CC BY
109
Т. Е. Морозова, И. Г. Зенкевич
НОВЫЕ ВАРИАНТЫ МЕТОДА СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАМФОРЫ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ
Введение. Среди методов количественного газохроматографического анализа метод стандартной добавки является единственным, который можно применять для определения суммарного содержания компонентов гетерофазных систем путём анализа только одной из фаз, а также для определения аналитов в сложных матрицах [1].
В аналитической практике сложные матрицы встречаются довольно часто, в том числе в составе некоторых фармацевтических препаратов, суспензий, эмульсий и различных мазей. До настоящего времени анализ таких образцов оставался сложной задачей, поскольку их прямое дозирование в хроматографические колонки невозможно, а любые попытки экстракции целевых аналитов различными растворителями сопровождаются их огромными потерями. Подобные сложные образцы, особенно если их матрицы обладают сорбционными свойствами, на стадии пробоподготовки рекомендуют искусственно превращать в гетерофазные системы, в которых анализируемые компоненты распределены в соответствии с их коэффициентами распределения между фазами. При этом для анализа выбирают тот слой, в котором содержание мешающих веществ минимально [2], что часто требуется для количественного определения компонентов фармпрепаратов.
Один из наиболее известных вариантов метода стандартной добавки, предназначенный для определения суммарного количества аналитов в образцах, основан на соотношении (см. [3])
А/Г _ тДО&.
Ег - 1’
Р2 1
(1)
где Мх — масса определяемого компонента; тдоб. — масса добавки; Р\ и Р2 — площади пиков определяемого компонента до и после добавки соответственно.
Для дополнительного контроля точности количественного определения используют метод последовательных стандартных добавок с последующей экстраполяцией результатов на нулевую стандартную добавку (см. [1, 4, 5]):
Мхг = Ер7д°б1Л, (2)
Рг
где Мхі — масса определяемого компонента; тдоб/і — суммарное количество стандартной добавки на і-й стадии; Р\ и Рі — площади пиков определяемого компонента до и после і-й добавки соответственно.
В работе [4] было показано, что для некоторых образцов, матрицы которых обладают сорбционными свойствами, экстраполяцию результатов можно проводить не только на нулевую, но и на бесконечно большую стандартную добавку. Подобные модификации метода стандартной добавки позволяют выявить возможные искажения результатов анализа, так как при экстраполяции результатов на нулевую или бесконечно большую добавку исключаются погрешности определения за счёт изменения коэффициентов распределения анализируемых компонентов между двумя фазами гетерофазной системы.
© Т. Е. Морозова, И. Г. Зенкевич, 2011
Метод последовательных стандартных добавок использовали для определения таких труднолетучих веществ, как, например, алкалоиды в экстрактах растений [6] или пестициды в сельскохозяйственных продуктах [7]. Этот же способ можно рекомендовать и для определения компонентов лекарственных препаратов.
К преимуществам метода стандартной добавки, как обсуждалось в работе [5], следует отнести и то, что при выполнении газохроматографического анализа на приборах устаревших моделей его точность оказывается наибольшей. Это связано с тем фактом, что при оптимальных величинах добавок содержание определяемых компонентов в пробах варьирует не более чем в 2-3 раза, и даже сильно выраженные эффекты сорбции аналитов в хроматографических системах сказываются на результатах в незначительной степени. Такие эффекты сорбции можно классифицировать как недостаточную инертность хроматографических систем, поэтому проверка оборудования на соответствие этому критерию должна быть неотъемлемой частью любого анализа. Основной недостаток этого метода заключается в необходимости хроматографических измерений минимум дважды: до и после введения добавок, что может заметно увеличить время анализа.
Представляемая работа посвящена обсуждению особенностей применения различных модификаций метода стандартной добавки (при контроле инертности хроматографической системы) для количественного определения камфоры в некоторых фармацевтических препаратах, матрицы которых различаются по реологическим и сорбционным свойствам.
Экспериментальная часть.
Контроль инертности хроматографических систем. Приготовление тест-образцов (№ 1, 2, 3, 4) для контроля инертности хроматографических систем. В качестве тест-веществ для контроля инертности хроматографических систем были использованы 2,3-бутандиол, втор.-бутилтолуол и 1-гептанол. Некоторые важнейшие свойства этих соединений на стандартных неполярных полидиметилсилоксановых неподвижных фазах приведены в табл. 1.
Таблица 1
Физико-химические и хроматографические свойства тест-соединений
Компонент Мол. масса Мол. формула Ткип., С df RI ± sri
2,3-бутандиол 90 С4Н10О2 181 1,05 782 ± 25
втор.-бутилтолуол 148 CuHie 198 0,86 1081 ± 10
1-гептанол 116 CVHieO 176 0,82 953 ±13
Образец № 1 готовили, смешивая исследуемые соединения в соотношении 1:1:1 по объёму. Образцы № 2, 3 и 4 готовили, разбавляя образец № 1 хлористым метиленом в 10, 100 и 1000 раз соответственно. Объём дозы 2 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл).
Приготовление тест-образца камфоры для контроля инертности хроматографической системы при выполнении конкретного анализа. Для приготовления модельного образца № 1 добавляли 11,9 мг камфоры и 10 мг н-тридекана (внутренний стандарт) в 10 мл смеси воды и этилового спирта, затем экстрагировали 1 мл хлористого метилена. Отбирали и дозировали нижний слой, объём дозы 1 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Образцы № 2, 3 и 4 готовили, разбавляя образец № 1 в 2, 4 и 8 раз соответственно. Модельные образцы с использованием хлороформа в качестве
растворителя готовили аналогичным образом. Масса камфоры составляла 90 мг, масса тридекана — 20 мг.
Приготовление смесей для анализа Оригинального Большого Бальзама Биттнера (производство РФ по лицензии). Для проверки возможностей метода стандартной добавки при анализе фармацевтических препаратов были выбраны две серии Оригинального Большого Бальзама Биттнера, содержащего 95 мг камфоры на 100 мл препарата [8]. Образцы для определения содержания камфоры готовили, добавляя 1 мл хлористого метилена к 10 мл бальзама. Полученную смесь центрифугировли в течение
1 мин. Дозировали нижний слой. Объём проб — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Образцы с использованием хлороформа готовили аналогичным способом. В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.
Приготовление смесей для анализа камфорной мази (производство РФ). В состав камфорной мази (Р № ЛС-000249) входит: 10 % камфоры, 54 % вазелина, 8 % парафина нефтяного твёрдого, 28 % ланолина безводного. Подготовка проб включала растворение точных навесок образцов мази (около 0,4 г) в смеси 1 мл гексана и 1 мл ацетонитрила. Дозировали нижний ацетонитрильный слой. Объём дозы — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.
Приготовление смесей для анализа мази BENGAY (производство США). В состав мази BENGAY входит: 4 % камфоры, 10 % ментола, 30 % метилсалицилата, состав гидрофобной матрицы не указан. Подготовка проб включала растворение точных навесок образцов мази (около 0,4 г) в смеси 1 мл гексана и 1 мл ацетонитрила. Дозировали нижний ацетонитрильный слой. Объём дозы — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.
Внутренний стандарт (н-тридекан) во все образцы добавляли непосредственно в исходные образцы до подготовки проб.
Газохроматографический анализ проводили на хроматографе «Цвет-500М» с пламенно-ионизационным детектором и стеклянной насадочной колонкой размерами 3 м х х 2 мм с 5 % SE-30 на хроматоне N (0,16-0,20 мм) в изотермических условиях при температуре 140 °С. Температура детектора и испарителя составляли 180 и 200 °С соответственно. Газ-носитель — азот, объёмная скорость — 10 мл/мин. Объём дозируемых проб — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Обработку хроматограмм проводили с использованием программно-аппаратного комплекса «Мультихром» (Ampersend, Москва, версия 15). Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программное обеспечение Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2003) и ORIGIN 8.0. Число параллельных определений площадей пиков целевых компонентов при анализе каждого из образцов составляло не менее 5. Для оценки погрешностей полученных результатов в случае трёхкратной стандартной добавки использовали метод наименьших квадратов, а в случае двойной добавки — средние значения погрешностей найденных содержаний камфоры для первой и второй добавок.
Результаты и их обсуждение.
Контроль инертности хроматографической системы. Одной из важных стадий количественного анализа, особенно при использовании приборов устаревших моделей, является проверка инертности хроматографических систем. Суть подхода,
предложенного в работе [10], заключается в сравнении результатов анализа смеси нескольких тест-веществ без растворителя и в виде серии растворов в инертных растворителях в том же соотношении, но с последовательно уменьшающимися концентрациями. В качестве компонентов тест-смеси были выбраны 2,3-бутандиол, втор.-бутил-толуол и 1-гептанол, соединения с различной полярностью, имеющие различное число активных атомов водорода в составе гидроксильных групп. Некоторые из них были использованы ранее как компоненты так называемых Grob Test Mixtures (2,3-бутандиол) [9], а другие (втор.-бутилтолуол и 1-гептанол) выбраны впервые в данной работе. Согласно работе [9] критерием принятия гипотезы об инертности на заданном уровне концентраций компонентов является выполнение неравенства
Е № - si)2 < \/(ЕА6’?У + (Е ASî)2’ (з)
где Sf и Sy — относительные площади пиков тест-соединений предыдущей и последующей серии разбавлений; AS* и ASy — их стандартные отклонения.
В табл. 2 представлены результаты анализа тест-образцов для контроля инертности хроматографической системы.
Таблица 2
Результаты анализа тест-образцов для контроля инертности используемой
хроматографической системы
Компонент Соотношение компонентов Относительные площади пиков ± стандартные отклонения, %
2,3-бутандиол 1 • 1 • 1 20,5 ±0,2
1-гептанол 30,2 ±0,1
втор.-бутилтолуол (смесь без растворителя) 49,2 ±0,2
2,3-бутандиол 19,5 ±0,8
1-гептанол Разбавление в 10 раз 30,2 ±0,2
втор.-бутилтолуол 50,3 ±1,0
2,3-бутандиол 14,1 ±1,2
1-гептанол Разбавление в 100 раз 31,4 ±0,3
втор.-бутилтолуол 54,5 ±1,4
2,3-бутандиол 7,0 ±1,7
1-гептанол Разбавление в 1000 раз 33,0 ±1,5
втор.-бутилтолуол 60,0 ±1,2
Из данных табл. 2 следует, что при разбавлении смеси тест-веществ в 10 раз относительные площади компонентов, включая наиболее полярный 2,3-бутандиол, изменяются незначительно. Однако при разбавлении исходного образца в 100 раз они уменьшаются с 20,5 ± 0,2 % до 14,1 ± 1,2 %, а при разбавлении в 1000 раз — уже до 7,0 ± 1,7 %. Следовательно, границей инертности используемой хроматографической системы по 2,3-бутандиолу оказывается диапазон разбавлений между 1 : 10 и 1 : 100, что при дозе
2 мкл соответствует абсолютным количествам этого диола приблизительно от 76 до 8 мкг в пробе.
Аналогичную проверку целесообразно проводить непосредственно для анализируемых соединений, в данном случае камфоры. В табл. 3 представлены результаты такого тестирования.
Таблица 3
Результаты анализа смеси камфора/н-тридекан для контроля инертности используемой хроматографической системы
Компонент Соотношение компонентов Относительные площади пиков ± стандартные отклонения, %
Камфора 1:1 88,7 ± 1,1
м-тридекан (исходный раствор) 11,3 ± 1,1
Камфора Разбавление в 2 раза 88,7 ±0,8
м-тридекан 11,3 ± 0,8
Камфора Разбавление в 4 раза 87,3 ±0,9
м-тридекан 12,7 ± 0,9
Из данных табл. 3 следует, что относительные площади пиков камфоры при разбавлении исходной пробы в 4 раза изменяются статистически незначимо, следовательно, хроматографическую систему в данном диапазоне концентраций по выбранному компоненту можно считать инертной. Так как при введении стандартных добавок концентрация определяемого вещества увеличивается, проводить в дальнейшем серии разбавлений не требуется. Таким образом, тестирование системы по определяемому веществу — камфоре — показало, что результаты количественного газохроматографического анализа модифицированным методом стандартной добавки не искажены эффектами сорбции аналитов.
Аппроксимация результатов на нулевую стандартную добавку. Как уже
было отмечено выше, при использовании метода последовательных стандартных добавок возможны два вида аппроксимации результатов анализа: на бесконечно большую [4] и нулевую [1, 7] стандартные добавки. Эти процедуры позволяют скомпенсировать вероятные изменения коэффициентов распределения определяемых компонентов между фазами. Данные табл. 4 иллюстрируют экстраполяцию результатов определения содержания камфоры в камфорной мази на нулевую величину добавки.
Как видно, с увеличением числа добавок (суммарной массы добавки) количество определяемого компонента в пробе уменьшается приблизительно в 2 раза. Это связано с тем, что введение добавки в образец изменяет её свойства. В связи с этим необходимо экстраполировать полученные значения на нулевую величину добавки, моделируя систему, не искажённую её введением. Рисунок иллюстрирует такую экстраполяцию.
Таблица 4
Экстраполяция результатов анализа на нулевую стандартную добавку на примере определения содержания камфоры в камфорной мази
Характеристика содержания камфоры в исходном образце Масса камфоры, мг
Указано (по составу мази) 90
Найдено после первой добавки (масса добавки 27 мг) 76 ± 17
Найдено после второй добавки (масса добавки 28 мг) 50 ±7
Найдено после третьей добавки (масса добавки 30 мг) 47 ±6
Найдено после экстраполяции результатов на нулевую добавку 86 ± 12
Из данных табл. 4 и графика на рисунке можно сделать вывод о том, что применение экстраполяции результатов анализа на нулевую добавку значительно повышает точность анализа по сравнению с методом однократной стандартной добавки.
20-
3 10 210
10 20 30 40 50
Масса добавки, мг
60
70
80
90
Экстраполяция результатов количественного определения содержания камфоры на нулевую стандартную добавку: параметры регрессионного уравнения М = атдоб. + Ь, а = —0,50 ± 0,24, Ь = 86 ± 12, К = 0,86
0
Определение камфоры в фармацевтических препаратах. Ещё одним источником ошибок как метода стандартной добавки, так и последовательных стандартных добавок является непостоянство объёма дозируемых проб. Для компенсации этих ошибок в ходе подготовки проб в образцы обычно рекомендуют вводить внутренний стандарт, количество которого в процессе анализа остаётся постоянным. При этом все абсолютные значения площадей пиков заменяют относительными. В этом случае формула (2) должна быть модифицирована следующим образом:
ЛТ _ "52 тдоб./і
” “ Р/Рр„ і Рі/Рр„Л
где Мхі — масса определяемого компонента; тдоб/і — суммарное количество стандартной добавки на г-й стадии; Рі и Рі — абсолютные площади пиков определяемого компонента до и после г-й добавки соответственно; Рреп.і и Рреп.і — абсолютные площади внутреннего стандарта до и после введения добавки соответственно.
Результаты анализа некоторых фармпрепаратов с использованием метода стандартной добавки в двух вариантах (I и II) представлены в табл. 5 и 6.
I. С использованием абсолютных площадей пиков при расчёте количества определяемого компонента в пробе по формуле (2) и экстраполяцией на нулевую величину добавки.
II. С использованием относительных площадей пиков определяемого компонента и внутреннего стандарта по формуле (4) и экстраполяцией на нулевую величину добавки.
При анализе мази BENGAY активные компоненты препарата (камфору, ментол и метилсалицилат) на насадочной колонке разделить не удалось, поэтому определяли их суммарное содержание с использованием добавки только камфоры. Результаты
(4)
1
анализа этой мази лучше всего соответствуют заданному количеству активных компонентов. Погрешности результатов для двух вариантов определений (I и II) составляют —0,2 и —0,6 % соответственно, что иллюстрирует высокую точность метода. Смоделировать образец мази не представлялось возможным, поскольку состав гидрофобной матрицы не указан.
Таблица 5
Результаты количественного определения содержания камфоры в некоторых фармацевтических препаратах методом I
Препарат Указанное количество камфоры в образце Найденное количество камфоры в том же количестве образца (отн. погрешность, %)
Камфорная мазь 2,50 г/25 г 2,36 ±0,32 г (-5,6)
Оригинальный Большой Бальзам Биттнера 9,5 мг/10 мл Экстрагент СНСІз 5,4 ± 0,04 мг (-48) Экстрагент СНСІз 4,1 ± 0,2 мг (-57)
Мазь ВЕ^АУ 0,160 г*/0,6677 г 0,1597 ±0,037 г (-0,2)
* Суммарное содержание камфоры, ментола и метилсалицилата в неразделенном хроматографическом пике.
Таблица 6
Результаты количественного определения камфоры в некоторых фармацевтических препаратах методом II
Препарат Указанное количество камфоры в образце Найденное количество камфоры в том же количестве образца (отн. погрешность, %)
Камфорная мазь 2,50 г/25 г 2,42 ±0,17 г (-3,2)
Оригинальный Большой Бальзам Биттнера 9,5 мг/10 мл Экстрагент СНСІз 6,5 ±0,1 мг (-32) Экстрагент СНСІз 5,6 ± 0,3 мг (-43)
Мазь ВЕ^АУ 0,139* г/0,316 г 0,1381 ±0,021 г (-0,6)
* Суммарное содержание камфоры, ментола и метилсалицилата в неразделенном хроматографическом пике.
Менее точные совпадения результатов с указанными были получены при анализе камфорной мази (производство РФ). Причиной этого может являться летучесть камфоры. При сравнении погрешностей определения содержания камфоры двумя вариантами метода последовательных стандартных добавок (—5,6 % для варианта I и —3,2 % для варианта II) можно сделать вывод о том, что точность второго варианта выше.
Анализ Оригинального Большого Бальзама Биттнера, в отличие от остальных препаратов, проводили с использованием двух экстрагентов. Результаты определения содержания камфоры в случае хлороформа следует считать более надёжными, чем в случае хлористого метилена, так как применение более низкокипящего растворителя приводит к его испарению и, как следствие, занижению результатов анализа и увеличению систематической погрешности определений. При сравнении данных табл. 5 и 6 для Оригинального Большого Бальзама Биттнера (экстрагент СНС1з) можно говорить о более высокой точности варианта с введением в пробу внутреннего стандарта (—48 % и —32 %). Найденное содержание камфоры при анализе Бальзама значительно отличается от указанного (практически на 30 %), что, вероятно, связано с летучестью этого соединения или/и с нарушениями технологического процесса приготовления препарата.
Применение при анализе различных модификаций метода последовательных стандартных добавок позволило сделать вывод о высокой точности каждого из них. Использование нескольких добавок определяемого аналита в гетерофазную систему с последующей экстраполяцией результатов на нулевую величину, а также разработка модификации метода последовательных стандартных добавок с введением внутреннего стандарта являются объединением трёх процедур, ранее известных по отдельности [1, 4, 10]. Такая совокупность приёмов позволяет повысить точность определения по сравнению с методом однократной стандартной добавки, что показано на примере анализа некоторых фармацевтических препаратов.
Литература
1. Зенкевич И. Г., Климова И. О. Применение метода стандартной добавки для количественного хроматографического анализа // Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 10. С. 10481054.
2. Зенкевич И. Г., Рагозина Т. Н. Количественный газохроматографический анализ компонентов гетерофазных систем методом двойной стандартной добавки // Журн. прикл. химии. 1998. Т. 71. № 5. С. 763-767.
3. Новак Й. Количественный анализ методом газовой хроматографии / пер. с англ. М., 1978. 180 с.
4. Зенкевич И. Г., Морозова Т. Е. Особенности метода стандартной добавки для количественного определения аналитов в сложных матрицах, обладающих сорбционными свойствами // Аналитика и контроль. 2010. Т. 14. № 3. С. 164-171.
5. Макаров Е. Д., Зенкевич И. Г. Сравнение модифицированных методов двойного внутреннего стандарта и стандартной добавки для количественного газохроматографического анализа компонентов гетерогенных смесей // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2007. Вып. 2. С. 80-87.
6. Grubner O., First M. W., Huber G. L. Gas chromatographic determination of nicotine in gases and liquids with suppression of adsorption effects // Anal. Chem. 1980. Vol. 52. N 11. Р. 1755-1758.
7. Остроухова О. К., Зенкевич И. Г. Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для количественного хроматографического определения пестицидов в растительных объектах // Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 5. С. 481-491.
8. URL: http://www.reles.rU/cat/tradefm/0riginal%20Great%20Bittner%20Balsam/1/ (дата обращения: апрель 2011 г.)
9. Зенкевич И. Г., Макаров Е. Д., Макаров А. А., Климова И. О. Способ и критерии контроля инертности газохроматографических систем // Аналитика и контроль. 2006. Т. 10. № 2. С. 175-183.
10. Зенкевич И. Г., Макаров Е. Д., Макаров А. А. и др. Особенности эксплуатации хроматографов устаревших моделей. Характеристика инертности хроматографических систем // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2007. Вып. 1. С. 91-101.
Статья поступила в редакцию 17 мая 2011 г.
