CC BY
36
УДК 577.21
Новый гибридный промотор ARE-hTERT для генной терапии рака
С. В. Калиниченко1*, М. В. Шепелев1**, П. Н. Вихрева12, И. В. Коробко1
'Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5, Россия
2MRC Toxicology Unit, University of Leicester, Leicester, UK
#Эти авторы внесли равный вклад в выполнение работы.
*E-mail: mshepelev@mail.ru
Поступила в редакцию 09.07.2017
Принята к печати 30.10.2017
РЕФЕРАТ Сконструирован новый гибридный опухолеспецифический промотор ARE-hTERT, состоящий из промотора гена TERT человека (hTERT) и генетических элементов антиоксидантного ответа (ARE) из промотора гена GCLM человека. Показано, что транскрипционная активность гибридного промотора повышена в опухолевых клетках с аномально активным фактором транскрипции Nrf2 и при индукции окислительного стресса, но при этом сохраняет опухолеспецифичность базального промотора hTERT. В in vitro схеме генной терапии фермент-пролекарство с применением химерного белка цитозиндезамина-за : урацилфосфорибозилтрансфераза и 5-фторцитозина гибридный промотор ARE-hTERT вызывал более выраженную гибель обработанных/необработанных химиотерапевтическими препаратами опухолевых клеток, чем промотор hTERT. Созданный нами гибридный промотор можно рассматривать в качестве лучшей альтернативы промотору hTERT в схемах генной терапии рака.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА промотор hTERT, ARE-элементы, окислительный стресс, гибридный промотор, генная терапия рака, опухолеспецифический промотор.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ARE (antioxidant response element) - элементы антиоксидантного ответа; CMV (cytomegalovirus) - цитомегаловирус; GCLM (glutamate-cysteine ligase modifier subunit) - регуляторная субъединица глутамат-цистеин-лигазы; TERT (telomerase reverse transcriptase) - теломеразная обратная транскриптаза; tBHQ - (tert-butylhydroquinone) - mepm-бутилгидрохинон; АФК - активные формы кислорода; ОЕЛ - относительные единицы люминесценции; СО - стандартное отклонение; ЦД : УФРТ - химерный белок дрожжевая цитозиндезаминаза : урацилфосфорибозилтрансфераза; 5ФЦ - 5-фторцитозин.
ВВЕДЕНИЕ
Генная терапия является динамически развивающимся подходом, применяемым при онкологических заболеваниях. В настоящее время получено разрешение на клиническое использование нескольких генно-терапевтических препаратов. Большое число препаратов находится на разных стадиях клинических исследований, и еще больше разрабатывается в лабораториях. Предложены различные подходы к обеспечению специфичности генно-терапевтиче-ских средств в опухолевых клетках, включая посттранскрипционную регуляцию уровня экспрессии трансгена за счет селективной стабилизации транскрипта в опухолевых клетках [1] или дестабилизации транскрипта в нормальных клетках [2]. При этом одной из наиболее используемых стратегий обеспечения специфичности генной терапии рака остается активация экспрессии трансгена преимущественно в опухолевых клетках за счет опухолеспецифиче-ских промоторов [3].
Использование опухолеспецифических промоторов, успешно применяемых во многих случаях, связано с рядом проблем, включая неабсолютную специфичность и низкую активность, что влияет на уровень экспрессии трансгена и соответственно на терапевтический эффект. В частности, один из наиболее охарактеризованных опухолеспеци-фических промоторов - промотор гена теломеразы человека (hTERT), активен в различных опухолях, что обеспечивает возможность воздействия на опухолевые клетки различного происхождения [3-7]. Тем не менее, промотор hTERT является достаточно слабым, что может влиять на эффективность проводимой терапии. Поэтому было предпринято несколько попыток повышения активности промотора hTERT. Показано, что слияние промотора hTERT с синтетическим ТАТА-боксом (нативный hTERT промотор не содержит ТАТА-бокс) или с минимальным ран-ним/предранним промотором цитомегаловируса (СМ^) увеличивает активность промотора hTERT [8,
9]. Однако активность hTERT-промотора сильно зависит от используемых опухолевых клеточных линий, что снижает преимущество его универсальности [10]. Учитывая эти данные, можно констатировать, что необходимы новые подходы к усилению активности промотора hTERT в опухолевых клетках с сохранением его опухолеспецифичности.
Такие промоторы, как hTERT, проявляют опу-холеспецифичность в результате их реактивации в опухолевых клетках, поэтому специфичность экспрессии трансгена можно повысить за счет использования генетических регуляторных элементов, которые либо отвечают на измененное микроокружение опухоли, либо аномально активны из-за соматических мутаций в опухолевых клетках. В качестве примера этой стратегии можно привести сгэ-действующие регуляторные элементы, определяющие транскрипционный ответ на окислительный стресс или гипоксию, характерные для многих опухолей. В частности, элементы антиоксидант-ного ответа (ARE), с которыми связывается фактор транскрипции Nrf2, основной активатор ответа на окислительный стресс, способны обеспечивать опухолеспецифическую экспрессию трансгена при соединении с базальным промотором [11]. В такой системе транскрипция поддерживается за счет аномальной активации Nrf2 в ответ на окислительный стресс или вследствие соматических мутаций, вызывающих конститутивную активацию Nrf 2.
В данной работе показано, что комбинация ARE и опухолеспецифического промотора hTERT приводит к увеличению активности гибридного промотора ARE-hTERT в опухолевых клетках по сравнению c промотором hTERT. В то же время эта модификация не влияет на активность промотора в неопухолевых клетках, в которых Nrf2 в нормальных условиях не активен. Данный подход можно использовать для увеличения уровня экспрессии трансгенов и активности терапевтических белков в опухолевых клетках без снижения их специфичности.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культивирование клеточных линий
Клеточные линии рака легкого человека Calu-1 (эпидермоидная карцинома, ECACC #93120818), NCI-H1299 (немелкоклеточный рак, ATCC #CRL-5803), A549 (немелкоклеточный рак, ATCC #CRL-185) и NCI-H358 (немелкоклеточная брон-хоальвеолярная карцинома, ATCC #CRL-5807) культивировали в среде DMEM/F12 (1 : 1) (HyClone, США), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (HyClone), пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) (Gibco, Великобритания). Клетки
бронхиального эпителия человека HBEpC (ECACC #502-05) культивировали в среде Bronchial Epithelial Growth Medium (Lonza, Швейцария). Для проведения экспериментов по оценке жизнеспособности клеток или измерению активности люциферазного репортерного гена клетки рассевали в лунки 24-лу-ночного планшета: NCI-H1299 - 20000 клеток на лунку; A549 - 30000; Calu-1 - 40000; NCI-H358 - 150000; HBEpC - 80000. На следующий день клетки транс-фицировали с помощью реагента для трансфекции Unifectin-56 (Rusbiolink, Россия) в соответствии с протоколом производителя.
Плазмиды
Плазмида phTERT-Luc, несущая кДНК люцифе-разы светлячка под контролем промотора hTERT (-206... + 37 н.), описана ранее [10]. Плазмида pARE-hTERT-Luc, несущая кДНК люциферазы светлячка под контролем гибридного промотора ARE-hTERT, получена путем клонирования 56 п.н. ARE-элемента (TGAGTAACGGTTACGAAGCACTT-TCTCGGCTACGATTTCTGCTTAGTCATTGTCTT) из промотора гена GCLM человека в 5'-область промотора hTERT в плазмиду phTERT-Luc [12]. Плазмиды phTERT-CD : UPRT и pARE-hTERT-CD : UPRT для продукции химерного белка дрожжевая цитозиндезаминаза : урацилфосфорибозилтрансфе-раза (ЦД : УФРТ) под контролем промоторов hTERT или ARE-hTERT соответственно созданы на основе вектора pBluescriptll SK- (Stratagene, США) [13]. Сигнал терминации транскрипции и полиаде-нилирования вируса SV40 из плазмиды pBK-CMV (Stratagene) клонировали в З'-область кДНК ЦД : УФРТ.
Химические вещества
Использовали терт-бутилгидрохинон (tBHQ), док-сорубицин, цисплатин, этопозид и 5ФЦ производства Sigma-Aldrich, США.
Измерение активности репортерного гена люциферазы
Смесью репортерной плазмиды, несущей кДНК лю-циферазы светлячка (phTERT-Luc, pARE-hTERT-Luc или pGL3-Basic (плазмида без промотора, Promega, США)) и плазмиды pRL-CMV (Promega), несущей кДНК люциферазы Renilla под контролем предраннего энхансера/промотора CMV, трансфи-цировали по три лунки для каждой экспериментальной точки. До определения активности люциферазы клетки, если указано специально, обрабатывали 100 мкМ tBHQ в течение 24 ч. Активность люциферазы измеряли через 2 дня после трансфекции с использованием набора реагентов Dual-Luciferase® Reporter
Assay System (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Активность люциферазы светлячка нормировали на активность люциферазы Renilla и вычисляли среднее значение относительных единиц люминесценции (ОЕЛ) и стандартное отклонение (СО).
Измерение жизнеспособности клеток
Клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими ЦД : УФРТ, или пустым вектором pBK-CMV и рассевали в лунки 96-луночного планшета через 24 ч после трансфекции (2000 клеток линий NCI-H1299, A549 и Calu-1 на лунку; 5000 - клеток линии NCI-H358). 5ФЦ и/или этопозид, цисплатин или доксорубицин добавляли к клеткам через 24 ч после рассева. Культуральную среду, содержащую 5ФЦ и/или химиотерапевтические препараты, меняли на свежую через 24 и 96 ч инкубации. Культуральная среда клеток, инкубируемых в течение 24-96 ч, если указано, содержала tBHQ в концентрации 100 мкМ. Количество живых клеток оценивали после 120 ч инкубации с использованием набора реагентов CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Каждую экспериментальную точку анализировали в трех повторах. Количество живых клеток нормировали на принятое за 100% количество живых клеток, инкубированных в отсутствие 5ФЦ и химио-терапевтических препаратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Дизайн гибридного промотора ARE-hTERT
Способность различных ARE из генов, регулируемых транскрипционным фактором Nrf2, обеспечивать экспрессию трансгена в условиях окислительного стресса была проанализирована ранее. Показано, что наивысший уровень экспрессии трансгена обеспечивал ARE GCLM [12]. На основании этих данных мы поместили элемент ARE из промотора гена GCLM человека в 5'-область относительно фрагмента -206... + 37 н. промотора hTERT, содержащего сайт начала транскрипции и способного обеспечивать опухоле-специфическую экспрессию трансгена [5].
Активность гибридного промотора ARE-hTERT в опухолевых и нормальных клетках
Активность промоторов hTERT и ARE-hTERT в нормальных и опухолевых клетках сравнивали с помощью двойного люциферазного теста. В трех из четырех клеточных линий рака легкого человека (NCI-H1299, Calu-1 и A549) активность промотора ARE-hTERT была в 2-3 раза выше активности промотора hTERT, тогда как в клетках линии NCI-H358
присутствие ARE не влияло на активность промотора (рис. 1, образцы «-tBHQ»). Важно отметить, что не выявлено влияния ARE на активность гибридного промотора в неопухолевых клетках HBEpC: относительная активность люциферазы в клетках, трансфицированных плазмидами pARE-hTERT-Luc и phTERT-Luc, составляла 1.41 ± 0.45 и 1.00 ± 0.214 (P = 0.2272, двунаправленный t-критерий Стьюдента) соответственно. Следовательно, в трех из четырех клеточных линий рака легкого человека промотор ARE-hTERT был более активен, чем промотор hTERT, при этом модификация не влияла на его активность в нормальных клетках.
Индукция окислительного стресса стимулирует активность гибридного промотора
Мы изучали возможность увеличения активности промотора ARE-hTERT в опухолевых клетках под действием окислительного стресса. Обработка клеток линии NCI-H358 веществом tBHQ приводила к ~2.5-кратному увеличению активности репор-терного гена люциферазы под контролем промотора ARE-hTERT, но не влияла на активность промотора hTERT (рис. 1, образцы «+tBHQ»), что согласуется с данными о влиянии внешнего окислительного стресса на активность ARE гена GCLM [12]. Добавление tBHQ не влияло на активность промотора ARE-hTERT в клетках Calu-1, A549 и NCI-H1299, в которых активность промотора ARE-hTERT была существенно выше активности hTERT-промотора в отсутствие индукции окислительного стресса (рис. 1, образцы «+tBHQ»). Таким образом, в опухолевых клетках в базальных условиях гибридный промотор ARE-hTERT проявляет более высокую активность, чем промотор hTERT. Это может быть следствием часто наблюдаемой в опухолевых клетках аномальной активации транскрипционного фактора Nrf2, обусловленной соматическими мутациями, либо повышенным уровнем активных форм кислорода (АФК) [14-19]. Транскрипционную активность промотора ARE-hTERT в клетках с ее низким ба-зальным уровнем можно увеличить путем обработки клеток индукторами окислительного стресса, такими, как tBHQ.
Гибридный промотор ARE-hTERT повышает эффективность суицидальной генной терапии рака in vitro при использовании схемы фермент-пролекарство
Повышенная активность гибридного промотора ARE-hTERT в клетках NCI-H1299, Calu-1 и A549, наблюдаемая в люциферазном тесте, указывает на то, что введение ARE может улучшить свойства векторов для генной терапии рака. Чтобы получить прямой
А 0.035
□ -tBHQ
+tBHQ
ш
о
m га О. <и -fr и 2 с
<
0,035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
□ -tBHQ
□ +tBHQ
ARE-hTERT-Luc hTERT-Luc Luc
ARE-hTERT-Luc hTERT-Luc
Luc
-tBHQ +tBHQ
Ш
о
Id
m га
.
ш -fr ZS 2 с
и
0
1 m s н
X <
-tBHQ +tBHQ
ARE-hTERT-Luc hTERT-Luc
Luc
ARE-hTERT-Luc hTERT-Luc
Luc
Рис. 1. Влияние модификации промотора hTERT с помощью последовательности ARE на активность репортерного гена люциферазы в клеточных линиях рака легкого. Активность репортерного гена люциферазы измеряли в клеточных линиях NCI-H1299 (А), Calu-1 (Б), A549 (В) и NCI-H358 (Г), трансфицированных плазмидами phTERT-Luc (hTERT-Luc), pARE-hTERT-Luc (ARE-hTERT-Luc) и плазмидой без промотора pGL3-Basic (Luc) вместе с плаз-мидой pRL-CMV для нормирования. Если указано (заштрихованные столбцы), клетки обрабатывали tBHQ в концентрации 100 мкМ в течение 24 ч. Данные показаны как средние значения ОЕЛ ± СО
Б
В
Г
ответ на этот вопрос, сравнили гибель опухолевых клеток, экспрессирующих терапевтический трансген под контролем промотора hTERT или ARE-hTERT, в схеме суицидальной генной терапии фермент-про-лекарство ЦД : УФРТ-5ФЦ [20]. Как и ожидалось, экспрессия ЦД : УФРТ под контролем промотора
ARE-hTERT приводила к более выраженной гибели клеток Са1и-1, А549 и N^-^299 в присутствии 5ФЦ в той же концентрации по сравнению с экспрессией под контролем промотора hTERT (рис. 2А-В). При этом в клетках N^-^58 экспрессия ЦД : УФРТ под контролем ARE-hTERT лишь
Л
I ARE-hTERT □ hTERT □ mock - пустой
вектор
Й
£
à
10 50 200 500
5ФЦ, мкМ
ARE-hTERT hTERT mock - пустой вектор
Ь_rit
50 200 500 1000
5ФЦ, мкМ
120
%00
.о
в
60
о в
с е
т s с
о
s £
о в т с е
т s с
о
^
ARE-hTERT hTERT mock - пустой вектор
80 -
40 -
20 -
Г 140
120
ок, ето
с
к
50 200 500 1000
5ФЦ, мкМ
ARE-hTERT hTERT mock - пустой
вектор
80
60
40
20
0 50 200 500 1000 5ФЦ, мкМ
Рис. 2. Сравнение цитотоксического эффекта экспрессии ЦД : УФРТ под контролем промоторов hTERT и ARE-hTERT в присутствии 5ФЦ в клеточных линиях рака легкого. Показано относительное количество живых клеток NCI-H1299 (A), Calu-1 (Б), A549 (В) и NCI-H358 (Г), трансфицированных плазмидами pARE-hTERT-CD : UPRT (заштрихованные столбцы), phTERT-CD : UPRT (пустые столбцы) и пустым вектором pBK-CMV (mock, столбцы с точками), после инкубации с 5ФЦ в указанных концентрациях. Данные показаны как среднее значение (±СО) количества живых клеток относительно количества живых клеток, трансфицированных теми же плазмидами, но инкубированных без 5ФЦ
Б
В
незначительно влияла на уровень цитотоксичности по сравнению с экспрессией под контролем промотора hTERT (рис. 2Г), что согласуется с результатами люциферазного теста. Обработка клеток NCI-H358 индуктором окислительного стресса tBHQ суще-
ственно усиливала цитотоксический эффект лишь при использовании промотора ARE-hTERT (рис. 3). Обработка клеток NCI-H1299, Calu-1 и A549 индуктором tBHQ не приводила к усилению цитотоксично-сти в случае использования промотора ARE-hTERT
(данные не показаны), более активного в базальных условиях по сравнению с промотором hTERT (рис. 1).
Экспрессия терапевтического трансгена под контролем промотора ARE-hTERT в схеме суицидальной генной терапии рака фермент-пролекарство более эффективно сенсибилизирует опухолевые клетки к действию химиотерапевтических препаратов Сообщалось о том, что суицидальная генная терапия рака по схеме фермент-пролекарство под контролем ARE увеличивает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам, в частности, к доксорубицину [11]. Поэтому мы исследовали влияние промотора ARE-hTERT на цитотоксичность при суицидальной генной терапии комбинацией фер-мент-пролекарство ЦД : УФРТ-5ФЦ при одновременном использовании химиотерапевтических препаратов. Как видно из рис. 4A, экспрессия ЦД : УФРТ под контролем hTERT не вызывала гибель клеток NCI-H1299 в присутствии 10 мкМ 5ФЦ. Обработка 0.1 мкМ доксорубицина приводила лишь к незначительной гибели клеток NCI-H1299. Важно отметить, что в тех же условиях использование промотора ARE-hTERT приводило к значительной гибели клеток (~40%), которая существенно потенциирова-лась при одновременной обработке доксорубицином (рис. 4A). Сходные данные получены для клеток A549 и Calu-1, обработанных доксорубицином, это-позидом или цисплатином (рис. 4Б и данные не показаны). Важно отметить, что в использованных нами условиях генная терапия с применением промотора hTERT не оказывала эффекта, и не потенциировала действие химиотерапевтических препаратов. Тогда как модификация промотора с помощью ARE позволяла индуцировать выраженный цитотоксический эффект как в случае монотерапии, так и при комбинации с химиотерапевтическими препаратами.
ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе мы проверили гипотезу о том, что введение ARE в опухолеспецифический промотор, используемый для экспрессии трансгена в злокачественных клетках, может усилить активность промотора без существенного снижения опухолеспе-цифичности. Действительно, ранее было показано, что комбинация ARE и неселективного минимального промотора способна обеспечивать опухолеспецифи-ческую экспрессию трансгена благодаря аберрантно активированному транскрипционному фактору Nrf2 [14-19] или вследствие присущего опухолевым клеткам высокого уровня АФК [11, 12]. Нами показано, что активность гибридного промотора, включающего промотор гена TERT человека и ARE из промотора
140
120
*
О н
Ф Ц
X
*
.0 m X
X
О сп н
и ф
X X
с
О
100
80 -
60 40 20 0
+ - +
0 мкМ
. +
tBHQ
200 мкМ 5ФЦ
Рис. 3. В клетках N0^358 цитотоксический эффект от экспрессии ЦД : УФРТ под контролем промотора ARE-hTERT в присутствии 5ФЦ усиливается индуктором окислительного стресса. Клетки N0^358 трансфици-ровали плазмидами pARE-hTERT-CD : UPRT (заштрихованные столбцы) и phTERT-CD : UPRT (пустые столбцы) и определяли количество живых клеток после инкубации в отсутствие или в присутствии 200 мкМ 5ФЦ и/или 100 мкМ tBHQ, как указано. Данные показаны как среднее значение (±СО) количества живых клеток относительно количества живых клеток в образцах, обработанных сходным образом, но инкубированных в отсутствие 5ФЦ
гена GCLM человека, была выше в трех из четырех клеточных линий рака легкого человека как при измерении активности репортерного гена люцифе-разы, так и в схеме суицидальной генной терапии фермент-пролекарство ЦД : УФРТ-5ФЦ in vitro. Модификация промотора hTERT с помощью ARE не влияла на его активность в клетках NCI-H358, что указывает на отсутствие аномальной регуляции Nrf2. Однако активность гибридного промотора в клетках NCI-H358 может стимулироваться индукторами окислительного стресса, такими, как tBHQ.
Важно отметить, что активность гибридного промотора ARE-hTERT не повышалась в первичных клетках эпителия бронхов человека HBEpC, что указывает на отсутствие влияния ARE на опухолеспеци-фичность транскрипции.
Л 120
100
к,
о т е л к х ы в и ж
о в т с е ч и л о К
80
60
40
20
Б
il
Is
щ
I
ARE-hTERT hTERT ï
+ +
к,
о т е л к
и ж
о в т с е ч и л о К
5ФЦ Докс
100
80
60
40
20
5ФЦ Это
Рис. 4. Сравнение цитотоксического эффекта экспрессии ЦД : УФРТ под контролем промоторов hTERT и ARE-hTERT в присутствии комбинации 5ФЦ и химиотерапевтических препаратов в клеточных линиях рака легкого. Клетки N0^1299 (А) и А549 (Б) трансфицировали плазмидами pARE-hTERT-CD : UPRT (заштрихованные столбцы) и phTERT-CD : UPRT (пустые столбцы) и инкубировали в отсутствие или в присутствии 10 мкМ 5ФЦ и 0.1 мкМ доксорубицина (Докс) (А) или 500 мкМ 5ФЦ и 2 мкМ этопозида (Это) (Б). Данные показаны как среднее значение (±СО) количества живых клеток относительно количества живых клеток в образцах, обработанных сходным образом, но инкубированных в отсутствие 5ФЦ и химиотерапевтических препаратов
Наши результаты показывают, что в существенной доле опухолей с активацией Nrf2 вследствие соматических мутаций гибридный промотор будет более активен, нежели обычный hTERT-промотор, при этом будет сохраняться высокая опухолеспеци-фичность экспрессии. Кроме того, опухолевые клетки в целом характеризуются повышенным уровнем АФК как in vitro, так и in vivo, что вызвано рядом факторов, таких, как изменение метаболизма и недостаточное кровоснабжение [21]. При этом многие химиотерапевтические препараты вызывают окислительный стресс, поэтому комбинация генной терапии с использованием промотора ARE-hTERT и химиотерапевтических препаратов in vivo способна еще больше увеличивать общую эффективность лечения за счет усиления экспрессии терапевтического трансгена.
Эффективность генной терапии рака определяется, прежде всего, уровнем экспрессии терапевтического трансгена, который должен быть достаточен для достижения требуемого эффекта. В данной рабо-
те мы использовали подход, основанный на системе фермент-пролекарство ЦД : УФРТ-5ФЦ, в котором общая эффективность терапии определяется эффективностью доставки плазмид в опухолевые клетки, активностью промотора и чувствительностью клеток к цитотоксическому веществу, которое образуется после конверсии пролекарства. Очевидно, эти параметры будут варьировать в различных типах клеток, потенциально приводя к снижению эффективности лечения. Действительно, схема генной терапии с экспрессией трансгена под контролем промотора hTERT не приводила к существенной гибели опухолевых клеток, и не наблюдалось потенциирования действия химиотерапевтических препаратов (рис. 4). Однако в тех же самых условиях генная терапия под контролем промотора ARE-hTERT вызывала цитотоксиче-ский эффект и существенно потенциировала цитоток-сический эффект химиотерапевтических препаратов. Эти результаты показывают явные преимущества нового гибридного промотора ARE-hTERT в схемах генной терапии перед промотором hTERT.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами создан новый гибридный промотор, который сохраняет опухолеспецифичность базального промотора hTERT, но характеризуется повышенной транскрипционной активностью в опухолевых клетках, обусловленной или аномальной активацией транскрипционного фактора Nrf2, или повышением уровня АФК. Эти свойства позволяют рассматривать гибридный промотор ARE-hTERT как лучшую альтернативу промотору hTERT при использовании
в схемах генной терапии. Кроме того, комбинацию ARE-элементов с другими опухоле- или тканеспе-цифичными промоторами, используемыми для создания генно-терапевтических векторов, можно рассматривать как способ усиления их действия без существенной потери опухолеспецифичности. •
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-04-40173.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shepelev M.V., Korobko E.V., Georgiev G.P., Sverdlov E.D., Korobko I.V. // Cancer Gene Ther. 2011. V. 18. № 9. Р. 682-684.
2. Korobko I.V. // Curr. Cancer Ther. Rev. 2014. V. 10. № 3. Р. 271-276.
3. Gu J., Fang B. // Cancer Biol. Ther. 2003. V. 2. № 4. Suppl. 1. P. S64-70.
4. Horikawa I., Cable P.L., Afshari C., Barret J.C. // Cancer Res. 1999. V. 59. № 4. P. 826-830.
5. Takakura M., Kyo S., Kanaya N., Hirano H., Takeda J., Yut-sudo M., Inoue M. // Cancer Res. 1999. V. 59. № 3. P. 551-557.
6. Horikawa I., Barrett J.C. // Carcinogenesis. 2003. V. 24. № 7. P. 1167-1176.
7. Poole J.C., Andrews L.G., Tollefsbol T.O. // Gene. 2001. V. 269. № 1-2. P. 1-12.
8. Wirth T., Zender L., Schulte B., Mundt B., Plentz R., Rudolph K.L., Manns M., Kubicka S., Kühnel F. // Cancer Res. 2003.
V. 63. № 12. P. 3181-3188.
9. Davis J.J., Wang L., Dong F., Zhang L., Guo W., Teraishi F., Xu K., Ji L., Fang B. // Cancer Gene Ther. 2006. V. 13. № 7. P. 720-723.
10. Shepelev M.V., Kopantzev E.P., Vinogradova T.V., Sverdlov E.D., Korobko I.V. // Oncol. Lett. 2016. V. 12. № 2. P. 1204-1210.
11. Leinonen H.M., Ruotsalainen A.K., Määttä A.M., Laitinen H.M., Kuosmanen S.M., Kansanen E., Pikkarainen J.T., Lappalainen J.P., Samaranayake H., Lesch H.P., et al. // Cancer Res. 2012. V. 72. № 3. P. 6227-6235.
12. Hurttila H., Koponen J.K., Kansanen E., Jyrkkanen H.K., Kivela A., Kylatie R., Yla-Herttuala S., Levonen A.L. // Gene Ther. 2008. V. 15. № 18. P. 1271-1279.
13. Kuzmin D.V., Vinogradova T.V., Kopantzev E.P., Sverdlov E.D. // Open Gene Ther. J. 2010. V. 3. P. 31-39.
14. Hayes J.D., McMahon M. // Trends Biochem. Sci. 2009. V. 34. № 4. P. 176-188.
15. Kim Y.R., Oh J.E., Kim M.S., Kang M.R., Park S.W., Han J.Y., Eom H.S., Yoo N.J., Lee S.H. // J. Pathol. 2010. V. 220. № 4. P. 446-451.
16. Konstantinopoulos P.A., Spentzos D., Fountzilas E., Fran-coeur N., Sanisetty S., Grammatikos A.P., Hecht J.L., Cannis-tra S.A. // Cancer Res. 2011. V. 71. № 15. P. 5081-5089.
17. Seng S., Avraham H.K., Birrane G., Jiang S., Li H., Katz G., Bass C.E., Zagozdzon R., Avraham S. // Oncogene. 2009. V. 28. № 3. P. 378-389.
18. Zhang P., Singh A., Yegnasubramanian S., Esopi D., Kombai-raju P., Bodas M., Wu H., Bova S.G., Biswal S. // Mol. Cancer Ther. 2010. V. 9. № 2. P. 336-346.
19. Cairns R.A., Harris I.S., Mak T.W. // Nat. Rev. Cancer. 2011. V. 11. № 2. P. 85-95.
20. Adachi Y., Tamiya T., Ichikawa T., Terada K., Ono Y., Matsu-moto K., Furuta T., Hamada H., Ohmoto T. // Hum. Gene Ther. 2000. V. 11. № 1. P. 77-89.
21. Brown N.S., Bicknell R. // Breast Cancer Res. 2001. V. 3. № 5. P. 323-327.
