CC BY
38
Гинекология
Новые возможности верификации злокачественных опухолей яичника
А.Э. Протасова, Р.В. Орлова, Г.А. Раскин
Кафедра онкологии МАПО; медицинский факультет Государственного университета; Городской клинический онкологический диспансер, Санкт-Петербург
Контакты: Анна Эдуардовна Протасова [email protected]
При асцитных формах рака яичника на проанализированных 72 случаях показана возможность достоверно верифицировать диагноз с помощью метода жидкостной цитологии и иммуноцитохимического исследования. Эффективной панелью для диагностики аденокарцином яичника c асцитом можно считать следующую: Ber-EP4, калретинин — с целью дифференциальной диагностики опухоли с реактивными изменениями и эстрогеновые рецепторы, WT-1, ОТ7 — для уточнения типа аденокарциномы (в случаепозитивной реакции на Ber-EP4). Верификация муцинозного типа аденокарциномы в настоящее время затруднена вследствие негативной реакции на органоспецифические маркеры.
Ключевые слова: жидкостная цитология, иммуноцитохимическое исследование, асцит, рак яичника
New verification possibilities for ovarian malignancies
A.E. Protasova, R.V. Orlova, G.A. Raskin
Department of Oncology, Moscow Academy of Postgraduate Education; Medical Faculty, State University;
City Clinical Oncology Dispensary, Saint Petersburg
The fact that the diagnosis can be significantly verified using the liquid-based cytology technique and immunocytochemical assa y is shown in analyzed 72 cases with the ascites forms of ovarian cancer. The effective panel to diagnose ovarian adenocarcinomas with asc ites may be considered as follows: Ber-EP4, calretinin for the differential diagnosis of the tumor with reactive changes, as well as estrog en receptors, WT-1, CK7for the clarification of the type of adenocarcinoma (in case of a positive reaction to Ber-EP4). Verification of the mucinous form of adenocarcinoma is now made difficult by a negative reaction to organ-specific markers.
Key words: liquid-based cytology, immunocytochemical assay, ascites, ovarian cancer
Введение
Рак яичника (РЯ) относится к группе основных онкогинекологических заболеваний. В мире высокая заболеваемость РЯ регистрируется в северных регионах Канады (19,9 случая), Австрии (15,1) и Дании (14,1) на 100 тыс. женского населения. Заболеваемость в России составляет 10,2 случая на 100 тыс. женщин, однако за последние годы прирост заболеваемости РЯ увеличился на 13,6 %. В Санкт-Петербурге, начиная с 1990 г. показатель заболеваемости РЯ находился на уровне 11,2—12,9 и возрос на 15,2 %. Средний возраст больных РЯ — 63 года, частота заболеваемости с возрастом повышается [1—4].
Среди причин смерти женского населения в мире РЯ занимает 5-е место. Показатель смертности от РЯ в Европе составляет 12, в США — 7,9 случая на 100 тыс. женского населения. В России в период с 1990 по 2009 г. стандартизованные показатели смертности от РЯ не снизились и составили 7,4—7,9 случая на 100 тыс. населения [2, 3, 5]. Пятилетняя выживаемость пациенток с диагнозом РЯ в мире, Европе, России и Санкт-Петербурге составляет 30—36,5 %. Таким образом, для РЯ характерны тенденция роста показателей заболевае-
мости, высокая смертность и низкие показатели выживаемости [1, 4, 6, 7].
На ранних этапах развития РЯ какая-либо симптоматика обычно отсутствует, а клинические симптомы заболевания возникают лишь при поздних стадиях развития патологического процесса (болевой синдром, нарушение функции соседних органов, чувство дискомфорта в животе, симптомы интоксикации и астениза-ции, увеличение объема живота), поэтому ранняя диагностика РЯ — скорее исключение, чем правило. До 2/3 случаев РЯ выявляются на поздних стадиях заболевания по причине скрытого его течения, короткого периода удвоения опухоли, агрессивности опухолевого процесса и универсального характера метастазирования, а также в связи с тем, что жалобы больных нередко бывают неопределенными [4, 7, 8].
К основным методам диагностики и дифференциальной диагностики РЯ в настоящее время относят ректовагинальное исследование, трансвагинальную эхографию, определение и мониторинг СА-125 в сочетании с НЕ4 и диагностическую лапароскопию, проводимую с целью морфологической верификации диагноза (чувствительность этого метода — 100 %) [4, 5, 8].
С учетом особенностей клинической картины РЯ первые клинические признаки заболевания часто связаны с симптомами серозита — выпотом жидкости в брюшной (асцит) полости. Пациентки впервые обращаются к врачу с жалобами на резкое увеличение объема живота и снижение диуреза. Ургентный характер симптоматики требует скорейшей верификации диагноза и выбора правильной лечебной тактики.
Для решения вопроса о начале противоопухолевого лечения больных РЯ необходим основной этап диагностики — морфологическая верификация диагноза. В случаях когда выполнение биопсии первичного опухолевого очага невозможно, а заболевание сопровождается асцитом, ранее использовался метод цитологического исследования выпотной жидкости, который по рутинно выполняемой методике определяет лишь наличие или отсутствие атипических клеток в пунктате и является субъективным.
Современным методом комплексной оценки выпотных жидкостей для подтверждения или исключения злокачественного опухолевого процесса, определения органоспецифической принадлежности опухолевых клеток в жидкости является метод жидкостной цитологии с последующим проведением иммуноцитохими-ческого исследования. Для исследования используется нативный материал, что делает антигены более доступными для взаимодействия с моноклональными антителами. Одно из первых упоминаний о диагностическом иммуноцитохимическом исследовании относится к 1975 г., когда для анализа лимфомы Беркитта с помощью метода прямой иммунофлуоресценции были применены анти-^М-антитела [9].
Одной из проблем в цитологии выпотных жидкостей является достоверное отличие реактивного мезо-телия от опухолевых кл еток. Достоверно отличить опухолевые эпителиальные клетки от мезотелиальных позволяет следующая панель антител: В72.3, МОС-31 и Вег-ЕР4 [10]. Необходимо отметить, что CDX-2 не экспрессируется в клетках асцитической жидкости неопухолевого происхождения [11]. Другие авторы использовали для дифференциальной диагностики МОС-31, D2-40 и калретинин, причем первый является эпителиальным антигеном, а остальные два — мезотелиальными. По данным ряда авторов, достоверность и эффективность применения данных антител приближалась к 100 % [12—14].
После уточнения злокачественной природы выпота возникает следующая задача — определение органоспецифичности опухолевых клеток. Проведение иммуноцитохимического исследования с антителами против МиС5ас и WT-1 целесообразно в дифференциальной диагностике РЯ и рака поджелудочной железы [15]. Описаны случаи эндометриальной стро-мальной саркомы низкой степени злокачественности с диссеминацией по брюшине и асцитом, когда имму-
ноцитохимическое исследование на CD10 помогало верифицировать диагноз [16]. Таким образом, в литературе имеются разрозненные сообщения о решении ряда конкретных диагностических задач с помощью исследования выпотных жидкостей и последующего иммуноцитохимического исследования, отсутствует и системный подход к диагностике, который существует в иммуногистохимии.
Цель исследования — оценка возможности использования метода жидкостной цитологии и иммуноци-тохимического исследования в диагностике асцитных форм РЯ.
Материалы и методы
Проанализировано 72 асцитических жидкости и 10 мазков — отпечатков брюшной полости и дугласова пространства, полученных от 72 больных с диагностированным РЯ. У всех пациенток по результатам предварительно проведенного ультразвукового исследования визуализированы новообразования в области придатков матки, признаки асцита (различной степени выраженности) и установлен диагноз «подозрение на новообразование яичника».
Асцитическая жидкость была получена методом пункции брюшной полости через задний свод влагалища. Пункцию осуществляли после опорожнения прямой кишки и мочевого пузыря по стандартной методике. Полученный экссудат направляли на цитологическое и иммуноцитохимическое исследования.
Во всех случаях асцитическую жидкость центрифугировали с образованием осадка, который в дальнейшем обрабатывался на цитоцентрифуге Cytospin 4. Полученные мазки окрашивались гематоксилин-эозином, по Романовскому—Гимзе и по Папаниколау. Оценивали цитологическую картину, клеточную концентрацию в жидкости, после чего выбирали нужное количество осадка для образования одного мазка при помощи Су^рт 4. Формировалось число мазков, соответствующее количеству используемых антител. Мазки в виде пятен диаметром 7—8 мм высушивали на воздухе и фиксировали в холодном ацетоне в течение 10 мин, после чего они смачивались в трис-бу фере с твином (ВюОрйса) и обводились парафиновым карандашом. На первом этапе проводили подавление эндогенной пероксидазы при помощи 3 % перекиси водорода в течение 20 мин. Все последующие этапы исследования осуществлялись во влажной бане при температуре 28 °С. Первые антитела инкубировали в течение 60 мин (см. таблицу).
Для визуализации реакции антиген—антитело применялась полимерная система детекции икга^юп компании LabVisюn, в качестве хромогена использовали диаминобензидин. После каждого из этапов до окрашивания диаминобензидином стекла с мазками промывали в трис-буфере с твином рН 7,1. Ядра окра-
Гинекология
Гинекология
Характеристика использованных антител
шивались при помощи гематоксилина Майера, стекла заключались в среду ВюМаиМ.
Результаты и обсуждение
Из проанализированных 72 случаев в 24 наблюдениях при диагностированном РЯ в асцитической жидкости раковых клеток не выявлено (негативная реакция на Вег-ЕР4), а в 48 — они были обнаруже ны (позитивная реакция на Вег-ЕР4). При проведении дальнейшей диагностики оказалось, что в 12 случаях аденокарцинома яичника была муцинозной, и данные опухоли имели следующий иммунофенотип: ВегЕР4+,
СК7+, WT-1-, отрицательные эстрогеновые рецепторы. В 22 наблюдениях верифицирована серозная аденокарцинома яичника, характеризовавшаяся следующим иммунофенотипом: позитивная реакция на ВегЕР4, СК7, WT-1, эстрогеновые рецепторы. В 2 из 48 случаев эстрогеновые рецепторы продемонстрировали отрицательную реакцию. В 12 наблюдениях аденокарцинома яичника не была уточнена.
При проведении цитологических исследований мазков — отпечатков с брюшины опухолевые клетки не были выявлены ни разу. Отсутствие возможности проведения иммуноцитохимического исследования ставит под сомнение эффективность использования данного метода.
Таким образом, эффективная панель для диагностики аденокарцином яичника в выпотных жидкостях выглядит следующим образом: Вег-ЕР4, калретинин — с целью дифференциальной диагностики опухоли с реактивными изменениями и эстрогеновые рецепторы, WT-1, СК7 — для уточнения типа аденокарциномы, верификации локализации в яичнике (в случае позитивной реакции на Вег-ЕР4).
Выводы
Цитологическое и иммуноцитохимическое исследования асцитической жидкости больных с подозрением на новообразование яичника, выполненные на основе жидкостной цитологии, позволяют достоверно верифицировать диагноз «аденокарцинома». Верификация муцинозного типа аденокарциномы в настоящее время затруднена вследствие негативной реакции на органоспецифические маркеры.
№ Название АТ* Клон Характеристика АТ Разведение
1 Ber-EP4 Ber-EP4 Мышиные, моноклональные RTU
2 Calretinin DAK-Calret 1 Мышиные, моноклональные RTU
З Estrogen receptor SP1 Кроличьи, моноклональные 1:100
4 Wilm’s Tumor Protein (WT1) 6F-H2 Мышиные, моноклональные 1:10
5 Cytokeratin 7 Кроличьи, поликлональные 1:200
*АТ — антитело.
1. Мерабишвили В.М., Щербук ЮА. Онкологическая служба в Санкт-Петербурге и районах города в 2009 году (заболеваемость, смертность, выживаемость). СПб., 2010.
2. Чиссов В.И., Старинский В.В.,
Петрова Г. В. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). М., 2011.
3. American Cancer Society. Cancer Prevention & Early Detection Facts & Figures 2007. Atlanta: American Cancer Society, 2007.
4. Wenham R.M. Ovarian cancer: a bright future. Cancer Control 2011;18:4-5.
5. Pavlidis N., Hansen H., Stahel R.
ESMO Clinical Practice Guidelines: development, implementation and dissemination. Ann Oncol 2010;21:7-8.
6. De Angelis R., Francisci S., Baili P. et al. The EUROCARE-4 database on cancer survival in Europe: data standardisation, quality control and methods of statistical analysis. Eur J Cancer 2009;45:909-30.
ЛИТЕРАТУРА
7. Chabner B.A., Lynch T.J., Longo D.L. Harrison's manual of oncology. NY: McGraw-Hill Medical, 2011; p. 517—З8.
8. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б.,
Ивашина С.В. и др. Ранняя диагностика рака эндометрия и яичников.
Практ онкол 2009;10(2):71—5.
9. Binder R.A., Jencks J.A., Chun B.,
Rath C.E. "B" cell origin of malignant cells in a case of American Burkitt's lymphoma. Characterization of cells from a pleural effusion. Cancer 1975;Зб(1):1б1—8.
10. Lin O. Challenges in the interpretation
of peritoneal cytologic specimens. Arch Pathol Lab Med 2009;ЗЗ:7З9-42.
11. Kobayashi M., Ueyama Y., Nakanishi H. et al. Immunocytochemical detection using CDX2. Cancer Cytopathol 200б;108:114—8.
12. Davidson B., Risberg B., Kristensen G. et al. Detection of cancer cells in effusions from patients diagnosed with gynaecological malignancies. Evaluation of five epithelial
markers. Virchow Arch 1999;
435:43-9.
13. Kim J.H., Kim G.E., Choi Y.D. et al. Immunocytochemical panel for distinguishing between adenocarcinomas and reactive mesothelial cells in effusion cell blocks.
Diagn Cytopathol 2009;37:258-61.
14. Politi E., Kandaraki C., Apostolopoulou C. et al. Immunocytochemical panel for distinguishing between carcinoma and reactive mesothelial cells in body cavity fluids. Diagn Cytopathol 2005;32:151-5.
15. Han L., Pansare V., Al-Abbadi M. et al. Combination of MUC5ac and WT-1 immunohistochemistry is useful in distinguishing pancreatic ductal carcinoma from ovarian serous carcinoma in effusion cytology. Diagn Cytopathol 2009;37(5):321—4.
16. Lim B.J., Choi S.Y., Kang D.Y., Suh K.S. Peritoneal washing cytology of disseminated low grade endometrial stromal sarcoma: a case report. Acta Cytol 2009;53(5):587—90.
8б
