CC BY
79
УДК 543.544
Е. Д. Макаров, И. Г. Зенкевич
Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 2
СРАВНЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДОВ ДВОЙНОГО ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА И СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ
ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КОМПОНЕНТОВ ГЕТЕРОГЕННЫХ СМЕСЕЙ
В газовой хроматографии для количественного анализа в основном используют методы абсолютной градуировки, внутренней нормализации и внутреннего стандарта [1].
Метод абсолютной градуировки основан на раздельном дозировании в хроматограф определенных количеств анализируемой пробы и образца сравнения с последующим сопоставлением площадей хроматографических пиков. Различают несколько его модификаций [2]: метод прямого сравнения и метод калибровочной кривой,
При использовании метода прямого сравнения хроматограммы, получаемые при вводе анализируемой пробы и образца, интерпретируются непосредственно из соотношения
с-ФЛ
где Р., Р; - измеряемые параметры хроматографических пиков определяемого соединения в анализируемом образце и образце сравнения.
Метод калибровочной кривой (абсолютной градуировки) заключается в построении графической зависимости количественных параметров хроматографического пика (обычно площади или высоты) от содержания компонента в пробе.
В методе внутренней нормализации проводят отнесение измеренного количества параметра хроматографического пика (площади, высоты или произведения высот на времена удерживания) к суммарному отклику на все компоненты пробы, присутствующие в анализируемом образце. Традиционный вариант внутренней нормализации предусматривает измерение количественных параметров всех зарегистрированных пиков, приведение их к единой шкале чувствительности детектирования и суммирование полученных значений.
В «классическом» варианте метод внутреннего стандарта предусматривает добавление к известному количеству анализируемого образца известного количества не содержащегося в нем эталонного соединения («внутреннего стандарта») и последующее хроматографирование приготовленной смеси. Его вариантом является метод стандартной добавки, в котором в качестве стандарта используют соединение, уже присутствующее в анализируемой смеси. Такой способ анализа применяют в случае, когда выбор вещества-стандарта затруднен. Для проведения количественного анализа методом стандартной добавки в одинаковых условиях проводят две серии определений: исходной анализируемой смеси и образца с добавленным к нему известным количеством одного из компонентов (стандартной добавки).
Точность результата, получаемого методом стандартной добавки, можно повысить, если к нескольким одинаковым навескам анализируемой смеси прибавить известные (контролируемые по массе или объему) последовательно увеличиваемые количества определяемого компонента (так называемый метод последовательных стандартных добавок или метод экстраполяции на нулевую величину добавки). По результатам анализа каждой из приготовленных таким образом смесей можно построить график в координатах площадь или высота (ось ординат) пика - масса или объем стандартной добавки (ось абцисс). Экстраполяция полученной зависимости до ее пересечения с продолжением оси абцисс позволяет оценить начальное содержание интересующего соединения в анализируемой смеси [3, с. 361].
© Е. Д. Макаров, И. Г. Зенкевич, 2006
Другим интересным вариантом метода внутреннего стандарта является впервые предложенный М. С. Вигдергаузом метод двойного внутреннего стандарта [4, 5], заключающийся в том, что в анализируемый образец вносят два стандартных вещества, элюирующихся до и после определяемого соединения. Использование двух стандартов для получения информации о содержании в образце целевого компонента приводит к заметному повышению воспроизводимости и правильности результатов анализа. Основными преимуществами этого варианта количественного анализа являются компенсация случайных погрешностей [4] и возможность не учитывать небольшие различия в численных значениях градуировочных множителей, если стандарты и определяемые компоненты имеют близкие химическую природу и молекулярные массы. Последнее существенно упрощает выполнение анализа.
Все вышеупомянутые методы и модификации количественного анализа в хроматографии рекомендовано использовать в основном для однофазных образцов. Причем часто целевые аналиты определяют не в исходном образце, а в подготовленных для анализа пробах, т. е. после проведения стадии пробоподготовки.
В то же время хорошо известно, что любые процедуры пробоподготовки сопровождаются неизбежными потерями аналитов, которые приводят к занижению данных анализа. По-видимому, полностью устранить такие потери в ходе подготовки проб невозможно, но их можно уменьшить на стадии обработки результатов анализа. Компенсировать потери определяемого соединения на стадиях пробоподготовки можно введением стандартов в исходные образцы. Из всех методов количественного хроматографического анализа в этом случае могут быть использованы только два: внутреннего стандарта и стандартной добавки [6].
Ранее в работе [7] было показано, что для анализа гетерогенных систем может быть успешно применен модифицированный метод стандартной добавки, в котором образец сравнения вносят в анализируемый образец до стадии подготовки пробы.
В аналитической практике гетерогенные образцы встречаются весьма часто, например, в виде суспензий и эмульсий, а также смесей, дополнительно содержащих компоненты, которые обладают сорбционными свойствами. Непосредственное дозирование таких образцов в хроматографические колонки нежелательно, так как приводит к искажениям результатов. При анализе подобных образцов на стадии пробоподготовки рекомендуют трансформацию исходных образцов в гетерофазные системы [6,7], в которых анализируемые соединения распределены в соответствии с коэффициентами распределения, а мешающие компоненты матрицы сосредоточены преимущественно в одном из слоев. При этом анализируют наиболее подходящий слой полученных гетерофазных систем.
Цель данной работы - сравнение возможностей модифицированного метода двойного внутреннего стандарта и метода последовательных стандартных добавок для количественного анализа 4-трет-бутилтолуола в модельных гетерогенных системах.
Экспериментальная часть. Газохроматографический анализ проводили на хроматографе «Цвет-100» с пламенно-ионизационным детектором, укомплектованном программно-аппаратным комплексом «Мультихром» (производства ЗАО «Амперсанд», версия 1.7). Для разделения компонентов использовали насадочную стеклянную колонку (2 м х 3 мм); неподвижная фаза -10 масс. % Тритон Х-305 на Хроматоне N-AW (0,20-0,25 мм). Газом-носителем служил азот, расход - 30 мл/мин. Расходы водорода и воздуха составляли 30 и 300 мл/мин соответственно. Анализ осуществляли при температуре термостата колонок 120 °С; температура испарителя -250 °С. Рабочие шкалы электрометра (БИД-36): 108—109 Ом. Объем дозируемых проб - 0,5-1 мкл (микрошприц МШ-1).
Для приготовления основного модельного образца М (матрицы) использовали масло смазочное бытовое (ТУ 6-15-691-77) - 89,75 масс. %, графитированную сажу (лабораторный обра-
зец ВНИИ Люминофоров, г. Ставрополь, 1978 г.) - 4,05 масс. %, в качестве определяемого анали-та был выбран 4-трет-бутилтолуол (ТБТ) - 6,80 масс. %.
Подготовка проб в случае использования модифицированного метода двойного внутреннего стандарта включала добавление к основному модельному образцу (М) двух точных навесок внутренних стандартов п-цимола (ПЦМ) и изопропилмезитилена (ЙПМ). После добавки полученную гетерогенную смесь растворяли в 2 мл ацетонитрила, интенсивно встряхивали (использовали пенициллиновый флакон на 10 см3 с закрытой крышкой) и выдерживали до расслаивания 20-30 мин. После расслаивания дозировали (пробу отбирали непосредственно из флакона) верхний ацетонитрильный слой.
При применении метода последовательных стандартных добавок к основному модельному образцу добавляли в качестве «реперного» компонента точную навеску ИПМ. После к полученной пробе прибавляли 2 мл ацетонитрила, интенсивно встряхивали и выдерживали до расслаивания. Затем дозировали в хроматограф ацетонитрильный слой. После того в ацетонитрильный слой с помощью микрошприца на 100 мкл последовательно добавляли 50, 100 и 100 мкл ТБТ, ацетонитрильный слой после каждой добавки дозировали в хроматограф по 5-8 раз.
Результаты и их обсуждение. Особенность количественного анализа гетерогенных образцов связана с невозможностью в подобных случаях прямого газохроматографического анализа определяемых соединений, а также со значительными потерями ана-литов на стадиях пробоподготовки, которые можно компенсировать, как уже отмечалось, введением стандартов в исходные образцы, применяя только два метода количественного хроматографического анализа: внутреннего стандарта и стандартной добавки.
Использование метода внутреннего стандарта. Метод внутреннего стандарта в традиционном варианте предполагает прибавление к известному количеству анализируемого образца известного количества не содержащегося в нем образца сравнения и последующее хроматографирование полученной смеси.
Содержание компонентов в анализируемой смеси С. (% по массе, объему или мо-лярности) находят по формуле [8, с. 216]
Р/я С = 1' * • 100,
где Р., Рд - измеряемые параметры хроматографических пиков определяемого и стандартного соединений; /. - градуировочный множитель для определяемого соединения по отношению к веществу-стандарту; qcм - количества стандартного вещества и анализируемого образца.
Если подготовленную пробу перед хроматографированием разбавляют инертным растворителем, то его количество не должно сказываться на результатах и в расчетной формуле не учитывается. Иногда удобнее разбавлять растворителем порции анализируемой смеси и стандартного соединения по отдельности и смешивать аликвоты приготовленных растворов. В этом случае необходимо учитывать количество растворителя с тем, чтобы ввести в расчетную формулу коэффициенты, отражающие различную степень разбавления подлежащей анализу пробы и образца сравнения.
Преимущество метода внутреннего стандарта состоит в том, что при его использовании сводятся к минимуму погрешности в результатах, вызванные случайными изменениями основных параметров хроматографического опыта (температуры колонки, состава и скорости подвижной фазы, режима работы детектора), поскольку возможные отклонения от заданных условий должны сходным образом влиять на количественные параметры хроматографических пиков как стандартного, так и определяемого соединения. Кроме того, не нужно знать абсолютное количество вводимой пробы.
Условия хроматографирования должны обеспечивать полное разделение пиков анализируемого и стандартного соединений, все остальные компоненты смеси могут не отделяться друг от друга или даже вообще не проявляться на хроматограмме (в этом заключается преимущество данного метода по сравнению с методом внутренней нормализации).
К главным ограничениям метода относятся:
1) необходимость специальной подготовки пробы для анализа;
2) выбор внутреннего стандарта. На этой стадии руководствуются следующими требованиями:
а) стандартное вещество должно полностью смешиваться с компонентами анализируемой смеси и в химическом отношении должно быть инертным и к компонентам, и к использованным подвижным и неподвижным фазам. Желательно выбирать стандартное вещество из числа соединений, близких к объектам анализа по структуре и молекулярной массе;
б) концентрацию эталонного вещества в анализируемой смеси следует подбирать таким образом, чтобы отношение площадей пиков стандарта и анализируемого компонента было близким к единице;
в) в принятых условиях анализа пик стандартного вещества должен располагаться на хроматограмме в непосредственной близости от пиков анализируемых соединений, не накладываясь ни на них, ни на пики других веществ. Если в задачу анализа входит определение содержания в пробе двух или более компонентов, значительно различающихся по временам удерживания, целесообразно использовать два или более внутренних стандартов (при этом каждый образец сравнения используется для расчета концентрации ближайших к нему компонентов смеси).
Важно, чтобы стандарт не содержал примесей, пики которых накладываются на пики определяемых соединений. Потому предварительно в тех же условиях контролируют содержание в стандарте нежелательных примесей.
Если выбор вещества-стандарта с учетом перечисленных выше требований затруднен, в качестве стандарта возможно применение присутствующих в анализируемой смеси соединений. Такой вариант называется методом стандартной добавки. В этом случае получают две серии хроматограмм: исходной анализируемой смеси и смеси с известным содержанием одного из компонентов, выбранного как стандарт. Содержание целевых компонентов (в %) и образца сравнения (в %) рассчитывают по формулам [3, с. 360]
С.-----------------------------. 100
С =------------------------------ -100,
где <7Я, <7 - количества отобранной для анализа порции смеси и введенного стандарта; Р , Рд(1), Р.(2), Ря(2) - количественные параметры пиков целевого или реперного соединения и вещества-стандарта на хроматограммах первой и второй серии соответственно.
При использовании в качестве стандартной добавки определяемого соединения необходимость в получении градуировочных множителей отпадает.
Модифицированный метод двойного внутреннего стандарта. Модификация классического метода внутреннего стандарта была предложена в 1986 г. М. С. Вигдерга-
узом для анализа сложных многокомпонентных смесей [4]. Она предполагает добавление к анализируемой смеси не одного, а двух (а в общем случае и более) стандартов, элюирующихся соответственно до и после определяемого компонента. При этом все требования, предъявляемые к вводимым образцам сравнения в классическом варианте, сохраняются. Кроме того, рекомендуется подбирать образцы сравнения таким образом, чтобы их пики были максимально приближены к пику анализируемого компонента или по возможности равноотстояли от него (в противном случае определяющим оказывается влияние ближайшего стандарта). Содержание определяемого компонента в пробе вычисляют по формуле
где ^й(2) ~ количества введенных стандартов; Р., J° , Р - количественные параметры пиков целевого соединения и веществ-стандартов соответственно.
Как указывают авторы [4], использование этой модификации метода внутреннего стандарта позволяет не определять градуировочные коэффициенты, если в качестве стандартов выбраны соединения со схожей структурой (например, гомологи); его применение приводит к значительному уменьшению случайной составляющей погрешности (почти на порядок) и увеличению воспроизводимости результатов. Но позднее было показано [9], что случайная составляющая погрешности определений в методе двойного внутреннего стандарта может быть выше, чем в его обычном варианте, а это обусловлено измерением параметров большего числа хроматографических пиков. Данный способ преимущественно компенсирует не случайные, а систематические составляющие погрешности определений, что имеет важное значение для расширения возможностей его применения.
В настоящее время возможности метода двойного внутреннего стандарта фактически остаются нереализованными, несмотря на то, что на его основе можно предложить эффективный способ компенсации потерь анализируемых соединений. Для этого в качестве стандартов должны быть выбраны не просто произвольные соединения с «близкой молекулярной структурой», а предыдущий и последующий гомологи определяемых соединений, отличающиеся от аналита на один углеродный атом. Тогда потери аналитов и стандартов подчиняются общим для гомологических рядов закономерностям [10], которые позволяют компенсировать их на стадии обработки результатов. Оказалось, что в качестве внутренних стандартов могут быть успешно выбраны не только ближайшие гомологи, но и близкие по свойствам соединения одного класса (в данной работе для анализа ТБТ были выбраны ПЦМ и ИПМ), которые также отличаются от определяемого компонента на один углеродный атом.
Таким образом, введение стандартов в исходные образцы допускают только два метода количественного анализа: внутреннего стандарта и стандартной добавки (включая и его экстраполяционный вариант последовательных добавок). Для сравнения их возможностей по критериям точности результатов и суммарных затрат времени нами в качестве объекта анализа был выбран 4-/?г/?е/?г-6утилтолуол, содержащийся в смеси смазочного масла и графитированной сажи. Выбор такой сложной гетерогенной системы был не случаен: сходные по составу смеси используют при оценке моющей способности стиральных порошков [11].
(1)
Прямой газохроматографический анализ данного образца был невозможен, потому для извлечения целевого аналита проводили жидкостную экстракцию ацетонитрилом. В качестве вариантов количественного анализа применительно для этого образца были выбраны модифицированный метод двойного внутреннего стандарта и метод последовательных стандартных добавок (метод стандартных добавок, экстраполированных на нулевую величину).
Для расчета концентрации ТБТ по методу двойного внутреннего стандарта использовали формулу (1), градуировочные множители приравнивали к единице (поскольку стандарты и анализируемое соединение относятся к одному классу алкиларенов и имеют близкие свойства). Полученные результаты представлены в табл. 1. Достигаемая точность определений (среднее относительное стандартное отклонение) составляет ±3,4%, что позволяет классифицировать такой метод как надежный.
Таблица 1. Результаты количественного определения содержания 4-трет-бутилтолуола в модельном образце с использованием модифицированного метода двойного внутреннего стандарта
Масса образца mt, г Масса стандартов, г ПЦМ ТБТ ИПМ Масса ТБТ, г Относительная погрешность, 5 С‘, %
ПЦМ ИПМ Площади пиков, мВ'С Найдено, С, Задано,
0,6766 0,0485 0,0402 484 486 411 0,0481 0,0460 +4,6
477 480 416 0,0476 0,0460 +3,5
552 545 459 0,0478 0,0460 +3,9
527 514 431 0,0476 0,0460 +3,5
448 462 425 0,0468 0,0460 + 17
Среднее значение Ся±АС’ 0,0476 ± 0,0004 +3,4
*8С=(Сх- Сс)/С0400%.
** ДС ~ Ь 8 / л1/2, где ДС - доверительный интервал; £пц - коэффициент Стьюдента; 5с - стандартное отклонение; п - число параллельных измерений.
Концентрации 4-гарега-бутилтолуола по методу последовательных добавок рассчитывали, используя данные зависимости от Утбт по соотношению
^ТБТ= (Поб • ^твт А)/(^0в /S2 - StbtA)- (2)
В (2) VTBT, Удоб - объем ТБТ и добавки соответственно (в мкл), 5ТБТ - площадь пика ТБТ на хроматограмме без добавки, 5(, S2 - площадь пика ИПМ для образца без добавки и с ней соответственно; 5доб - площадь пика ТБТ на хроматограмме с добавкой.
Для компенсации ошибок, связанных с непостоянством объема дозируемой пробы, в анализируемый образец до проведения процедуры пробоподготовки был введен дополнительный реперный компонент - ИПМ.
Результаты определений содержания ТБТ для каждой из стандартных добавок приведены в табл. 2. Экстраполяцию стандартных добавок на нулевую величину иллюстрирует рисунок.
Параметры регрессионного уравнения УТБТ = а^ао6 + Ь, где УТБТ - определяемое количество аналита при массе стандартной добавки Удоб, равны: а = -0, 076 ± 0,011, b = 161,1 ± 1,9; г = -0,989; 50 = 1,6. Значение коэффициента b соответствует величине
Таблица 2. Результаты количественного определения содержания ТБТ в модельном образце с использованием метода последовательных стандартных добавок
7П,, Г Задано, ТБТ, мкл Объем добавки, ИМП, мкл Общий объем добавки ТБТ, мкл ТБТ ИПМ Соотношение площадей, ‘^тбт/'^'имп Найдено ТБТ*, мкл
Площади пиков 5, мВ-с
0,6766 153,5 100 0 1070,4 649,6 1,65
1171,4 700,1 1,67 -
828,5 506,9 1,63 -
995,7 583,9 1,71 -
1148,6 695,2 1,65 -
Среднее 1,66
0,6766 153,5 100 50 1565,0 722,8 2,17 165,4
1022,0 471,0 2,17 163,9
7353,4 3272,0 2,25 142,2
9713,4 4416,0 2,20 154,8
11925 5511,0 2,16 165,8
Среднее 2,19 156,6
0,6766 153,5 100 150 11537 3541 3,26 156,3
23056 7018 3,29 153,7
20624 6071 3,40 143,8
20637 6396 3,23 159,5
18426 5404 3,41 142,8
Среднее 3,32 150,9
0,6766 153,5 100 250 16155 3495 4,62 140,4
18989 3726 5,10 121,1
11431 2483 4,60 141,3
11295 2422 4,66 138,5
18198 4204 4,33 155,9
Среднее 4,66 141,3
*Для расчета использовали формулу (1).
О 50 100 150 200 250 у мкл
доб’
Зависимость между последовательно увеличиваемым содержанием стандартной добавки модельного компонента (Кдо6) и его определяемым количеством (УТБТ).
Vtbt(O)- Таким образом, абсолютная ошибка определения этим способом составляет +7,6 мкл, относительная - +5,0%.
Коэффициент а регрессионного уравнения мал, но тем не менее статистически значимо отличается от нуля. Это подтверждает зависимость результатов определений от величины добавки образца сравнения, что и следовало ожидать для проб, содержащих обладающие сорбционными свойствами компоненты.
Таким образом, сравнение результатов количественного определения двумя способами позволяет заключить, что использование как модифицированного метода двойного внутреннего стандарта, так и метода последовательных стандартных добавок обеспечивает хорошую точность для установления содержания модельного компонента в гетерогенной системе (величины относительных погрешностей не превышают 5%). Однако общее время анализа при применении метода последовательных стандартных добавок примерно в 5 раз выше, чем при методе двойного внутреннего стандарта. Именно этот факт заставляет отдать предпочтение первому
Работа выполнена при финансовой поддержке программы президента РФ (грант № МК-1316.2005.3).
Summary
Makarov Е. D., Zenkevich I. G. Comparison of the modified methods of a double internal standard and standard addition for quantitation of components in heterogeneous systems.
Two methods of quantitative gas chromatographic analysis are compared on the example of the determination of tert-butyltoluene in a complex heterogeneous matrix, containing components with sorption properties. It is established that modified both method of a double internal standard and standard addition provide comparable precision of the results, but the second one seems like much more time-consuming.
Литература
1. Арутюнов Ю. И., Гришин А. П. // Зав. лаборатория. 1972. Т. 28, № 12. С. 1441-1443. 2. Новак Й. Количественный анализ методом газовой хроматографии / Пер. с англ.; Под ред. К. И. Сакодынского. М., 1978. 3. Столяров Б. В., Савинов И. М., Витенберг А. Г. и др. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб., 1998. 4. Вигдергауз М. С., Краузе И, М.// Журн. аналит. химии. 1986. Т. 41, № 11, С. 2064-2074. 5. Краузе И. М. // Хроматографический анализ углеводородов и их производных: Межвуз. сб. Куйбышев, 1985. С. 126-130. 6. Зенкевич И. Г., Рагозина Т. Н. // Журн. прикл. химии. 1998. Т. 41, № 5. С. 763-768. 7. Зенкевич И. Г., Климова И. О. //Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61, № 10. С. 1048-1054. 8. Гольберт К А., Вигдергауз М. С. Курс газовой хроматографии. М., 1974. 9. Мариничев А. Н., Турбович М. Л., Зенкевич И. Г. Физикохимические расчеты на микро-ЭВМ: Справочник. JL, 1990. 10. Zenkevich I. G., Makarov Е. D.// J. Chromatogr. А. 2007 (Available online 25 September 2006. http://www.sciencedirect.com/). 11. Официальный сайт «Издательского дома Экстра-Н» (http://www.extra-n.ru/main/?id=753).
Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.
