графическое изменение количества микрососудов, окрашенных моноклональными антителами против антигена CD31. Араноза оказывала дозо-зависимый эффект. На рис. 2-4 продемонстрированы результаты иммуногистохимического окрашивания ткани опухоли МКА анти-CD31.
Выводы
1. Однократное введение аранозы мышам с перевитой карциномой Льюис снижает число кровеносных сосудов в тканях опухоли.
2. Установлена зависимость между концентрацией вводимого препарата и сни-
Изменение количества микрососудов под действием
жением количества микрососудов - наибольшее снижение числа сосудов было получено при введении аранозы в концентрации 360 мг/кг.
3. Эффект снижения числа сосудов в опухоли сохранялся на протяжении 8 суток после введения препарата.
Таблица
Сутки после введения аранозы Контроль Концентрация аранозы, мг/кг
180 240 360
3 32,5±4,8 28,5±8,6* 22,2±2,7* 20,4±3,8*
5 46,5±7,15 29,7±6,0* 21,5±3,9* 14,8±2,2*
8 39,1±5,2 29,0±3,7* 25,5±6,3* 20,0±5,7*
*р<0,05 по отношению к контрольной группе
вО-1
3 сутки 5 сутки 8 сутки
Рис. 1. Изменение количества СБ31-положительных сосудов под действием аранозы: *,**,***р <0,05 по отношению к контрольной группе.
Рис. 2. Количество микрососудов в образцах карциномы Льюис на 3 сутки
А: контрольная группа; Б: араноза 180 мг/кг; В: араноза 240 мг/кг; Г: араноза 360 мг/кг.
Рис. 3. Количество микрососудов в образцах карциномы Льюис на 5 сутки.
А: контрольная группа; Б: араноза 180 мг/кг; В: араноза 240 мг/кг; Г: араноза 360 мг/кг.
Рис. 4. Количество микрососудов в образцах карциномы Льюис на 8 сутки.
А: контрольная группа; Б: араноза 180 мг/кг; В: араноза 240 мг/кг; Г: араноза 360 мг/кг.
Литература
1. Степанова Е.В., Барышников А.Ю., Личиницер М.Р. Оценка ангиогенеза опухолей человека // Успехи современной биологии. - 2007. - Т. 120, № 6. - С. 599-604.
2. Vartanian A.A., Stepanova E. V., Grigorjeva I. et al. VEGFR1 and PKCa signaling control melanoma vasculogenic mimicry in a VGFR2 kinasa-idependent manner - Melanoma Resегrch. - 2011. - 21(2). - P. 91-8.
3. Голышко П.В. Молекулярные мишени антиангиогенной терапии - Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 4. - С. 83-92.
4. Григорьева И.Н., Бурова О.С., Степанова Е.В. и др. Способность клеточных линий метастатической мела-номы кожи к васкулогенной мимикрии - Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 4. - С. 97-102.
5. Григорьева И.Н., Степанова Е.В., Барышников А.Ю. Клиническое значение васкулогенной мимикрии для больных меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 3. - С. 25-30.
6. Григорьева И.Н., Харатешвили Т.К., Барышников А.Ю. Васкулогенная мимикрия: альтернативный механизм кровоснабжения опухоли? // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 1. - С. 20.
7. Vartanian A.A., Stepanova E. V., Gutorov S. V. et al. Prognostic significance of periodic acid-schiff-positive patterns in clear cell renal carcinoma // The Canadian Journal of Urology. - 2009. - Vol. 16, № 4. - Р. 4726-32.
8. Vartanian A.A., Stepanova E. V., Grigorjeva I. et al. VEGFR1 and PKCa signaling control melanoma vasculogenic mimicry in a VGFR2 kinasa-idependent manner // Melanoma Resorch. - 2011. - Vol. 21, № 2. - P. 91-8.
9. Vartanian A.A., Burova O.S., Stepanova E. V. et al. The involvement of apoptosis in melanoma vasculogenic mimicry // Melanoma Research. - 2007. - Vol. 11, № 1. - P. 1-8.
10. Vartanian A.A., Burova O.S., Stepanova E. V. et al. Melanoma vasculogenic mimicry is strongly related to reactive oxygen species level // Melanoma Research. - 2007. - Vol. 17, № 6. - P. 370-9.
11. Vartanian A.A., Baryshnikov A. Yu. Crosstalk between apoptosis and antioxidants in melanoma vasculogenic mimicry // Advances in Experimental Medicine and Biology. - 2007. - Vol. 601. - P. 145-53.
12. Vartanian A.A., Stepanova E.V., Grigorieva I. еt al. Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling // Microcirculation. - 2011. - Vol. 18, № 5. - P. 390-9.
13. Соломко Э.Ш., Степанова Е.В., Личиницер М.Р., Барышников А.Ю. Оценка антиангиогенной активности in vitro: опыт Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 3-7.
14. Соломко Э.Ш., Степанова Е.В., Абрамов М.Е. и др. Ингибиторы ангиогенеза растительного происхождения: перспективы использования клинической онкологии - Российский биотерапевтический журнал. -2010. - Т. 9, № 4. - С. 3-10.
15. Лацерус Л.А., Пинигина Н.М., Барышников А.Ю., Степанова Е.В. Антиангиогенные свойства препарата Абисилин in vivo и in vitro // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 1. - С. 13-6.
16. Горбунова В.А., Орел Н.Ф., Семина О.В. и др. Араноза - новый отечественный противоопухолевый препарат // Вопросы онкологии. - 2001. - № 6. - С. 672-5.
17. Муханов В.И. Новый противоопухолевый препарат - араноза // Химиотерапия опухолей в СССР. - 32. - С. 133-9.
18. Полозкова С.А., Степанова Е.В., Барышников А.Ю. и др. Экспрессия MGMT в опухолевой ткани при лечении пациентов с нейроэндокринными опухолями режимами на основе аранозы // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 4. - С. 21-6.
19. Лихванцева В.Г., Оборотова Н.А., Когония Л.М. и др. Первый опыт применения аранозы в лечении увеаль-ных меланом // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, № 3. - С. 34-9.
20. Барышников А.Ю., Шпрах З.С. Отечественные противоопухолевые препараты. В кн: Рациональная фармакотерапия в онкологии. Под ред. М.И.Давыдова и В.А.Горбуновой. - М., 2015. - С. 209-19.
21. Liu L, Gerson S. Targeted modulation of MGMT: clinical application - Clin. Cancer Res. - 2006. - 12. - P. 328-31.
22. Горбачева Л.Б., Кукушкина Г.В. Роль О-6-алкилтрансфераз в реализации цитотоксической активности N-нитрозомочевин // Актуальные проблемы фармакологии и поиск новых лекарственных препаратов. Труды конф. - Томск, 1990. - Т. 4. - С. 98-100.
23. Горбачева Л.Б., Кукушкина Г.В. Возможные механизмы лекарственной устойчивости к N-нитрозомочевинам (обзор) // Хим.-фарм. журнал. - 1987. - № 4. - С. 390-8.
24. Грищенко Н.В., Альбассит Б., Барышникова М.А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 49-54.
25. БарышниковаМ.А., Грищенко Н.В., Бурова О.С. и др. Роль CD95/Fas рецептора в индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, №3. - С. 3-8.
26. Перетолчина Н.М., Семина О.В. Араноза - новый отечественный противоопухолевый препарат из группы нитрозомочевины. - Экспериментальная онкология на рубеже веков / Под ред. Давыдова М.И. и Барышникова А.Ю. - М.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2003. - С. 201.
27. Ликеш И., Ляга Й. Основные таблицы математической статистики / Пер. с чешск. - М.: Финансы и статистика, 1985. - 356 с.
Таблицы должны быть компактными, иметь название, не повторять графики. Размерность величин следует указывать через запятую. Таблица не должна содержать пустых ячеек (отсутствие данных должно отмечаться тире, «нет данных» или специальным примечанием). Все уточнения и локальные сокращения выносятся в подтабличные примечания. Каждое примечание нужно располагать с новой строки, помечать надстрочной буквой (а, б, в и.т.д.).
Размер каждого рисунка должен быть не менее 10 х 10 см при разрешении не менее 300 dpi. Если под одной подписью планируется несколько рисунков (фотографий, рентгенограмм), каждый должен быть прислан отдельно и соответствовать указанным выше требованиям, подпись к рисунку должна быть лаконичной, точно соответствовать его содержанию. Если несколько рисунков идут под общей подписью, то сначала приводят ее, а затем названия отдельных рисунков. В подписях к микрофотографиям следует указать методику микроскопии, увеличение, метод окраски материала.
Все формулы должны быть тщательно выверены автором, набраны или встроены в формат текстового редактора. В формулах необходимо размечать строчные и прописные, латинские и греческие, подстрочные и надстрочные буквы и символы. Использованные автором сокращения должны быть разъяснены под формулой,
Список литературы должен быть кратким и содержать не более 20 ссылок для статей из разделов «Экспериментальные исследования», «Клинические исследования», «Клинические лекции», «Случай из практики» и не более 100 ссылок для обзорных статей. Литературные источники перечисляют в списке литературы в порядке цитирования, В тексте статьи ссылки на номер источника представляют в квадратных скобках. Ссылки должны быть пронумерованы в соответствии с их положением в списке литературы.
Все литературные источники, перечисленные в списке литературы, должны иметь соответствующую ссылку в тексте. Фамилии иностранных авторов приводятся в оригинальной транскрипции. В список литературы не включают ссылки на неопубликованные работы. Ссылки должны быть тщательно выверены авторами, которые несут ответственность за правильность приведенных данных. В каждой ссылке должны быть указаны все авторы. Если авторов не более трех, их фамилии и инициалы пишут в начале ссылки, затем следуют название работы и выходные данные издания, если авторов четыре и более, то сначала пишут название работы, затем фамилии и инициалы всех авторов, затем выходные данные издания. Это касается ссылок на любые издания: книги, журналы, сборники и т. д.
Иванов И. И. Хронические гастриты. - 3-е изд. - М.: Медицина, 1986. - 148 с.
Хронические гастриты / Иванов И. И., Петров П. П., Сидоров С. С, Федоров Ф. Ф. - 3-е изд. - М.: Медицина, 1986.- 148 с.
При ссылке на книгу следует указывать авторов, название книги, номер издания (может отсутствовать), место издания, издательство (может отсутствовать), год и страницы (если автор ссылается на всю книгу, то пишется 150 с, если - на ее часть, то указывается С. 145-150), например:
Баадер В. Ю. Биогаз: теория и практика. - 3-е изд.- - М.: Колос, 1986.- 148 с.
Schrier R. Manual of nephrology. - 4th ed. - New York: Little, Brown and company, 1995.- P. 170-187.
При ссылке на главу из книги, написанной коллективом авторов, указывают авторов главы и ее название, затем название книги, ее редакторов, номер издания (может отсутствовать), место издания, издательство (может отсутствовать), годы страницы, например:
Кэйн Д. Этические и правовые основы медицинской помощи // Гинекология по Эмилю Новаку: Пер. с англ. / Под ред. Д. Берека, И. Адаши, П. Хиллард. - М.: Практика, 2002. - С. 14-18.
Cain J. Principles of patient care // Novak's Gynecology/ Berek J,, Adashi E., Hillard P. (eds.). - 12th ed. - Baltimore: Williams & Wilkins, 1996. -P. 14-18.При ссылке на журнал указывают авторов, название статьи, журнала (в традиционном сокращении), год, том, номер (может быть только том или номер) и страницы, например:
